用于抑制疼痛,炎症和软骨退化的溶液及方法

专利名称：用于抑制疼痛,炎症和软骨退化的溶液及方法
技术领域：
本发明涉及治疗用的溶液和方法，特别是用于抗炎，抗疼痛及抗软骨退化 (cartilage degradation)白勺禾口;^^去。
II.
背景技术：
关节内窥镜检查是一种外科手术过程，其穿过覆盖在上面的皮肤和关节囊中的一 个小切口，将与远端光源和视频监视器相连的照相机插入解剖学上的关节(例如，膝，肩 等)中。穿过相似的切口，还可将外科手术器械放在关节中，在关节内窥镜造影的指导下使 用。因为关节内窥镜检查技术人员水平的提高，越来越多曾经通过“开放式”外科手术技术 进行的外科手术过程，现在可用关节内窥镜检查的方法来完成。这样的操作包括，例如，膝 关节的部分半月板切除术和韧带重建，肩部的肩峰成形术和回旋肌套口清创术以及肘滑膜 切除术。由于外科适应症的扩大和小直径关节内窥镜的开发，腕和踝的关节内窥镜检查也 已成为常规的检查。在每一次关节内窥镜检查的过程中，用生理冲洗液(例如生理盐水或乳酸盐林格 氏溶液)连续冲洗关节，使关节囊扩张，除去手术碎片，从而提供更清晰的关节内造影。马 歇尔的美国专利4，504，493公开了一种等摩尔的甘油水溶液，其是一种用于关节内窥镜检 查的非_传导性且光学澄明的冲洗液。传统的生理冲洗液不能提供镇痛，抗炎和抗软骨退化的作用。缓解手术后患者的疼痛和痛苦是临床医学中，特别是在每年进行的门诊病人手术 数量不断增长的情况中一个特殊的焦点区。最广泛使用的全身药剂，环加氧酶抑制剂(例 如，布洛芬)和阿片样物质(例如，吗啡，芬太尼)具有显著的副作用，包括胃肠刺激/出血 及呼吸抑制。在手术后的一段时期内，与阿片样物质有关的恶心和呕吐的高发生率更是一 个难题。以治疗手术后疼痛从而避免有害副作用为目的的治疗药剂并不容易研制，原因是 这些药剂的分子靶遍布于全身，并介导不同的生理作用。尽管抑制疼痛，炎症及软骨退化的 临床需要显而易见，但还是未能研制出以有效的给药剂量传递疼痛、炎症和软骨退化的抑 制剂，同时使不利的全身副作用达到最小的方法。作为举例，以治疗剂量频繁给予阿片制剂 的常规(例如静脉内，口服，皮下或肌肉内)方法，常常与显著的不利副作用，包括严重的呼 吸抑制，情绪改变，精神模糊及深度的恶心呕吐有关。以往的研究已经证实了某些内源性药剂，如5-羟色胺(5-羟基色胺，在此处有时 称其为“5-HT”)，缓激肽和组胺产生疼痛和炎症的能力。Sicuteri，F.等，5-羟色胺-舒缓激 肽对人痛觉受体的增强作用，生命科学(Life Sci)4，pp. 309-316(1965) ；Rosenthal,S. R.， 组胺作为皮肤痛觉的化学介质，皮肤研究杂志(J. Invest. Dermat.) 69, pp. 98-105 (1977)； Richardson, B. P.等，5-羟色胺M_受体亚型的鉴定以及一类新药物对其特异性的阻
5断作用，自然(Nature) 316, pp. 126-131(1985) ； ffhalley, E. T.等，激肽激动剂和拮抗 齐II 白勺作用，Naunyn-Schmiedeb 药理学文■ (Naunyn-Schmiedeb Arch. Pharmacol. ) 36, pp. 652-57 (1987) ；Lang, E.等，在体外自大鼠皮肤精细传入的化学敏感性。神经生理学杂 志(J. Neurophysiol) 63，pp.887-901(1990)。例如，已经证实了用于人水疱(剥脱性皮肤)的5-HT可引起被5_HT3受体拮抗 剂抑制的疼痛，Richardson等.，(1985)。同样，外周应用舒缓激肽可产生被舒缓激肽受 体拮抗剂阻断的疼痛。Sicuteri等，1965 ；Whalley等，1987 ；Dray, A.，等，舒缓激肽和炎 性疼痛，神经科学动向(Trends Neurosci. 16，pp. 99-104(1993))。外周应用组胺可产生 被组胺受体拮抗剂抑制的血管扩张，瘙痒和疼痛。Rosenthal，1977 ；Douglas, W.W.，“组胺 和5-羟基色胺(5-羟色胺)及其拮抗剂”，在Goodman，L. S.，等，ed.，治疗的药理学基 石出(The Pharmacologycal Basis of Thorapeutics), MacMillan Publishing Company, New York, pp. 605-638 (1985) ；Rumore, M. M.，et. al.，抗组胺药物的镇痛作用，生命科学 (LifeSci)36, pp. 403-416(1985)。已经证明，这三种激动剂(5-HT，缓激肽和组胺)联合 应用可显示一种引起疼痛的协同作用，产生一种持久强烈的疼痛信号。Sicuteri等，1965 ； Richardson等，1985 ；Kessler, ff.，等，炎性介质体外联合应用引起的皮肤传入神经终端的 激动以及P物质的调制作用。实验性大脑研究，(Exp. Brain Res.)91，pp. 467-476 (1992)。在体内，5-HT位于血小板和中枢神经元中，组胺位于肥大细胞中，缓激肽则是在组 织创伤，PH改变和温度改变期间，自较大的前体分子产生的。因为5-HT可以从组织损伤部 位的血小板中大量释放出来，导致血浆5-HT的水平比静止水平高20倍(Ashton，J. H.等， 5_羟色胺作为患血管狭窄症狗冠状动脉中循环流速变化的介质，循环(Circulation) 73， PP. 572-578(1986))，内源性5-HT可能在产生手术后疼痛，痛觉过敏和炎症方面中起作 用。事实上，血小板的活化可导致体外外周伤害感受器的刺激。Ringkamp，M.，等，活化 的人血浆血小板在体外刺激大鼠皮肤伤害感受器，神经科学通讯(Neurosci. Lett.) 170， pp. 103-106(1994)。同样，组胺和缓激肽也可在创伤期间释放到组织中。Kimura, E.等， 实验性冠状动脉阻塞后冠状窦血中缓激肽水平的变化，美国心脏病杂志(Am Heart J.)85, pp.635-647(1973) ；Douglas,1985 ；Dray 等 (1993)。此外，已知前列腺素也可引起疼痛和炎症。环加氧酶抑制剂如布洛芬通常用于 非-外科手术和手术后的环境，以阻断前列腺素的产生，由此减少前列腺素介导的疼痛和 炎症。Flower，R. J.，等，镇痛解热药和抗炎药；痛风治疗中所用的药物，见G00dman，L. S.， 等主编，治疗的药理学基础(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)，MacMillan Publishing Company, New York，pp. 674-715 (1985)。环加氧酶抑制剂按常规方法使用时， 与某些不利的全身副作用有关。例如，吲哚美辛或酮咯酸具有公认的胃肠和肾的不利副作 用。正如所讨论的，5-HT，组胺，缓激肽和前列腺素可引起疼痛和炎症。在过去的二十 年中，人们已经了解并讨论了这些物质介导其对周围组织的作用时所借助的各种受体。大 多数研究已在大鼠或其他动物模型上进行过。但是，人和动物之间在药理学和受体序列方 面均存在着差别。阿米替林除能阻断5-HT和去甲肾上腺素的吸收外，还是一个有效的5-HT受体拮 抗剂。所以，前面提到的研究中，在减轻手术后疼痛方面缺乏疗效这一点似乎与急性疼痛中内源性5-HT所起作用的提法相矛盾。有几个理由可以解释在这两项研究中所发现的阿米 替林不能减轻急性疼痛的原因。(1).第一项研究(Levine，等，1986)中阿米替林在手术前 一周开始使用，直到手术前一天晚上结束，而在第二项研究(Kerrick，等，1993)中，阿米替 林仅仅在手术后使用。所以在实际的组织损伤期，也就是在5-HT将要释放出来的时期，存 在于手术部位组织中的阿米替林的水平还不清楚。(2)阿米替林是由肝脏广泛代谢的。采 用口服给予的方法，手术部位组织中阿米替林的浓度在相当长的时间内，也许不能保持在 足够高的水平来抑制在第二项研究中手术后所释放的5-HT的活性。(3)鉴于存在多种炎症 介质，且研究已证明了炎症介质间的协同作用，因此只阻断一种药剂(5-HT)并不足以抑制 应答组织损伤的炎症反应。有几项研究已经证实，极高浓度(1 % -3%溶液——即10-30mg/ml)的组胺工饥) 受体拮抗剂具有充当外科手术过程局麻剂的作用。这种麻醉作用并不是经由&受体介导 的，而是由于与神经元膜钠通道(与利多卡因的作用相似)非特异性相互作用的原因。由 于可产生与这些高“麻醉”浓度的组胺受体拮抗剂有关的副作用(例如镇静作用)，目前还 未将组胺受体拮抗剂局部应用于围术期环境下。
I II.

