专利名称：免疫杀手细胞及其制造方法,包含其的医药组成物及套组的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫杀手细胞(immune killer)的制造方法，尤其涉及一种将免疫杀手细胞应用于抑制肿瘤的医药组成物。
背景技术：
目前有关以免疫疗法治疗癌症的研究，包括注射细胞因子(cytokine)，例如干扰素(interferon)或白介素(interleukin)，以直接刺激免疫力、提升抗癌效果。但由于这些细胞因子本身的副作用过大，例如，包括干扰素和白介素在内的一些常用细胞因子，都会引发类似感冒的症状，包括发烧、发冷、疲倦和消化道问题，血压亦会受其影响。其中白介素-2(interleUkin-2，简称IL-2)所引发的副作用通常较严重，在治疗过程中，医师需格外仔细观察患者。因此注射细胞因子虽曾为癌症治疗带来了一线曙光，但已逐渐被认为不完全可行。除此之外，目前仍在试验当中的免疫疗法包括癌症疫苗疗法，此法也有可能改善免疫力，但由于癌症病人的免疫系统多已受到抑制，效果仍然有待讨论。目前免疫疗法中较快速、较有效的，应属免疫细胞(immune cell)医疗技术。所谓免疫细胞医疗技术，就是抽取病人的白血球进行培养，大量增殖淋巴激素活化杀手细胞(lymphokine activate killer cell，简称LAK细胞)、杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，简称CTL细胞)或自然杀手细胞(natural killer cell，简称NK细胞)后，再将其输注回患者体内以产生抗癌功效。由于体内具有毒杀癌细胞能力的细胞，例如NK细胞及CTL细胞(LAK细胞则非体内正常的族群，它是将CTL细胞在体外利用高浓度的细胞因子培养后大量繁殖的细胞)， 在一般人体内的CTL细胞及NK细胞数量有限或活性受抑制，因此长期以来即有免疫学家试着在体外以细胞因子大量培养这些细胞后，再打入病人体内，直接提高病人的抗癌活性。这方法的优点是效果迅速、不会有排斥现象(因细胞取自于病人本身)，且由于注射前须先去除细胞因子，因此，也不致产生细胞因子的副作用。此法最重要的关键是要能够增殖足够的细胞并给予适当的活化，如此才能发挥充分的抗癌效果。此方法过去较无大量的临床应用， 主要就是一直无法突破大量增殖的瓶颈，或所增殖的细胞活性不够高之故。目前对于免疫细胞的体外培养方法，在培养过程中，往往因为必须使用动物来源的抗体蛋白作为刺激物，容易造成人畜共通疾病的传染等副作用，危及病患的生命健康。例如，中国发明专利ZL 20031019565. 5号，使用植物血球凝集素(phytohemagglutinin，简称 PHA)及抗CD3单株抗体(anti-CD3monoclonal antibody，简称抗CD3mAb) 二种有丝分裂原联合活化细胞，增强对细胞的刺激强度，进而提高细胞的体外增殖能力。然而，其使用的抗 CD3mAb，来源大多来自实验老鼠，且老鼠与人类的基因非常接近，难保无人畜(鼠)共通疾病的病源菌污染的可能，而容易造成危害人体生命的不良后果。
发明内容
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本发明的主要目的是提供一种免疫杀手细胞的制造方法，其特征为于包含刀豆球蛋白(concanavalin Α)的培养基中，进行该免疫杀手细胞的诱导、维持或扩大培养的步骤， 而不需使用任何抗体蛋白。上述的方法，其中该培养基中进一步包含白介素、干扰素或植物血球凝集素 (phytohemagglutinin)。上述的方法，其中该培养基中不包含任何抗体蛋白作为刺激物。上述的方法，其中该刀豆球蛋白于培养基中的浓度为0. 1 100yg/mL，较佳为 0. 1 30μ g/mL。