发明内容
本发明提供一种组成低浓度的多种药剂的混合物的溶液，目的在于局部抑制生理 性电解质载体液中的疼痛，炎症和软骨退化的介质。本发明还提供一种围术期将含这些药 剂的冲洗液直接传递到外科手术部位的方法，在该手术部位，该冲洗液在受体和酶水平上 局部发挥作用，以优先抑制该部位的疼痛，炎症和软骨退化。由于采用本发明的局部围术期 传递方法，使用比其它传递方法(即静脉内，肌肉内，皮下和口服给药)所必需的，更低的药 剂给药剂量就能获得所期望的治疗作用。该溶液中的抗疼痛和/或抗炎剂和/或抗软骨退 化剂包括从下列各类受体拮抗剂的激动剂，及酶激活剂和抑制剂中挑选的药剂，其中每一 类药物均通过不同的分子作用机制发挥抑制疼痛和/或炎症和/或软骨退化的作用。抑制 疼痛和/或炎症的代表性药剂包括，例如(1) 5-羟色胺受体拮抗剂；(2) 5-羟色胺受体激 动剂；(3)组胺受体拮抗剂；(4)缓激肽受体拮抗剂；(5)激肽释放酶抑制剂；(6)速激肽受 体拮抗剂，包括神经激肽i和神经激肽2受体亚型拮抗剂；(7)降钙素基因相关肽(CGRP)受 体拮抗剂；(8)白介素受体拮抗剂；(9)作用于花生四烯酸代谢物合成途径的酶抑制剂，包 括(a)磷酸酯酶抑制剂，包括PLA2同型抑制剂和PLCy同型抑制剂，(b)环加氧酶抑制剂， 和(c)脂加氧酶抑制剂；(10)前列腺素类受体拮抗剂，包括类花生酸EP-1和EP-4受体亚型 拮抗剂和凝血丁烷受体亚型拮抗剂；(11)白细胞三烯受体拮抗剂，包括白细胞三烯B4受体 亚型拮抗剂和白细胞三烯D4受体亚型拮抗剂；(12)阿片样物质受体激动剂，包括P -阿片 样物质，S-阿片样物质和阿片样物质受体亚型激动剂；(13)嘌呤受体拮抗剂，包括P2X 受体拮抗剂和P2Y受体拮抗剂；(14)钙通道拮抗剂。上述药剂中的每一种均可作为抗炎剂和 /或抗感受伤害，即抗痛或镇痛剂而发挥作用。为满足特殊应用，需从这些类化合物中选择 药剂。抑制软骨退化的代表性药剂包括，例如(1)蛋白的白介素-1家族的受体拮抗剂，包 括，例如，IL-1 3，IL-17和IL-18 ；⑵肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的拮抗剂，包括，例如， TNF-R1 ； (3)白介素4，10和13受体的激动剂；(4) TGF- 3受体超家族的激动剂，包括，例如， BMP-2，BMP-4和BMP-7 ； (5)C0X-2的抑制剂；(6)MAP激酶家族的抑制剂，包括，例如，p38MAP激酶；(7)蛋白的基质金属蛋白酶(MMP)家族的抑制剂，包括，例如，MMP-3和MMP-9 ;(8)蛋 白的NF- k B家族的抑制剂，包括，例如，I k B与p50/p65 二聚物的复合体；(9)氧化氮合酶 (N0S)家族的抑制剂，包括，例如，iN0S;(10)整联蛋白受体的激动剂和拮抗剂，包括，例如， 整联蛋白的激动剂；(11)蛋白激酶C(PKC)家族的抑制剂；(12)蛋白酪氨酸激酶家族 的抑制剂，包括，例如，src亚族；(13)蛋白酪氨酸磷酸酶的调制剂；和(14)蛋白src同源 物2(SH2)域的抑制剂。在本发明的其它方面中，提供了通过将组合物直接给予患者的关节而减轻或防止 关节中的关节软骨损坏的方法和溶液，其中所述的组合物包括一种或多种代谢活性的软骨 保护剂和一种或多种抑制疼痛，炎症等的药剂，如前所述，或选择性地，在用于传递的药学 有效载体中的两种或多种代谢活性的软骨保护剂的组合。代谢活性的药剂包括，但不限 制于，直接或间接调制或改变细胞的生物，生物化学或生物物理状态的化合物，包括改变 质膜电位，配体结合或酶促细胞受体活性，胞内或胞外定位的酶，蛋白-蛋白的相互作用， RNA-蛋白的相互作用，或DNA-蛋白的相互作用的药剂。在本发明其中一个方面中，提供代 谢活性软骨保护剂的药物组合物，它是以至少两种同时作用于不同分子靶的药剂的组合为 基础的。在代表性实施方案中，至少一种药剂是直接提供抗炎活性和/或促进软骨合成代 谢过程的细胞因子或生长因子受体激动剂，至少第二种药剂是抑制促炎和/或软骨分解代 谢过程的受体拮抗剂或酶抑制剂。抗炎/合成代谢细胞因子，其功能性地抑制关节中促炎 细胞因子的作用，促进软骨基质的合成并抑制基质退化。这些受体激动剂包括，例如，特异 性的抗炎及合成代谢的细胞因子，如白介素(IL)激动剂(例如，IL-4，IL-10和IL-13)及 转化生长因子超家族(例如，TGF0和BMP-7)的特异性成员，胰岛素样生长因子(例 如，IGF-1)和成纤维细胞生长因子(例如，bFGF)。至少第二种药剂是从一类抑制和减轻促 炎分子靶活性或表达的受体拮抗剂或酶抑制剂(例如，IL-1受体拮抗剂，TNF-a受体拮抗 剂，环加氧酶_2抑制剂，MAP激酶抑制剂，氧化氮合酶(N0S)抑制剂，及核因子k B(NFK B) 抑制剂)中提取的。在外科手术关节内窥镜过程期间，通过关节内注射或经由输注，包括围 术期给药(即，手术前和/或手术中和/或手术后)，可局部递送合成代谢剂与分解代谢抑 制剂的多种药剂的组合。关节软骨是一种特殊的胞外基质，它是通过代谢活性的关节软骨细胞产生和维持 的。正常健康的胞外基质的维持反映生物合成速率和基质成分掺入间的动态平衡，及它们 的退化速率和后来从软骨到滑液中的损耗间的动态平衡。然而，还不十分清楚基质体内稳 态的调节机制，它们在炎性关节疾病中很清楚地改变并应答关节创伤，以致基质的破坏速 率超过新基质成分的合成速率。通常，认为基质的体内稳态代表了分解代谢的细胞因子与 合成代谢的细胞因子(包括生长因子)作用间的动态平衡。用于软骨保护的治疗剂的最佳 组合通过促进合成速率，同时抑制破坏速率而移动动态的基质平衡，从而使合成代谢的过 程达到最大，并促进修复。分解代谢的细胞因子，如IL-10和TNF-a对软骨细胞上的特异性受体起作用， 以诱导MMPs产生，其中的MMPs可诱导基质的退化，而退化是由合成代谢的细胞因子，如 TGF-0，BMP-2和IGF-1抑制的。因此，仅仅以抑制分解代谢过程(如MMP抑制剂和IL-1 拮抗剂的组合)为基础的治疗方法对于软骨修复来说不是最佳的，因为还需要合成代谢剂 来诱导或促进基质产生成分的生物合成和集合。第二，造成软骨基质破坏的分解代谢细胞
8因子(IL-1，TNF，IL-17，IL-18，LIF)的多样性显示阻断所有分解代谢细胞因子的活性是不 现实的。相反，仅仅依靠使用合成代谢剂，如IGF-1，BMP-2或BMP-7的方法不是最佳的，这 是因为它不能对抗分解代谢细胞因子的减量调节作用。TGF-0，BMP-2和IGF-1也可以作 用于特异性受体，以诱导软骨细胞产生基质成分，其是由IL-1 0，TNFa，IL-17和LIF抑制 的。因此，用于软骨保护的最佳治疗组合是由至少一种合成代谢剂和一种软骨分解代谢的 抑制剂所组成。本发明还提供一种制备药剂的方法，该药剂被混合配成稀释冲洗液，供关节内窥 镜检查外科手术期间，连续冲洗手术部位，特别是患者的关节部位使用。该方法需要把至少 一种抗软骨退化剂和优选的一种或多种抗疼痛/抗炎剂溶解于生理电解质载体液中，对于 某些抗软骨退化剂的应用而言，每种药物的浓度优选不超过约100，OOOnanomolar，更优选 不超过约25，OOOnanomolar，且最优选不超过约10，OOOnanomolar。本发明的方法可在抑制疼痛，炎症和软骨退化的治疗或诊断过程期间，直接向伤 口或手术部位提供多种受体拮抗剂和激动剂以及酶抑制剂和激活剂稀释组合的传递。由于 该溶液活性成分是以连续方式局部直接应用于手术组织的，因此与相同药物在口服，肌内， 皮下和静脉内给药时产生治疗作用所需的剂量相比，这些药物可以极低的剂量有效使用。 这里所用的术语“局部”一词包括药物在伤口或其他手术部位内和周围的应用，排除口服， 皮下，静脉内和肌肉内给药。这里所用的术语“连续”包括以频繁的间隔，不间断地应用，反 复应用，以及除短暂中断施用以引入其它药物或制剂或操作设备以外的不间断施用，这样， 可在伤口或手术部位局部保持基本上恒定的预定浓度。药剂低剂量应用的优点有三个。最重要的一点是没有常常限制这些药物应用的全 身副作用。其次，本发明溶液中，为特殊应用而选择的药剂对其赖以发挥作用的介质和介导 靶具有高度特异性。这种特异性是依靠所用的低给药剂量得以保持的。最后一点，每个手 术过程中的这些活性药剂的成本很低。这些药剂经冲洗或其他流体方式局部给药的优点是(1)局部给药可保证靶部位 的已知浓度，而不管病人之间代谢，血流等的变化性。(2)因为是直接传递方式，可以立即获 得治疗浓度，这样，给药剂量的控制得到改善。(3)活性药剂局部直接应用于伤口或手术部 位，可基本上减少这些药物通过全身过程，如一过及二过代谢所引起的降解，如果这些药物 以口服，静脉内，皮下，或肌肉内途径给药，则可能会出现这种降解。这种情况对那些肽类活 性药剂尤其适用，这类药剂可被迅速代谢。因此，局部给药可使用在治疗上不能采用其他途 径给药的化合物或药剂。例如，下列种类中的某些药剂均是肽缓激肽受体拮抗剂；速激肽 受体拮抗剂；阿片样物质受体激动剂；CGRP受体拮抗剂；白介素受体拮抗剂；TNF受体拮抗 剂；TGF-0受体激动剂；BMP-2和BMP-7受体激动剂；IL4，IL10和IL-13受体激动剂；和整 联蛋白受体激动剂和拮抗剂。伤口或手术部位的局部连续传递可使药物的降解或代谢达到 最小程度，虽然需要连续补充可能被降解的那部分药剂，以保证足以维持受体占有率或酶 饱和的局部治疗浓度在整个手术过程中始终得以保持。根据本发明，在整个外科手术过程中围术期局部给予该溶液可产生优先的镇痛、 抗炎及软骨保护作用。这里使用的术语“围术期”一词包括过程中应用，过程前和过程中联 合应用，过程中和过程后联合应用，以及过程前，过程中和过程后联合应用。为了最大程度 地获得优先的抗炎，镇痛(对某些应用而言)，和软骨保护(对某些应用而言)作用，最好在过程前，过程中和过程后均应用本发明的溶液。通过在出现明显的局部手术创伤刺激之 前，占据靶受体或使目标酶失活或激活，本发明溶液中的药剂可调制特殊的途径，以优先抑 制目标病理过程。如果在炎性介质和过程产生组织损害之前优先抑制它们，那么其优点与 损伤开始后的给药相比，更为显著。已经证明，通过应用本发明含多种药剂的溶液抑制一种以上的疼痛，炎症或软骨 退化介质，能够明显减轻炎症和疼痛的程度，而且理应提供软骨保护作用。本发明的冲洗液 包括药物的组合，每种溶液均可作用于多种受体或酶。这样，多种药物可同时有效地对抗病 理过程的组合，包括疼痛和炎症，及软骨体内稳态的损耗。一般认为这些药剂的作用是协同 性的，这在于本发明的多种受体拮抗剂和抑制性激动剂以组合形式应用，提供与单一药剂 的功效相比不成比例增加的功效。本发明几个药剂的协同作用通过实施例加以讨论，下面 详细描述那些药剂。相对于目前使用的冲洗液，围术期使用本发明溶液应导致临床上手术部位疼痛和 炎症，及软骨退化的明显减轻，由此减少患者手术后对镇痛药(如阿片制剂)的需求量，在 适当的时候，可使患者的手术部位尽早活动。至于外科医生和手术室工作人员方面，与传统 的冲洗液相比，并不需要额外的努力就可使用本发明的溶液。为了使软骨保护效果达到最佳，在外科手术过程之前，期间和/或之后，将本发明 的溶液直接给予关节。
IV.


现在将通过实施例，并参考相应的附图，更详细地阐述本发明，其中图1是软骨细胞的图解概述，其显示了导致炎性介质产生和软骨代谢移动的分 子靶和信号信息流。外部信号通过许多细胞表面受体家族，包括细胞因子受体，如白介 素-l(IL-l)受体家族和肿瘤坏死因子(TNF)受体家族，TGF-0受体家族和整联蛋白而进行 的整合作用在包括主要蛋白分子组的共同胞内信号途径上会聚，其中的蛋白分子是包括在 本发明溶液中的药物的治疗靶(MAP激酶，PKC，酪氨酸激酶，SH2蛋白，C0X，PLA2和NF-6B)。 这些信号途径的激活可控制许多诱导型基因产物的软骨细胞表达，包括IL-1，TNF-a， IL-6，IL-8和溶基质素(MMP-3)，及其它介质(氧化氮(NO)和PGE2)，其可导致炎症和/或 软骨退化，或基质分子的合成和软骨细胞的增殖。图2提供滑膜细胞的图解概述，其显示导致炎性介质产生和软骨代谢改变的分 子靶和信号信息流。外部信号通过许多细胞表面受体的家族，包括细胞因子受体，如白介 素-l(IL-l)受体家族和肿瘤坏死因子(TNF)受体家族，G蛋白偶联受体，如缓激肽，组胺和 5_羟色胺亚型，和整联蛋白而进行的整合作用在包括主要蛋白分子组的共同胞内信号途径 上会聚，其中的蛋白分子是包括在本发明溶液中的药物的治疗靶(MAP激酶，PKC，酪氨酸激 酶，SH2蛋白，COX, PLA2和NF-6B)。这些信号途径的激活可控制许多诱导型基因产物的滑 膜细胞表达，包括IL-1，TNF-a，IL-6，IL-8和溶基质素(MMP-3)，其可导致炎症和/或软骨 退化。图3是软骨细胞和滑膜细胞的共同信号途径图，其包括负责导致炎症和/或软骨 退化的，促炎细胞因子途径与GPCR活化受体途径间“串话”的重要信号蛋白。图4是软骨细胞和滑膜细胞的共同信号途径图，其包括负责促炎细胞因子途径与GPCR活化受体途径间“串话”的重要信号蛋白。鉴定了在本发明优选的软骨细胞保护溶液 中，某些药物作用的特异性分子位点。图5是存在于软骨细胞或滑膜细胞中分子靶的图，其促进软骨的合成代谢反应。 鉴定了在本发明优选的软骨保护溶液中，某些药物作用的特异性位点。图6是存在于软骨细胞或滑膜细胞的分子靶的图，其促进软骨的分解代谢反应。 鉴定了在本发明优选的软骨保护溶液中，某些药物作用的特异性位点。图7是用白介素-1 (IL-1，10U/ml)整夜引发后，通过G_蛋白调节激动剂在滑液培 养物中产生的前列腺素E2的图解表示法。用组胺(100 u M,空心的条)，或缓激肽(1 P M，实 心的条)刺激该培养物指定的次数，按照实施例6所述测定释放到培养物上清液中的前列 腺素E2。所示的值是来源于代表性试验的平均值士标准偏差，并相对于未受刺激的培养物 所产生的基线前列腺素E2而校准。图8是通过酮洛芬抑制滑液培养物中前列腺素E2产生的图解表示。在有(用■ 表示)或没有(用“A”或“▽”表示)指定浓度的酮洛芬参与的情况下，用IL-l(10U/ml) 整夜引发该培养物。一天之后，在用酮洛芬整夜处理的培养物上清液中测量前列腺素E2，清 洗剩余的培养物，用指定浓度的酮洛芬培养10分钟，然后在指定量酮洛芬的连续存在下， 测量应答随后用组胺(100i!M，V)或缓激肽(1PM，A)攻击3分钟所产生前列腺素E2，显 示的数据分别归一化为获自每一激动剂的最大化应答，表示为来自几个不同细胞系的三个 实验的平均值士标准误。图9是在有指定浓度的IL-1和添加的G-蛋白偶联受体配体参与的情况下，第 16小时，酮洛芬对由滑液培养物产生的IL-6作用的图解表示法。在有或没有0. 75yM酮 洛芬参与情况下，在具有下列附加受体配体1) 1.0 yM激活环腺苷酸途径的异丙基肾上腺 素(ISO)，或2)10(^11激活1 3/钙途径的组胺(HIS)之一的试验生长介质中，用指定浓度 (0. 3，1. 0和3. Opg/ml)的IL-1培养该培养物16小时。收集培养物上清液，每隔8小时用含 相同激动剂添加物的新鲜介质等分试样替换一次。接着进行处理，然后收集相当于每8-16 小时处理一次的上清液介质，并分析IL-6。
V.
具体实施例方式本发明的冲洗液和注射液是生理载体中一种或多种软骨保护剂和，任选地，一种 或多种疼痛和/或炎症抑制剂的稀释溶液。所述载体是一种液体溶液。用于此处是，其可 包含生物学上可接受的溶剂、混悬液，聚合和非聚合的凝胶，糊剂和油膏，及持续释放传递 系统成分，如由蛋白，脂质体，碳水化合物，合成有机化合物，或无机化合物组成的微粒，微 球或毫微颗粒。优选地，该载体是可包括生理电解液，如生理盐水或乳酸盐林格氏溶液的含 水溶液。所述抗炎和/或抗疼痛药剂选自(1) 5-羟色胺受体拮抗剂；(2) 5-羟色胺受体 激动剂；(3)组胺受体拮抗剂；(4)缓激肽受体拮抗剂；(5)激肽释放酶抑制剂；(6)速激肽 受体拮抗剂，包括神经激肽工和神经激肽2受体亚型拮抗剂；(7)降钙素基因相关肽(CGRP) 受体拮抗剂；(8)白细胞介素受体拮抗剂；(9)作用于花生四烯酸代谢物合成途径的酶抑制 剂，包括(a)磷酸脂酶抑制剂，包括PLA2同型抑制剂和PLCy同型抑制剂，(b)环加氧酶抑 制剂和(c)脂加氧酶抑制剂；(10)前列腺素类受体拮抗剂，包括类花生酸EP-1和EP-4受体亚型拮抗剂和凝血従烷受体亚型拮抗剂；(11)白细胞三烯受体拮抗剂包括白细胞三烯 B4受体亚型拮抗剂和白细胞三烯队受体亚型拮抗剂；(12)阿片样物质受体激动剂，包括 U -阿片样物质，6 -阿片样物质和k -阿片样物质受体亚型激动剂；(13)嘌呤受体激动剂 和拮抗剂，包括P2X受体拮抗剂和P2Y受体拮抗剂；和(14)钙通道拮抗剂。适宜的软骨保护剂包括，例如，(1)蛋白的白介素1家族的受体拮抗剂，包括， 例如，IL-10，IL-17和IL-18 ;(2)肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的拮抗剂，包括，例如， TNF-R1 ； (3)白介素4，10和13受体的激动剂；(4) TGF- 3受体超家族的激动剂，包括，例如， BMP-2，BMP-4和BMP-7 ； (5)C0X_2的抑制剂；(6)MAP激酶家族的抑制剂，包括，例如，p38 MAP 激酶；(7)蛋白的基质金属蛋白酶(MMP)家族的抑制剂，包括，例如，MMP-3和MMP-9 ;(8)蛋 白的NF- k B家族的抑制剂，包括，例如，p50/p65 二聚物与I k B的复合体；(9)氧化氮合酶 (N0S)家族的抑制剂，包括，例如，iN0S;(10)整联蛋白受体的激动剂和拮抗剂，包括，例如，
整联蛋白的激动剂；(11)蛋白激酶C(PKC)家族的抑制剂；(12)蛋白酪氨酸激酶家族 的抑制剂，包括，例如，src亚族；(13)蛋白酪氨酸磷酸酶的调制剂；和(14)蛋白src同源 物2(SH2)域的抑制剂。用于软骨保护和关节内窥镜检查过程的本发明溶液特别优选的实施方案优选包 括药剂的组合，其可同时作用于不同的分子靶以促进软骨合成代谢，并抑制未调节的或过 量的软骨分解代谢过程以最大程度地抑制炎症过程，并维持软骨的体内稳态，由此获得关 节内的软骨保护作用。在每一种本发明的外科用溶液中，该药剂是以低浓度包括在液体或流体溶液中 的，与传统的给药方法为达到期望的治疗效果所需要的药物浓度和剂量相比，这些药剂是 以低剂量局部递送的。这里使用的“液体”或“流体”包含药学上可接受的，生物适合的溶剂， 混悬液，聚合及非聚合的凝胶，糊剂和油膏。优选的载体是可包括生理电解液，如生理盐水 或乳酸盐林格氏溶液的含水溶液。相似剂量的药物经其他给药途径(例如静脉内、皮下，肌 肉内或口服)给予而获得同等的治疗效果是不可能或不实际的，因为全身给药易受一过和 二过代谢的影响。每种药物的浓度部分是根据其受体解离常数Kd或酶抑制常数&确定的。 这里使用的术语解离常数是指包括相对于各自激动剂_受体或拮抗剂_受体相互作用的平 衡解离常数，及相对于各自激活剂_酶或抑制剂_酶相互作用的平衡抑制常数。除环加氧 酶抑制剂由于所选择的特定抑制剂，可能需要较高浓度外，每种药物最好以0. 1-10，000倍 于Kd或&的低浓度包括在溶液中。优选地，每种药物以1. 0 1000倍于Kd或&的浓度， 最优选以100倍于的浓度包括在溶液中。按照需要调整这些浓度，以在局部递送位 点没有代谢转化时，用于稀释。正如下面所阐明的，可根据特定应用的变化而选择用于溶液 中的确切药剂，及药剂的浓度。本发明的溶液可低浓度包含一种或多种疼痛和/或炎症抑制剂，多种软骨保护 剂，该多种软骨保护剂中至少一种是合成代谢的软骨保护剂，至少一种是软骨分解代谢的 抑制剂，或软骨保护剂和疼痛和/或炎症抑制剂的组合。然而，鉴于前面提及的多种药剂的 协同作用，以及希望广泛地阻断疼痛和炎症，及软骨退化，最好采用多种药物。该外科手术用溶液通过将作用于不同受体和/或酶分子靶的多种具有药理活性 药剂联合应用，构成一种新的治疗方法。到目前为止，药理学的战略重点已集中在研制具有 高度特异性的药物，该药物选择性地作用于各个受体亚型或酶同型一其介导对各信号神经
12递质和激素的应答。而且，尽管单一受体亚型或酶失活，其他受体亚型或酶的活化以及由此 而产生的信号转导常常能触发一种级联作用。这可以解释为什么使用单一的受体特异性药 物难以阻断多种信号介质(例如，细胞因子，生长因子或类花生酸)在其中起作用的病理过 程。所以，把目标仅仅定在特异性的各受体亚型或同型上看来是无效的。与标准的药理学治疗方法相反，本发明外科手术用溶液的治疗方法是基于这样一 个原理，即同时作用于不同分子靶的药物组合高度有效地抑制构成病理生理状态发展的所 有各个环节。况且，代替以单独一种特异性受体亚型为目标，所述外科手术用溶液是由以作 用于不同细胞生理过程的共同分子机制为目标的药物组成，其可控制疼痛，炎症和软骨退 化(见图1)。用这种方法，本发明的外科手术用溶液可把感受伤害的，炎症的，和软骨退化 的途径中附加的受体和酶的级联减到最少。在这些病理生理途径中，本发明的外科手术用 溶液可抑制“上游”和“下游”两个方面的级联反应。“上游”抑制的一个实施例是环加氧酶拮抗剂在疼痛和炎症方面的作用。环加氧酶 (coxjncox2)催化花生四烯酸转化为前列腺素h，后者是包括前列腺素，白细胞三烯和凝血 従烷在内的炎症和感受伤害介质生物合成过程中的中间体。环加氧酶抑制剂阻断“上游”这 些炎症和感受伤害介质的形成。这种策略排除了阻断所述7种前列腺素类受体亚型与C0X 生物化学途径的前列腺素类产物的相互作用。本发明外科手术用溶液中所含的类似“上游” 抑制剂有抑酶肽，一种激肽释放酶抑制剂。激肽释放酶是一种丝氨酸蛋白酶，能裂解血浆中 高分子量的激肽原，生成缓激肽，一种疼痛和炎症的重要介质。通过抑制激肽释放酶，抑肽 酶可有效地抑制缓激肽的合成，从而为这些炎症介质提供有效的“上游”抑制作用。所述外科手术用溶液还利用“下游”抑制剂来控制这些病理生理途径。在用涉及 渐进性关节软骨退化的炎性细胞因子(如IL-1 0和TNF a )处理的滑膜细胞和软骨细胞制 剂中，MAP激酶抑制剂产生软骨保护作用。P38MAP激酶抑制剂是多种分解代谢细胞因子信 号途径中的运输点，且它的抑制作用可防止介导软骨退化的多种细胞产物的正向调节。因 此，在关节炎症方面，MAP激酶抑制剂通过提供“下游”软骨保护作用，其不受引发软骨体内 稳态改变的细胞因子受体激动剂生理学组合物的支配，而为本发明的外科手术用溶液提供 明显的优点。