上述的方法，其中进一步包含分离周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cell)的步骤。上述的方法，其中该周边血液单核细胞于培养基中的浓度为0. IXlO6 IOXlO6 个/mL。本发明的另一目的是提供一种免疫杀手细胞，其由上述的方法所制造。上述的免疫杀手细胞，其包含自然杀手细胞、自然杀手T细胞(natural killer T cell，简称NKT细胞)、gamma/delta T细胞(γ δΤ cell，简称γ δ T细胞)及杀伤性T 细胞(cytotoxic T cell，简称 Tc 细胞或 CTL)。上述的免疫杀手细胞，其组成比例为5 20%的自然杀手细胞、15 50%的自然杀手T细胞、10 30%的gamma/delta T细胞及40 70%的杀伤性T细胞。本发明的另一目的是提供一种抑制肿瘤的医药组成物，其包含有效量的上述的免疫杀手细胞。本发明的另一目的是提供一种套组，其包含上述的医药组成物。更明确地，本发明涉及一种自体免疫杀手细胞的制备方法及其应用，其是从取得的病患血液中，于无菌状态下将周边血液单核细胞(简称PBMC)分离出，用培养基进行培养，该培养基中包含刀豆球蛋白(简称ConA)、白介素-2(简称IL-2)、干扰素-Y (interferon-γ)或植物血球凝集素(简称PHA)。其中并没有使用来自老鼠或其他动物的抗体蛋白作为刺激物，可避免人畜共通疾病感染风险，并且有效增加免疫杀手细胞的数量及活性。本发明若在培养基中添加适量的ConA及IL-2等细胞因子作为刺激物，可以有效促成NK细胞、NKT细胞、Tc细胞及γ δ T细胞等免疫杀手细胞的增殖及活化，且各细胞间的组成比例具有一定的百分比分布时，可达到最好的活性效果。另外，当改变上述刺激物的浓度及比例时，可以调整上述各细胞间的组成比例百分比及增殖数量，以配合不同的应用。
图1为本发明的免疫杀手细胞的培养生长曲线。
具体实施例方式为充分了解本发明的目的、特征及功效，现利用下述具体的实施例，并配合所附的图式，对本发明做详细说明。以下实施例旨在进一步说明本发明的技术内容，并不用以限制本发明的申请专利范围。
1.免疫杀手细胞的细胞培养实验以下为免疫杀手细胞的细胞培养步骤(1)将从周边静脉血中分离抽出的PBMC移入细胞培养瓶中，并以培养基将细胞的浓度调整为0. 5X IO6 2X IO6个/mL，并放置于二氧化碳培养箱中培养。上述的培养基可为RPMI-1640培养基、IMDM培养基、ALys培养基或AIM-V培养基中的任何一种，而且培养基中应含有以下成份刀豆球蛋白0. 1 30 μ g/mL白介素-2 (Proleukin)200 1000IU/mL干扰素-γ600 1500单位人自体血清(Human Auto Serum)5 12%(2)细胞在上述培养基中培养2至6天之后，以培养基或生理食盐水洗涤1 2 次，再以新鲜的培养基将细胞打散并将细胞浓度调整为0. 3 X IO6 2 X IO6个/mL，并放置于二氧化碳培养箱中培养。上述的培养基可为RPMI-1640培养基、IMDM培养基、ALys培养基或AIM-V培养基中的任何一种，而且培养基中应含有以下成份白介素-2(Interleukin_2) 200 600IU/mL干扰素-γ100 300U/mL白介素-1510 50ng/mL(3)以后视细胞生长密度而定，大约每隔2至3天加入新鲜的培养基，并调整细胞的浓度使其介于0. 3X IO6 2X IO6个/mL，最后放置于二氧化碳培养箱中培养。上述的培养基可为RPMI-1640培养基、IMDM培养基、ALys培养基或AIM-V培养基中的任何一种，而且培养基中应含有以下成份白介素-2 (Interleu kin-2) 100 500IU/mL干扰素-γ80 150U/mL白介素-1510 30ng/mL(4)以后每隔2至3天重复上述步骤(3)的操作，直至总共培养14天为止。