下面是对在前述各类抗炎/抗痛剂和软骨保护剂中的适于本发明的药物及其以 溶液形式使用时适当浓度的描述。在不希望受理论限制的同时，也说明了选择各种药物类 型的理由，据信这使得所述药物有效。I.疼痛和/或炎症的抑制剂1.5-羟色胺受体拮抗剂据认为，5-羟色胺(5-HT)是通过刺激外周伤害感受性神经元上的5_羟色胺 2(5-HT2)和/或5-羟色胺3(5-HT3)受体而产生疼痛的。大多数研究人员同意外周伤害感受 器上的5-HT受体介导由5-HT产生的直接痛觉(Richardson等，1985)。除抑制5-HT引起 的疼痛外，5-HT受体拮抗剂还可通过抑制伤害感受器的激活而抑制神经原性炎症。Barnes P.J.等，神经原性炎症的调节，药理学科动向，ll，pp. 185-189(1990)。但是，在大鼠踝关节 的研究中则声称5-HT2受体是造成由5-HT引起的伤害感受器激活的原因。Grubb,B. D.，等， 与定位于正常的和炎性大鼠踝关节的传入神经有关的5-HT受体的研究，药物作用(Agents Action) 25，pp. 216-18 (1988)。因此，5_HT2受体的激活也可能在外周性疼痛和神经原性炎症中发挥作用。本发明溶液的目的之一是要阻断疼痛和多种炎症过程。因此，正如后面将要论述 的，在本发明的溶液中适当地采用了 5-HT2和5-HT3受体拮抗剂，或单独使用或组合使用。 阿米替林(Elavil )是一种用于本发明的合适的5-HT受体拮抗剂。阿米替林作为一种镇 静剂在临床上已使用多年，并发现它对某些慢性疼痛病人也有好的作用，胃复安(Reglan ) 临床上作为抗呕吐药使用，但它对5-HT3受体显示中等程度的亲和力，并能抑制5-HT对该 受体的作用，故可能抑制由于5-HT从血小板释放所引起的疼痛。因此它也适合用于本发明 中。其他合适的5_HT2受体拮抗剂包括丙咪嗪，曲唑酮，去郁敏和酮色林。酮色林的抗 高血压作用已用于临床。Hedner，T.，等，新型5-羟色胺拮抗剂酮色林对实验性和临床高 血压的作用，美国高血压杂志(Am J. Hypertension, pp. 317s_23s (Jul. 1988))。其他合适 的5-HT3受体拮抗剂包括西沙必利和昂丹司琼。适合的5-羟色胺1B受体拮抗剂包括育享 宾，N-[甲氧基-3-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基]-2'-甲基-4' -(5-甲基)-1，2，4_噁二 唑-3-基)[1，1_联苯]-4-羧酰胺(“GR 127935)和甲硫噻庚嗪。本发明溶液中这些药物 所用的治疗浓度和优选浓度列于表1。表 1#翩/农龄口优邏帛
治疗浓度
药物类型
5 -羟色胺2受体拮抗剂
(Nanomolar)
优选浓度 (Nanomolar)
阿米替林0. 1 -1，00050 -500MDL-11,9390. 1 ■-1，00050 -500AMI-1930. 1 ■—2’ 00050 -500去曱丙味嗪0. 1 --1, 00050 -500酮色林0. 1 --1，00050 -500羟色胺3受体拮抗剂曲匹西龙0. 01-1000. 05--50甲氧氯普胺10 -10, 000200-2’西沙必利0. 1-1, 00020 -200昂丹司琼0. 1-1,00020 一200；二担負些!!(士!如)挂远劃I s amo l tare0．1-1，0005 0-5 00GR工2 7 9 35o．1-1，0001 0-5 00甲硫噻庚嗪(methiothepin)0．1-5001-100SB2166410．2-2．0002—200
2．5一羟色胺受体激动剂
已j~H 5-H]’1A，5-H]’、。和5-H]’、。受体可抑制腺苷酸环化酶活性。因此，包括低剂量5一羟色胺1A，5一羟色胺、。和5一羟色胺、。受体激动剂的本发明溶液应当可以抑制介导疼痛和炎症的神经元。期望从5一羟色胺、。和5一羟色胺、，受体激动剂获得相同的作用，因为这些受体也可抑制腺苷酸环化酶。
丁螺环酮是一种供本发明应用的适宜的lA受体激动剂。Sumatriptan~[[是适宜的lA，lB，lD和lF受体激动剂。适宜的lB和lD受体激动剂是二氢麦角胺。适宜的lE受体激动剂是麦角新碱。这些受体激动剂的治疗浓度和优选浓度列于表2。
表2
痉瘟型上或盔症地击0直0的治症型优选逛厦
]治疗浓度优选浓度藝麵去型(I)I旦nomoi旦工)(苎旦nomoi旦三)5一羟色胺．+激动剂丁螺环酮1-1，0001 0-2 00sumat r i ptan1-1，0001 0-2 005一羟色胺、。激动剂二氢麦角胺o．1-I，0001 0-i 00suma t r i ptan1-1，00 01 0-2 00nara t r i ptan1-1，0001 0-2 00r i za t r iptan1-1，000i 0-2 0 0zo lmi t r i p tan1-1，0 001 0-2 0 0L一694，24 7工一工，0 001 0-2 005一羟色胺。激动剂二氢麦角胺0． 1-1，0001 0-1 00suma t r i ptan1-1，o Oo工0—2 00
3.组胺受体拮抗剂组胺受体通常分为组胺iOg和组胺2(H2)亚型。外周给予组胺所引起的典型炎 症反应是经由&受体介导的。Douglas，1985。所以，本发明溶液优选包括组胺&受体拮抗 剂。异丙嗪(商品名Phenergan )是一种有效阻断氏受体的常用抗呕吐剂，因而适用于本 发明。有趣的是，已经证明该药还具有局部麻醉作用，只不过产生这种作用所需的浓度比阻 断氏受体所需的浓度要大几个数量级，因此认为所述作用是由不同机制产生的。本发明溶 液中的组胺受体拮抗剂浓度足以抑制涉及伤害感受器激活的&受体，但不能获得“局麻”作 用，从而消除某些有关的全身副作用。其他适宜的氏受体拮抗剂包括特非那定，苯海拉明，阿米替林，美吡拉敏和 tripolidine。因为阿米替林作为一种5-羟色胺2受体拮抗剂也是有效的，故其在本发明 中具有双重功能。这些&受体拮抗剂中每一种的适宜治疗浓度和优选浓度列于表3。表 3疼痛和/或炎症抑制剂的治疗和优选浓度
4.缓激肽警体拮抗剂
缓激肽受体通常分为缓激肽JBD和缓激肽2 2)亚型。研究证明，由缓激肽产生的 急性外周性疼痛和炎症是由B2亚型介导的，而在慢性炎症中，缓激肽产生的疼痛则是经由
士
Bi亚型介导的。Peikins,M. N.等，在大鼠二种持久性痛觉过敏模型上缓激肽和B2受体亲 抗剂 des-Arg9，[Leu8]-BK 和 HOE 140 的抗感受伤害活性。疼痛(Pain) 53，pp. 191-97(1993)； Dray, A.，等，缓激肽和炎性疼痛、神经科学动向(Trends Neurosci) 16，pp. 99-104 (1993)，这二篇文献均引入本文作为参考。目前缓激肽受体拮抗剂尚未用于临床。这些药物中的一些是肽，因此不能口服给 予，因为它们可能会被消化。B2受体拮抗剂阻断缓激肽引起的急性疼痛和炎症。Dray等， 1993，在慢性炎症条件下&受体拮抗剂抑制疼痛。等，1993;Dray et.al.，1993。所以，根 据应用，本发明溶液优先包括&和B2受体拮抗剂中的一种或两种。例如，急性和慢性关节 病均要做关节内窥镜检查，因而用于关节内窥镜检查的冲洗液应包括Bi和B2两种受体拮抗 剂。用于本发明的适宜缓激肽受体拮抗剂包括下列缓激肽工受体拮抗剂 D-Arg-(Hyp3-Thi5-D-Tic7-Oic8)-BK 的[des_Arglcl]衍生物(HOE 140 的[des_Arglcl]衍生 物，可从Hoechst制药厂购得)；以及[LeU8]des-Arg9-BK。适宜的缓激肽2受体拮抗剂包括 [D-Phe7] -BK ；D-Arg-(Hyp3-Thi5’8-D-Phe7)-BK(“NPC 349”)；D-Arg- (Hyp3-D-Phe7) -BK ("NPC 567”)；和 D-Arg-(Hyp3-Thi5-D-Tic7-Oic8)-BK( “HOE 140”)。这些化合物在前面引入的 Perkins等(1993)和Dray等(1993)的文献中得到更充分的描述。适宜的治疗及优选的浓 度示于表4。表 4/ 鍾■吿__衍农赫优邏帛
治疗浓度
药物类型(Nanomolar)
优选浓度 (Nanomolar)
缓激肽，受体拮抗剂 des - Arg' - BK HOE 140 的[des-Arg1。]衍生物
[Leu9] [des-Arg10] Kalliden 缓激肽2受体拮抗剂 [D — Phe7] - BK NPC 349 NPC 567 HOE 140
1 - 1，000 1 - 1，000
0. 1
500
o o
0
n^
1
I
o o
1
1, 000
1 - 1，000 1 — 1，000
o o o
0o o
5 5 2
1i 1
o o o
5 5 1
200 - 5, 000 50 - 500 50 - 500 50 — 5005.激肽释放酶抑制剂正如前面所指出的，肽缓激肽是疼痛和炎症的重要介质。缓激肽作为一种裂解产 物，是由激肽释放酶作用于血浆中高分子量的激肽原而产生的。因此有人认为激肽释放酶 在抑制缓激肽产生以及由此产生的疼痛和炎症方面具有治疗价值。适于本发明应用的激肽 释放酶抑制剂是抑肽酶。供本发明溶液使用的该药的适宜浓度列于下面的表5。表 5疼_禾口/ m^mmmm^mmmMm^药物类型
激肽释放酶抑制剂: 抑肽酶
治疗浓度 (Nanomolar)
优选浓度 (Nanomolar)
0. 1 - 1，000
50 - 5006.速激肽受体拮抗剂速激肽(TKs)是一族结构上相关联的肽，包括P物质，神经激肽A (NKA)和神经激 肽B(NKB)。神经元是外周TKs的主要来源。TKs—个重要的全身性作用是神经元刺激，而 其它作用包括上皮依赖的血管扩张，血浆蛋白外渗，肥大细胞脱颗粒和复原以及炎症细胞 的刺激。Maggi，C.A.，一般药理学(Gen. Pharmacol.) 22，pp. 1-24(1991)。鉴于由 TK 受体 活化所介导的上述生理作用组合，把TK受体作为目标，促进止痛和治疗神经性炎症的方法 是合理的。6a.神经激肽i受体亚型拮抗剂P物质激活被称为的神经激肽受体亚型。P物质是一种存在于感觉神经 末端的十一肽。已知P物质具有在C-纤维活化后，产生外周性炎症和疼痛的多种作 用，包括血管扩张，血浆外渗和肥大细胞脱颗粒。Levine，J. D.，等，肽和原始传入伤害 感受器，神经科学杂志(J. Neurosci) 13，p. 2273(1993)。一种适宜的P物质拮抗剂是 ([D-Pro9[spiro-gamma-lactam]Leu10, Trpn]physalaemin-(l-ll)) ( "GR 82334”)。其他 适用于本发明，作用于受体的拮抗剂有1-亚氨基-2- (2-甲氧-苯基)-乙基)-7，7 联苯-4-全氢异吲哚酮(3aR, 7aR) ( "RP 67580”)；以及2s，3s_顺式-3-(2-甲氧苄基氨 基)-2_ 二苯甲基奎宁环(benzhydrylquinuclidine) ( "CP 96，345”)。这些药剂的适宜浓 度列于表6中。表 6疼痛和/或炎症抑制剂的治疗和优选浓度6b.神经激肽2受体亚型拮抗剂神经激肽A是一种肽，其与P物质一起集聚于感觉神经元中，它也能促进炎症和痛 觉。神经激肽A活化被称之为瓶2的特异神经激肽受体。Edmonds-Alt，S.，等，一种有效的 选择性非肽神经激肽A(NK2)受体拮抗剂，生命科学(Life Sci)50 :PL 101(1992)。适宜的 NK2拮抗剂的实施例包括((S)-N-甲基-N-[4-(4-乙酰胺基-4-苯哌啶子基)-2-(3，4- 二 氯苯)苯酰胺(‘‘(士)-SR 48968”)；Met-Asp-Trp-Phe-Dap-Leu( "MEN 10,627”)；以及 eye (Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-Met) ( "L 659,877”)。这些药剂的适宜浓度列于表 7。
药物类型
神经激肽1受体亚型抑制剂:
治疗浓度 (Nanomolar)
优选浓度 (Nanomolar)
GR 82334 CP 96， 345 RP 67580
1 - 1，00010 - 500
1 - 10,000 100 - 1， 000 0. 1 - 1,000 100 - 1，000鍾■鹏_辦禾口优邏帛
治疗浓度 (Nanomolar)
1 - 1，000 10 - 10, 000 10-10，000
优选浓度 (Nanomolar)
10 - 1, 000 100 - 10，000 100 - 10，000表 7疼痛和
药物类型
神经激肽2受体亚型拮抗剂 MEN 10，627 L 659,877 (士) - SR 489687. CGRP受体拮抗剂降钙素基因相关肽(CGRP)也是一种与P物质一起集聚于感觉神经元中的肽，其 作为血管扩张剂而发挥作用，并可增强P物质的作用。Brain，S. D.，等，降钙素基因相关肽 (CGRP)和增高血管通透性的介导物的协同效应所引起的炎性水肿。英国药理学杂志(Br. J. Pharmacol.) 99，p. 202(1985)。适宜的 CGRP 受体拮抗剂的实施例是 I-CGRP-(8-37)，CGRP 的截断形式。这种多肽抑制CGRP受体的激活。该药剂的适合浓度列于表8。表 8疼痛和/或炎症抑制剂的治疗和优选浓度
治疗浓度
药物类型(Nanomolar)
CGRP受体拮抗剂
优选浓度 (Nanomolar)
CGRP - (8 - 37) 1 - 1，000
o
0
5
1
0
18.白介素受体拮抗剂白介素是一族归入细胞因子的肽，是由白细胞和其它应答炎性介质的细胞产生 的。白介素(IL)可能是有效的外周痛觉过敏剂。FerrienS.H.，等，白介素作为可被 一种三肽类似物对抗的强有力的痛觉过敏剂，自然(Nature) 334，p. 698 (1988)。一种适宜的 IL-1 0受体拮抗剂的实施例是Lys-D-Pro-Thr，它是IL_1 ^截短本。该三肽抑制IL-1 3 受体的激活。该药剂的适宜浓度列于表9。表9#翩/口优邏帛
治疗浓度
药物类型(Nanomolar )
白介素受体拮抗剂:
优选浓度 (Nanomolar )
Lys
D - Pro
Thr
.，000
10 - 5009.作用于花生四烯酸代谢物合成途径中的酶抑制剂9a.磷脂酶抑制剂
19
由磷脂_A2(PLA2)酶(cPLA2，iPLA2，sPLA2)和磷酸酶C (PLC)产生的花生四烯酸导 致级联反应，其产生多种炎性介质，称为类花生酸。在整个途径中，许多阶段都可受到抑制， 从而减少这些炎性介质的产生。在这些不同阶段抑制的实施例列举如下。PLA2同型酶的抑制作用抑制从细胞膜释放花生四烯酸，所以也就抑制前列腺素和 白细胞三烯的生成，从而导致炎症和疼痛的减轻。Glaser，K. B.，磷脂酶A2诸酶的调控选 择性抑制剂及其药理学增强作用，药理学进展(Adv. Pharmacol. 32，p. 31 (1995))。一种适 宜的PLA2同型酶激动剂的实施例是Manoalide。该药剂适宜的使用浓度列于表10。PLCY 同型磷酸酶的抑制作用也会造成前列腺素类和白细胞三烯的生成减少，所以也会导致疼痛 和炎症减轻。PLCy同型酶抑制剂的实施例是l-[6-((170-3-甲氧雌甾-1，3，5(10)_三 烯-17-基)氨基)己基]-111-吡咯-2，5-二酮。表 10#翩/口优邏帛
治疗浓度
药物类型(Nanomolar)
磷酸酶抑制剂
manoalide100 - 100， 000
优选浓度 (Nanomolar)
500 — 10，000
马兜铃酸
ACA
HELSS
40-400, 000 10-100，000 6—6’ 000
400-40, 000 100-10, 000 60-6，0009b.环加氧酶抑制剂非甾体抗炎药(NSAIDs)广泛用作抗炎，抗发热，抗血栓和镇痛药。Lewis,R. A.，前 列腺素和白细胞三烯，见风湿病学教科书，第三版(Kelley W，N.，等主编)p. 258 (1989)。 这些药物的靶分子是I型和II型环加氧酶(C0X-1和C0X-2)。这些酶也称为前列腺素H合 成酶(PGHS)-1(组成型)和_2 (诱导型)，可催化花生四烯酸转化为前列腺素H，后者是前 列腺素和凝血従烷生物合成中的中间体。C0X-2酶在内皮细胞，巨噬细胞和成纤维细胞中已 被鉴定。该酶由IL-1和TNF-a诱导，并在炎症部位正向调节其表达。C0X-1的组成活性和 C0X-2的诱导活性均可导致能产生疼痛和炎症的前列腺素的合成。目前在市场上销售的许多NSAIDs (双氯灭痛，萘普生，吲哚美辛和异丁苯丙酸等) 通常是两种同型C0X的非选择性抑制剂，但对C0X-1可能显示出比C0X-2更大的选择性，虽 然这种比率根据不同化合物而有所变化。与试图阻断天然配体与7种所述前列腺素类受体 亚型的相互作用相比，用C0X-1和2抑制剂阻断前列腺素形成的做法代表一种较佳的治疗 策略。所报道的前列腺素类受体(EP-l，EP-2和EP-3)的拮抗剂十分罕见，只有特异性高亲 和力的凝血従烷^受体拮抗剂被报道过。Wallace，J.和Cirino，G.药理学动向(Trends inPharm. Sci)，15，pp.405-406(1994)。溶液所用环加氧酶抑制剂的治疗浓度和优选浓度列于表11。
表11#翩/口优邏帛
治疗农度优选浓度
药物类型(Nanomolar )(Nanomolar) 环加氧酶抑制剂
酮咯酸100 一 1 0, 000500 - 5, 000
吲味美辛1，000 - 500, 00010. 000 - 200, 0009c.脂加氧酶抑制剂脂加氧酶的抑制，抑制了被认为是炎症和疼痛重要介质的白细胞三烯，如白细胞 三烯氏的生成。Lewis, R. A.，前列腺素和白细胞三烯，见风湿病学教科书，第三版(Kelley W. N.，等主编)，p. 258 (1989)。脂加氧酶拮抗剂的一个实施例是2，3，5-三甲基-6- (12-羟 基-5，10-十二碳二炔基)-1，4-苯醌(AA 861)，其适宜的浓度列于表12。表12 10.前列腺素类受体拮抗剂作为花生四烯酸代谢产物而产生的特异性前列腺素类通过激活前列腺素类受体 而介导它们的致炎作用。各类特异性前列腺素类拮抗剂的例子有类花生酸EP-1和EP-4受 体亚型拮抗剂以及凝血噁烷受体亚型拮抗剂。一个适宜的前列腺素E2受体拮抗剂是8-氯 二苯并[b，f] [1,4]噁唑嗪(oxaz印ine)-lO(llH)-羧酸，2-乙酰酰胼(“SC19220”)。一种 适宜的凝血噁烷受体亚型拮抗剂是[15-[la (5Z)，3 3，4a]-7-[3-[2-(苯氨基)_羰 基]胼基]甲基]-7-氧代二环-[2，2，1]_庚-2-基]-5-庚酸(“SQ 29548”)。这些药剂 的适宜浓度列于表13。表13 11.白细胞三烯受体拮抗剂白细胞三烯(LTB4，LTC4*LTD4)是花生四烯酸代谢中5_脂加氧酶途径的产物，由 酶作用产生，具有重要的生物学性质。白细胞三烯涉及包括炎症在内的许多病理状态。目前 多家制药公司都在寻找特异性拮抗剂，作为有效的治疗手段干预这些病理状态。Halushka， P. V.，等，药理学和毒理学评论年鉴(Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.) 29 :213_239 (1989)； Ford-Hutchinson, A.免疫学鉴定评论(Crit. Rev. Immunol. 10 1-12 (1990))。在包括嗜酸 性粒细胞和嗜中性粒细胞在内的某些免疫细胞中发现有LTB4受体。LTB4与这些受体结合， 导致趋化性和溶酶体释放，从而引起炎症过程。与LTB4受体活化有关的信号转导过程包括 G-蛋白介导的磷脂基(P1)代谢刺激以及胞内钙水平的升高(见图2)。一个适宜的白细胞三烯B4受体拮抗剂的例子是SC(±)-(S)-7-(3_(2-环丙甲 基)-3-甲氧基-4-[(甲氨基)-羰基]苯氧基)丙氧基)-3，4- 二氢-8-丙基-2H-1-苯并 吡喃-2-丙酸(“SC 53228”)。适用于本发明的该药剂浓度列于表14。其他适宜的白细胞 三烯氏受体拮抗剂包括[3-[-2 (7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基][3-二甲氨基-3-氧代 丙基)硫基]甲基]硫基丙酸(“MK 0571”)以及药物LY 66071和ICI 20,3219。MK 0571 也可当作LTD4受体亚型拮抗剂。表14#翩/口优邏帛
治疗浓度
药物类型(Nanomolar)
白细胞三烯B4拮抗剂
SC 53228100 - 10， 00012.阿片样物质受体激动剂阿片样物质受体的活化产生抗伤害感受作用，故这些受体的激动剂是人们所期望 的。阿片样物质受体包括P-，和K-阿片受体亚型。i!受体定位于外周感觉神经元末 端上，这些受体的活化抑制感觉神经元活性。BasbaUm，A. I.，等，阿片制剂镇痛剂外周靶是 如何成为中心的(How Central is a Peripheral Target ？，新英格兰医学杂志(N.Engl. J. Med), 325 :1168 (1991)。S-和k -受体定位于交感神经的传出末端，能抑制前列腺素的 释放从而抑制疼痛和炎症。Taiw0，Y.O.等，k和S阿片制剂阻断交感神经依赖的痛觉过 敏，神经科学杂志(J.Neurosci) 11卷，p. 928(1991)。阿片样物质受体亚型是G-蛋白偶联 受体超家族的成员。因此，所有阿片样物质受体激动剂通过其有关联的G-蛋白偶联受体 相互作用并触发信号。适宜的11-阿片样物质受体激动剂的例子是芬太尼和1^-041『 Gly-[N-MePhe]-NH(CH2)2OH(DAMGO)。适宜的S -阿片样物质受体激动剂的例子是[D-Pen2， D-Pen5]脑啡肽(“DPDPE”)。适宜的k _阿片样物质受体激动剂的例子是(反式)_3，4-二 氯-N-甲基-N-[2-(l-吡咯烷基)环己基]-苯乙酰胺(“U 50，488”)。这些药剂每种的 适宜浓度列于表15。表 15疼_禾口/ ^mmmm^muitMM
优选浓度 (Nanomolar )
500 - 5，000
22
药物类型
U-阿片样物质激动剂
DAMG0 0. sufentany1 芬太尼
PL0170.