经过上述方法培养出来的免疫杀手细胞为混合细胞，其中包括NK细胞(具⑶3 阴性、⑶56阳性表型)、NKT细胞(具⑶3阳性及⑶56阳性表型)、Y δ T细胞(具有γ δ 型T细胞受体的T细胞)及Tc细胞(具α β型T细胞受体的典型杀伤性T细胞)，其为免疫系统中活性最强的杀手细胞。利用上述方法培养出来的免疫杀手细胞，由于个体间的差异，各细胞间的组成比例分布会因人而异，但总体而言，绝大多数人的组成百分比如下ΝΚ细胞约占5 20%、 NKT细胞约占15 50%、γ δ T细胞约占10 30%、iTc细胞约占40 70%。图1为本发明的免疫杀手细胞的培养生长曲线，其是从6名自愿者(以图中的6 种颜色表示)的上臂静脉各抽出30c. c.的血液，依上述方法进行处理、培养。培养后每隔1 到3天则从细胞培养液中取样并计算细胞总数，对照培养天数绘制成图。图中纵轴为免疫杀手细胞的数量，横轴为培养天数，由图中数据可知，免疫杀手细胞经培养后其总数明显增加，至第14天时总数已经超过IO9个。2.免疫杀手细胞毒杀癌细胞的实验PBMC经过培养后变成免疫杀手细胞(简称IKC)，其抗肺癌及肝癌的活性大幅增加，如表1所示。其中六个志愿者的免疫杀手细胞及PBMC在E/T = 50时，其毒杀肺癌细胞 (NCI-H23)及肝癌细胞(Hep3B)的活性(Specific release)有显著差异。表1结果为利用 1 4h 51 Cr-release assay表 权利要求
1.一种免疫杀手细胞的制造方法，其特征为于包含刀豆球蛋白的培养基中，进行该免疫杀手细胞的诱导、维持或扩大培养的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该培养基中进一步包含白介素、干扰素或植物血球凝集素。
3.根据权利要求2所述的方法，其中该培养基中不包含抗体蛋白作为刺激物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该刀豆球蛋白于培养基中的浓度为0.1 100μ g/mL0
5.根据权利要求4所述的方法，其中该刀豆球蛋白于培养基中的浓度为0.1 30yg/mLo
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中进一步包含分离周边血液单核细胞的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该周边血液单核细胞于培养基中的浓度为 0. IX IO6 10 X IO6 个/mL。
8.一种免疫杀手细胞，其由根据权利要求1至7中任一项所述的方法所制造。
9.根据权利要求8所述的免疫杀手细胞，其包含自然杀手细胞、自然杀手T细胞、 gamma/delta T细胞及杀伤性T细胞。
10.根据权利要求9所述的免疫杀手细胞，其组成比例为5 20%的自然杀手细胞、 15 50%的自然杀手T细胞、10 30%的gamma/delta T细胞及40 70%的杀伤性T细胞。
11.一种抑制肿瘤的医药组成物，其包含有效量的根据权利要求8至10中任一项所述的免疫杀手细胞。
12.—种套组，其包含根据权利要求11所述的医药组成物。
全文摘要
本发明涉及一种免疫杀手细胞及其制造方法，包含其的医药组成物及套组，其特征为利用包含刀豆球蛋白的培养基中，进行该免疫杀手细胞的诱导、维持或扩大培养的步骤。由于其培养过程当中不使用抗体蛋白作为刺激物，可避免人畜共通疾病的感染风险，且可有效增加免疫杀手细胞的数量及活性。
文档编号A61P35/00GK102212505SQ201010145549
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月8日 优先权日2010年4月8日
发明者张顺浪 申请人:长春藤生命科学股份有限公司