5-阿片样物质激动剂
治疗浓度 (Nanomolar
1 - 100 0. 01 - 50 0. 1 - 500 .05-50
优选浓度 (Nanomolar )
0. 5 - 20 1 - 20 10 - 200 0. 25 - 10
o
0
5
1
1
DPDPE K_阿片样物质激动剂 U 50, 488
13.嘌呤受体拮抗剂
胞外ATP通过与P2嘌呤受体的相互作用，起信号分子的作用,
1. 0 - 100
o
0
5
1
1
1. 0 - 100
嘌呤受体的一个主
要类型是P2X嘌呤受体，其是可渗透Na+，K+和Ca2+的内在离子通道的配体控制离子通道。在 感觉神经元中发挥作用的P2X受体对原始传入神经传递和痛觉感受是重要的。已知ATP能使 感觉神经元去极化，并在伤害感受器激活方面起作用，因为从受损细胞所释放的ATP刺激 P2X受体，导致受感伤害的神经纤维末端去极化。P2X受体具有高度严格的分布(Chen，C.C.， 等.，自然(Nature) V. 377，pp. 428-431 (1995)，因为这种受体在进入脊髓的感觉的C-纤维 神经中被选择性表达，已知这些C-纤维中许多均能携带疼痛刺激物的受体。因此，P2X3受 体亚型的这种高度严格的定位表达使这些受体亚型成为镇痛药作用的极好的靶(见图3和 图7)。使钙活动的嘌呤受体，其属于G-蛋白受体超家族，已经在哺乳动物关节软骨细胞 的表面上被描述过了。人们发现，ATP在分化的原代软骨细胞中，刺激给药剂量依赖性的，钙 离子浓度的瞬时升高。异源脱敏试验证实，用ATP初步刺激后，软骨细胞没有应答UTP。这 些结果与软骨细胞的细胞表面P2Y受体的存在一致。在传代软骨细胞中，嘌呤诱导的钙活 动化显示了关于激动剂敏感性的相同药理学分布。ATP和UTP没有改变软骨基质的合成，这 种合成是通过[35S]硫酸盐通过软骨外植体或初级软骨细胞掺入到糖胺聚糖中的结合速 率而测量的。通过从软骨外植体释放糖胺聚糖而测量的基质退化也没有被任一激动剂所改 变。功能性P2Y嘌呤受体在初级关节软骨细胞表面的存在可使胞外嘌呤，如ATP的浓度激 活软骨细胞的代谢。其它研究已经确定了人关节软骨细胞P1和P2嘌呤受体基因的表达和描述了配体 介导前列腺素E2的分布。P2Y2受体激动剂ATP和UTP刺激PGE2的少量释放，在用人IL_1 a 预处理之后，PGE2水平协同性升高。在用IL-1预处理之后，应答ATP和UTP共同加入时的 PGE2释放可被佛波醇肉豆蔻乙酯模拟。P2Y2受体的功能是增加IL-1介导的PGE2释放，由 此促进关节内的疼痛和炎症。因此，P2Y拮抗剂在本发明中的用途应可防止通过滑膜细胞 和软骨细胞产生的炎性介质的激活。适合于本发明使用的P2X/ATP嘌呤受体拮抗剂包括苏拉明和磷酸吡哆醛(pyridoxylphosphate)-6-偶氮苯_2，4_ 二磺酸(“PPADS”)。这些药剂的适宜浓度列于表 16。表16 14.Ca2+通道拮抗剂钙通道拮抗剂是一组可干扰钙离子跨膜通量的不同药物，而钙离子是激活介导神 经炎症的细胞反应所需要的。钙进入滑膜细胞和软骨细胞是在这些细胞中介导活化反应的 关键步骤。而且，缓激肽，组胺，5-羟色胺(SHT2)和神经激肽受体(離和離》在介导神经 炎症，信号转导途径中的作用包括胞内钙的增加，从而导致浆膜上钙通道的活化。在许多组 织中，钙通道拮抗剂如硝苯吡啶能减少由各种刺激物引起的花生四烯酸，前列腺素和白细 胞三烯的释放。Moncada，S.，Flower, R.和Vane，J.见Goodman和Gilman氏治疗的药理 学基础(第七版)MacMillan Publ. inc. pp. 660_5 (I995)。最后，钙通道拮抗剂和任一速激肽，组胺或缓激肽拮抗剂在抑制神经炎症方面显 示协同的作用。神经激肽受体在介导神经炎症方面的作用已得到确认。神经激肽乂離》和 神经激肽2(瓶2)受体(G蛋白偶联超家族的成员)信号转导途径包括胞内钙增高，从而导致 浆膜上钙通道的活化。同样，缓激肽2(BK2)受体的活化与滑膜细胞和软骨细胞中胞内钙水 平的增加有关。因此，钙通道拮抗剂干扰涉及部分通过L型通道进入的胞内钙水平升高的 共同机制。这是钙通道拮抗剂和对神经激肽，组胺，P2Y和缓激肽2受体拮抗剂间协同性相 互作用的基础。适于本发明使用的钙通道拮抗剂包括尼索地平，硝苯地平，尼莫地平，拉西地平， 伊拉地平，氨氯地平。这些药剂的适宜浓度列于表17。表17/ 鍾测細辦禾口优邏帛
优选浓度 (Nanomolar)
10，000 - 100，000 10，000 - 100，000
24药物类型 钙通道拮抗剂
治疗浓度 (Nanomolar)
优选浓度 (Nanomolar
尼索地平 硝苯地平 尼莫地平 拉西地平 伊拉地平 氨氯地平
-10，000
-10,000 -10，000 -10，000 -10，000 一 10, 000
100- 1，000 100 - 5，000 100 - 5, 000 100-5，000 100- 5，000 100 - 5, 000II.软骨退化抑制剂近来对炎症和软骨损坏的分子生物学和生物化学理解的进展证明了许多内源性 细胞因子的作用。涉及炎症关节软骨丢失的多种促炎介质是细胞因子，TNF-a，IL-1，IL-6 和IL-8。这些促炎细胞因子水平的提高使其迅速出现在剧烈损伤的膝关节滑液中，并在患 者中继续提高至少4周(Camer0n，ML等，“在ACL-缺损膝部中，可作为预后指标的滑液细胞 因子浓度”膝部外科手术.运动碘甲酚.关节内窥镜检查2 :38-44(1994))。这些细胞因子 是从多种活化的细胞类型，包括滑膜成纤维细胞，滑膜巨噬细胞，和软骨细胞在关节中局部 产生的。该局部产生的细胞因子介导急性和慢性炎性病症中的病理生理学事件，而且还是 重要的软骨分解代谢的自分泌和旁分泌介质。这些细胞因子作用的特点在于引起作用于不 同细胞靶的多种作用的能力，及它们以积极或消极的全身方式与其它细胞因子相互作用的 能力。IL-1和TNF-a的作用特别重要，这是因为它们也是通过破坏软骨基质成分的正常周 转和破坏间的平衡而引发软骨保护效果的，而该平衡又是通过调制内源蛋白，例如，基质金 属蛋白酶(MMP’ s)和金属蛋白酶(TIMP)组织抑制剂的活性而破坏的。软骨体内稳态的细 胞因子控制代表高度调节的，作用于软骨细胞的活性介质间的平衡，其决定是基质退化还 是修复发生。关节损伤经常在包括滑膜组织在内的关节间隙内产生炎症反应，且可能导致关 节软骨的退化。在关节损伤和关节内窥镜外科手术之后，描述了人膝部滑膜和软骨代谢 中的显著的移动(Cameron，M. L.等(1994)，supra ；Cameron, M. L.等，“前交叉韧带损 伤_膝部的自然科学滑液中细胞因子和硫酸角质素浓度的变化” Am. J. SportsMed. 25 751-754(1997))。在前韧带破裂之后，在急性炎症阶段过程中，可见到膝关节滑液中特异性 促炎细胞因子的水平急剧增加(直到2-4个数量级)。由于基质金属蛋白酶(MMPs)，如胶 原酶和溶基质素-1的过度产生，其在急性创伤后患者的滑液中升高，软骨基质分子的浓度 发生显著的改变(Lohmander，L.S.等，“交叉韧带或半月板损伤后，溶基质素-1组织抑制剂 和人膝关节液中蛋白多糖的暂时模式”J. Orthopaedic Res. 12 :21_28 (1994))。暂时地，滑 液中细胞因子和软骨基质标记物(例如，蛋白聚糖)的变化，其与软骨退化相关，在急性损 伤期是最高的，但坚持延长的一段时间(3个月-1年)后，缓慢下降，并保持在比损伤前的 基线要大得多的水平。关节内窥镜外科手术的自身创伤可引起明显的外科手术后炎症，其反映关节细胞
25的附加的炎性激活，包括环加氧酶_2和其它促炎性细胞因子的正向调节。ACL断裂患者的 大部分(60-90%)在损伤后10-15年，显现出骨关节炎(OA)膝部放射照相的变化(Cameron M.L.等(1994)，supra)。因而，原始关节损伤和外科手术创伤的组合作用可诱导持续的炎 症状态和相关的软骨基质代谢的变化，其似乎是导致随后关节软骨退化变化的发展和早期 骨关节炎发展的成因因素。具有此类健康问题的人的数量相当大，这是因为仅1996年，在 美国进行的关节内窥镜检查过程的总估量数即为1800万，估计每年的增长率为10%。因 此，期望能够提供一种预防关节内的关节软骨退化的药学方法。而外科手术后的疼痛和炎症则被认为是非常严重的临床问题，目前用于关节内窥 镜外科手术的药理学治疗方法仅以急性手术后止痛为目标。现存的外科手术治疗形式不能 应付外科手术后诱导的慢性炎症状况，且不能满足抑制经历外科手术治疗关节的软骨损坏 的需要。因此，很明显需要研制一种有效的，综合的药物疗法，其可应付疼痛和炎症的急性 和慢性方面，以及损伤和外科手术治疗关节中的软骨代谢的病理变化。根据本发明此方面，提供一种通过将组合物直接给予患者关节而减轻或预防关节 中关节软骨损坏的方法，该组合物在适于关节内传递的药学上有效的载体中，包括一种或 多种代谢活性的软骨保护剂和一种或多种疼痛和/或炎症的抑制剂，如上所述，或选择性 地两种或多种代谢活性的软骨保护剂的组合，其中至少一种促进软骨合成代谢过程，且至 少另一种是软骨分解代谢过程的抑制剂。代谢活性的药剂包括，但不限制于，所有直接或间 接调制或改变细胞的生物，生物化学或生物物理状态的化合物，包括改变质膜电位，细胞受 体的配体结合或酶活性，胞内或胞外定位的酶，蛋白-蛋白相互作用，RNA-蛋白相互作用， 或DNA-蛋白相互作用的药剂。例如，这种药剂可包括引发信号转导级联的受体激动剂，抑 制信号途径的受体拮抗剂，胞内或胞外酶的激活剂和抑制剂，及调制转录因子与DNA结合 的药剂。特别地，本发明其中一个方面提供一种使用局部递送的软骨保护剂治疗损伤或外 科手术治疗过的关节，从而获得最大治疗效益的药学方法。软骨保护剂组合物的使用克服 了现有治疗方法的缺陷，现有治疗方法依靠单一药剂阻断多因素的软骨损害过程，其中有 利于分解代谢过程的合成和退化间出现转换。本发明此方面独特地利用了药剂组合的方 法，同时作用于不同的分子靶以促进软骨合成代谢，并抑制未调节过的或过度的软骨分解 代谢过程，从而最大程度地抑制炎性过程，并保持软骨的体内稳态，由此在关节内获得软骨 保护效果。已知可诱导关节损坏(分解代谢)的生物化学机制及单分子靶的抑制，如抑制 白介素-l(IL-l)与IL-1受体的结合，可能不是最佳的，因为，例如，通过独特受体的介导而 发挥作用的TNF-a与IL-1共有许多重叠的促炎和软骨分解代谢作用，且其被确定为关节 软骨损坏的主要介质。同样，在没有抑制分解代谢过程的情况下，利用仅仅提高软骨合成代 谢过程的药剂不能最佳地对抗存在于损伤关节内的分解代谢因子。特别地，本发明另一方面提供代谢活性的软骨保护剂的药物组合物，其是以至少 两种同时作用于不同分子靶的药剂的组合为基础的。在代表性实施方案中，至少一种药剂 是细胞因子或生长因子受体激动剂，其直接提供抗炎活性和/或促进软骨合成代谢过程， 且至少第二种药剂是一种受体拮抗剂或酶抑制剂，其起抑制促炎和/或软骨分解代谢过 程的作用。代表性的药物组合包括至少一种从一类抗炎/合成代谢细胞因子中选择的药 剂——其功能性地抑制关节中促炎细胞因子的作用，促进软骨基质合成并抑制基质退化。这些受体激动剂包括，但不限制于，特异性的抗炎和合成代谢细胞因子，如白介素(IL)激 动剂(例如，IL-4，IL-10和IL-13)和转化生长因子超家族的特异性成员(例如，TGF3 和BMP-7)，胰岛素样生长因子(例如，IGF-1)和成纤维细胞生长因子(例如，bFGF)。至少 第二种药剂是从一类受体拮抗剂或酶抑制剂中选择的，其起抑制和降低促炎分子靶的表达 或活性(例如，IL-1受体拮抗剂，TNF-a受体拮抗剂，环加氧酶-2抑制剂，MAP激酶抑制剂， 氧化氮合酶(N0S)抑制剂，和核因子kB(NFKB)抑制剂)的作用。所述代谢活性药剂包括 位于细胞表面的受体的功能性激动剂和拮抗剂，和膜束缚或胞外分泌的酶(例如，溶基质 素和胶原酶)的抑制剂。此外，许多药剂是以新的靶为目标的，其是转导和整合表面受体信 号的胞内定位酶和转录因子，包括酶N0S，C0X-2，和促细胞分裂剂-激活的蛋白激酶(MAPK) 的抑制剂和蛋白-DNA相互作用的抑制剂，如转录因子NFkB。此方法通过同时促进细胞因 子_驱动的合成代谢过程并抑制分解代谢过程而得以保持软骨的完整性。多种药物的组合可通过关节注射或经过输注局部递送，包括在外科手术关节内窥 镜过程期间围术期(即，手术前和/或手术中和/或手术后)单独给药，或与手术后的持续 传递，如调节泵传递系统，或其它持续释放传递系统结合给药。持续释放传递系统可包括， 但不限制于，由蛋白，脂质体，碳水化合物，合成有机化合物，或无机化合物组成的微粒，微 球或毫微颗粒。因而，在某些实施方案中，本发明提供经过注射或输注，单独或与镇痛剂和 /或抗炎剂一起传递的药剂组合物。在损伤之时或刚一损伤后(例如围术期)，通过将软 骨保护剂直接局部递送而获得的快速作用可在引发随后的反应之前，有效的抑制最初的过 程，由此优先限制局部组织损伤和随后软骨的损伤。本发明此方面的优点在于1)在急性和慢性病中，组合药物疗法可涉及造成软骨 损坏的多因素原因；2)软骨保护剂的组合物可与抗炎和止痛剂组合；3)药物组合物的局部 递送可在关节内获得软骨保护剂的瞬时治疗浓度；4)在关节内窥镜外科手术期间，围术期 使用冲洗液，可连续维持关节内治疗所期望范围的药物水平；5)与全身传递相比，局部递 送可使总的药物给药剂量和给药频率降低；6)局部定点传递到关节，可避免全身毒性，并 减轻副作用；7)直接局部递送至关节，则可以使用新的，药学活性的肽，和蛋白，包括细胞 因子和生长因子，因为如果被限制为全身给药途径，则这些药剂可能不具有治疗有效性。1.白介素-l(IL-l)受体拮抗剂白介素IL-1以两种形式存在，IL-la和IL_1 0，其是来源于分离基因产物的多 肽，该分离基因产物共有一个相似的免疫调节和促炎功能谱。IL-1是一种17kD的多肽，其 可作用于或由关节中的许多细胞类型产生，包括滑膜成纤维细胞和巨噬细胞，软骨细胞，内 皮细胞和单核细胞及巨噬细胞。有证据显示，IL-1在损伤关节中出现的关节炎症和关节软 骨的病理生理学损伤中起重要的作用。这两种形式软骨损坏细胞因子的作用是通过两种IL-1受体(IL-1R)，I型IL-1或 II型IL-1受体的其中一个介导的。IL-1受体在结构上是清楚的，且属于以免疫球蛋白结 合域的存在为特征的分离超家族。这些受体具有与含免疫球蛋白域的其它受体类似的氨基 酸同源物。较大的I型IL-1受体在T细胞中和成纤维细胞中表达，而较小的II型IL-1受 体在B细胞，单核细胞，嗜中性白细胞，和骨髓细胞中表达。II型IL-1受体可与高亲和力的IL-10结合，但11-10的结合不能引发胞内信号 转导，这是因为它与I型IL-1受体结合。相反，II型受体可作为可溶性IL-1结合因子的
27前体起作用，其已经从细胞中脱落出来，且此可溶性受体作为生理学的IL-10拮抗剂起作 用。天然存在的IL-1结合蛋白已经被描述过了，其与可溶性II型受体的外部相对应。已经克隆并测序了与IL-1受体结合的，天然存在的分泌可溶性配体，其被选择性 地称为IL-1受体拮抗剂(sIL-IRA，IL-IRa，IL_lra)，且发现该配体编码至少22kD的蛋白。 IL-IRa竞争性地抑制IL-1 a和IL-1 0与I和II型IL-1受体的结合。Il-lRa是一种纯 的受体拮抗剂，因为它与受体的结合不能激活与IL-1受体相关的膜细胞信号转导机制。虽 然此蛋白与IL-IRs的结合亲和力较高，但仍需要过量的，10-100倍的摩尔数来抑制表达I 型IL-1R细胞的IL-1生物应答。已知的，产生IL-IRa的细胞包括单核细胞，嗜中性白细 胞，巨噬细胞，滑膜细胞和软骨细胞。已经证实，IL-IRa可抑制PGE2&合成，促炎细胞因子 和MMPs的诱导，及氧化氮的产生。分泌型IL-1R是在试验性诱导的炎症期间体内释放的。 重要地，IL-IRa是在滑膜组织中表达的，并存在于正常人的滑液中。在膝部损伤的患者中， 滑液中IL-IRa的水平在损伤后的急性阶段突然增加，随后降低至比亚_急性和慢性状态中 的正常水平还要低。从而证明IL-IRa在关节损伤的应答中起生理学的作用。通常认为IL-1是起支配作用的软骨损坏细胞因子，由于其通过软骨细胞和滑膜 细胞刺激降解酶和促炎细胞因子产生的能力，它可在关节的损坏中发挥作用。而且，IL-13 还是一种有效的抑制软骨细胞合成蛋白多糖和胶原的抑制剂。在细胞水平，IL-10诱导的 滑膜成纤维细胞的应答包括PGE2的，胶原酶和其它中性蛋白酶产物的增加，及促炎细胞因 子，IL-6和IL-8的正向调节。IL-1，其存在于关节病患者的关节液中，刺激软骨细胞1)使酶，如溶基质素，成 纤维细胞和嗜中性胶原酶，及纤溶酶原激活剂的合成量提高，2)抑制纤溶酶原激活剂的抑 制剂-1和TIMP的合成。而且，IL-10还是一种有效的，基质成分如II型胶原及蛋白多糖 合成的抑制剂，其中的II型胶原是关节软骨中的主要胶原形式。蛋白酶和抑制剂水平间的 不平衡导致活性蛋白酶量的增加。这种增加，与基质生物合成的抑制相结合，导致软骨退 化。在动物研究中，将IL-1注射到兔膝关节中可引起蛋白多糖从关节软骨中排除。因为IL-1是一种重要的，涉及慢性滑膜炎和软骨退化发病机理的细胞因子，因此 减少它的产生或阻断它的作用是一种用于减轻滑膜炎症并提供软骨保护作用的新的适宜 治疗方法。可利用各种拮抗激动剂IL-1与其天然膜束缚受体间相互作用的治疗方法，这些 方法包括1)天然存在的，特异性的IL-1受体抑制剂，包括IL-IRa及可溶性IL-1受体；2) 抗IL-1 Abs ；3)小分子拮抗剂，其可以是肽的或非肽的。阻断此重要细胞因子作用的能力可作用于关节中的多种细胞类型(例如，滑膜成 纤维细胞和软骨细胞)，从而抑制随后的病理作用，如炎性细胞渗透到关节中，滑膜增生，滑 膜细胞活化，和软骨损害及软骨基质合成的抑制。IL-1受体拮抗剂应阻断IL-1炎症应答的 增殖，由此干扰疾病过程。许多IL-1受体拮抗剂的治疗有效性已经通过炎症和关节炎(RA 和OA)的动物模型得到证实。在皮下注射Il-lRa或关节内注射可溶性I型IL-1R后，RA患 者的临床病症得到改善。IL-10和IL-IRa的效果取决于它们各自的局部浓度。在RA滑膜片的上清液 中，IL-10的水平比IL-IRa的水平高三倍。因此，局部IL-IRa自发性的产生不足以抑制 IL-10的作用，这是因为要有过量的(10-100倍)，较大摩尔数的Il-lRa分子才能抑制 细胞中IL-1诱导的生物反应，其中所述的细胞表达I型的IL-1R。因此，已经将高剂量的IL-IRa用于体内阻断患RA的人类志愿者中的IL-1。局部存在于滑膜中的IL_lRa提供一 种负信号，其减量调节滑膜炎中的至少部分IL-1介导的过程，如白细胞在发炎组织中的积 聚，滑膜细胞产生的胶原酶和PGE2。将IL-IRa直接注射到犬科动物ACL模型的关节中，并使 用以将IL-IRa的基因转染到人滑膜成纤维细胞中为基础的基因治疗方法，可证实IL-IRa 的软骨保护作用。本发明公开了 IL-1可溶性受体蛋白的局部递送，所述IL-1可溶性受体蛋白是由 IL-1R的胞外域组成的，且能够结合溶液中的IL-1细胞因子分子。特别是，通过实施例，在 美国专利US5，319，071和US5，726，148中公开了含氨基酸序列1_312的可溶性人IL-1受 体(shuIL-lR)多肽，其可与一种或多种选自抗炎类，抗疼痛类，或软骨保护类的药物组合。 选择性地，如美国专利US5，319，071中公开的，由sIL-lR结合域多肽组成的融合蛋白的局 部递送可促进软骨保护作用。此外，还公开了美国专利5，817，306中公开的IL-1受体拮 抗剂的局部递送，以用于本发明。已经证明，shuIL-lR可溶性受体可结合具有毫微亲和力 的IL-1。当在各种炎症或病理生理条件下将药物局部用于关节组织时，治疗有效浓度的 IL-1R可溶性受体，如shuIL-lR的局部递送可通过将其直接注射到关节中进行，或以冲洗 液(例如，在关节内窥镜外科手术过程期间)的形式进行，该冲洗可与此处公开用作软骨保 护剂的一种或多种软骨保护药物，抗炎药物，或抗疼痛药物组合使用。这种治疗优先抑制胶 原酶-1和溶基质素-1产生的IL-1刺激。使用完全不同的方法，该方法是以用于局部产生 IL-1和/或TNF-a的1型可溶性受体的基因传递为基础的，人们已经发现，这些细胞因子 可溶性受体的存在可在抗原诱导的关节炎急性炎症阶段，为兔的膝关节提供保护。以高亲和力与人I型IL-1受体特异性结合的IL-1受体拮抗剂肽(11-15个氨 基酸)适于用作本发明的软骨保护剂。这些小肽与较大的重组IL-1可溶性受体或重组 IL-lra相比，可提供更多的有利之处，包括合成的难易和成本，及渗透生物屏障的能力。 基于体外效果的两种最有效肽是:Ac-FEWTPGWYQJYALPL-NH2(AF12198，IC50 = 0. 5_2nM) Ac-FEWTPGWYQJYNH2 (AF11567)。AF11567 是 AF12198 的截短译本，其缺少 4C-端残基，且相 对于I型IL-1受体的亲和力稍低，但其具有类似的2. 3-2. 6小时的血浆半衰期。当经由静 脉内输注全身给药时，较差的溶解性和快速的代谢似乎抑制了 AF12198的功效。通过直接 的局部递送方法，如注射到关节内的关节间隙中，或使其包括在适于本发明所述外科冲洗 液或其它输注液中，则可部分克服这些限制。适于本发明IL-1受体拮抗剂的实施例如下所 示。对于所有局部递送(即，注射，输注和冲洗)方式来说，各适宜药剂的最佳给药剂量和 /或浓度是治疗有效的。作为一个实施例，对于各所列药剂来说，提供了含所列药剂的冲洗 液的优选和最优选浓度，期望这种浓度是治疗有效的。表18a^m-i警体拮抗剂6妨台疗禾P优诛浓It化合物 rshuIL-lR rhlL-lra0.2-2000
抗 IL1 抗体G. 2-2000
26/55 页
最优选浓度(nM) 200 200 200
说明书
治疗浓度(nM) 0. 2-2000
AF121980.2-2000200
AF115670.2-20002002.肿瘤坏死因子(TNF)警体拮抗剂TNF-a，一种主要由活化巨噬细胞产生的细胞因子，具有多种生物作用，包括一 些由特异性TNF受体介导的基因的转录调节，和免疫调节活性。最初，克隆了两种被称作 TNF-R1和TNF-2的不同受体，且发现它是作为可溶性受体产生的。此家族中的受体是单一的跨膜蛋白，在它们的胞外域具有很多同源物，而它们相 对较短的胞内域则具有非常少的序列同源物。TNF的作用是由与细胞表面受体结合的因子 而产生的，事实上，其存在于所有已经研究过的细胞类型中。人们已经鉴定并克隆了两个受 体。其中一个受体类型，被称作TNFR-II (或A型或75kDa)，编码439个氨基酸的跨膜蛋白， 并具有75kDa的分子量。第二个受体类型，被称作TNFR-I (或B型或55kDa)，具有55kDa的 分子量，且编码426个氨基酸的跨膜蛋白。TNFR1包括一个胞内域，其可以通过NF_ k B途径 引发信号。TNF的两个受体均显示了结合TNFa的高亲和力。人们已经分离了可溶性TNF受 体(sTNFR)，且证实其是由于膜束缚受体胞外域的脱落而出现的。人们已经鉴定了两种类型 的TNFRs，并将其命名为sTNFRI(TNF BPI)和sTNFRII (TNF BPII)。且已经证明，这这些可 溶性受体的形式均可代表上述两种TNFR类型的截短形式。TNFa在炎症应答和软骨损坏的细胞序列和分子事件中起重要的作用。TNFa的 许多作用与IL-1的促炎作用相重叠。TNFa的促炎作用是刺激促炎细胞因子，包括IL-1， IL-6和IL-8的释放。TNF-a还可诱导基质金属蛋白酶从嗜中性白细胞，成纤维细胞和软 骨细胞中释放，从而使软骨退化，部分是通过胶原酶的刺激进行的。此外，TNF-a还可正向 调节正常人关节软骨细胞和滑膜成纤维细胞中的COX-2，导致PGE2产物的增加。此细胞因子和IL-1被认为引发及产生关节软骨的病理作用，包括白细胞渗透，滑 膜增生，滑膜细胞活化，软骨损害和软骨基质合成的抑制。特别是，在滑膜炎症期间，可见到 关节滑膜液中TNF-a水平的增加，及滑膜细胞产生的TNFa的增加。因此，局部递送的冲 洗液，输注液或注射液中的可溶性TNFa受体可结合游离的TNFa，并作为周围组织中TNF 受体的拮抗剂而起作用，从而提供软骨保护效果。本发明描述了功能性TNF-a拮抗剂的用途，其可通过有效游离配体的 scavaging,或与受体自身直接的，竞争性的相互作用而胞外阻断配体与其相关膜受体的相 互作用，单独使用或与其它药剂组合提供软骨保护作用。还可利用各种治疗方法来拮抗激 动剂，TNF-a，与其天然膜束缚受体间的相互作用，这些方法包括1)天然存在的特异性 TNF-a活性抑制剂，包括可溶性TNF-a受体的使用；2)抗TNF-a抗体的使用；3)小分子 拮抗剂的使用，该拮抗剂可以是肽的或非肽的。本发明公开了嵌合可溶性受体(CSR)蛋白的用途，其中TNF受体的胞外域，其具有
30结合TNF分子的活性，是共价连接到IgG分子的一个域上的。特别是，通过第一个实施例， 如美国专利US5，447，851中公开的，可使用含TNF受体胞外多肽的胞外域的嵌合多肽(重 组嵌合体)，其中的胞外多肽与小鼠IgGl重链多肽的CH2和CH3区连接。已经证明该嵌合 的TNF可溶性受体(在美国专利US5，447，851中也称其为“嵌合TNF抑制剂”)可与高亲和 力的TNF-a结合，且其作为TNF-a生物活性的抑制剂是非常有效的。此外，第二实施例是 嵌合融合构造，它是由TNF受体的配体结合域和Fc抗体(也称作Fc融合可溶性受体)部 分组成的，相对于TNF-a受体其已经被制造出来。本发明还公开了美国专利US5，605，690 所述的可溶性TNF受体Fc融合蛋白，或任一修饰形式的用途。现有研究证实了这种可溶 性TNF受体Fc融合蛋白保持有对TNF a的高结合亲和力。在用作药学拮抗剂的可溶性受体范围内，术语可溶性受体包括，但不限制于(1) 与天然(内源)产生的氨基酸序列或其可溶性片段相对应的可溶性受体，该氨基酸序列或 其片段是由全长的膜受体胞外域组成的，(2)重组可溶性受体，其是全长的，天然存在的受 体氨基酸序列的截短或部分序列，其保留结合相关配体的能力，保留生物活性及其类似物， (3)嵌合可溶性受体，其是由截短或部分序列组成的重组可溶性受体，该序列与全长受体氨 基酸序列胞外结合域的一部分相对应，而全长受体氨基酸序列是通过低聚物(例如，氨基 酸)附着在与IgG多肽(例如，IgG铰合部和Fc域)的一部分相对应的序列上的，其保留 生物活性及结合相关配体的能力。可溶性的，细胞因子受体的胞外配体结合域天然存在于体液中，并涉及细胞因子 生物活性的调节。已经报道过许多造血细胞因子受体(I1-1R，IL-4R，IL-6R，TNFR)的可 溶性截短形式的天然存在状态。例如，可溶性TNFR以约l-2ng/ml的浓度存在于健康受试 者的尿液和血清中。因为缺少信号转导功能，这些细胞因子结合蛋白是由于完全受体序列 (膜-束缚形式)mRNA的选择性剪接，或是由于受体膜束缚形式的蛋白酶剪切和释放而产生 的。虽然这些可溶性截短受体的体内作用还未被完全证实，但它们可作为其互补内源性细 胞因子的生理拮抗剂而发挥作用。这种拮抗的发生是由于(1)游离配体的清除，这种清除 是通过与其相关可溶性受体的结合而进行的，降低了膜束缚受体的有效游离浓度，(2)细胞 因子的作用是在与细胞表面受体结合之后才产生的。TNF- a可溶性受体是作为TNF-R1和TNF-R2的天然拮抗剂，通过与游离配体共同 集合体的这些细胞表面受体相互竞争而发挥作用的。药学上的，TNF可溶性受体可作为拮抗 剂，通过其降低游离配体生物可利用率的能力而发挥作用，而不是通过竞争抑制机制(即， 与膜受体上共同结合位点的内源性配体竞争)发挥作用。将治疗有效量的TNF可溶性受体 加入到关节中可有效地中和配体的生物活性。体内给予重组可溶性受体的试验已经证实了 其抑制炎症应答的能力，并可作为拮抗剂起作用。在本发明中，适于用作软骨保护剂，并与其它软骨保护剂，抗疼痛和/或抗炎剂组 合，从而抑制软骨损坏的药剂包括可溶性TNFR，人嵌合多肽(重组嵌合体)，其包含与人 IgGl的Fc部分相连的TNF-a受体(p80)的胞外域，及抗TNF-a抗体。对于所有局部递 送(即，注射，输注和冲洗)形式而言，各适宜药剂的最佳给药剂量和/或浓度是治疗有效 的。作为一个实施例，对于各个所列药剂来说，提供了含所列药剂的冲洗液的优选和最优选 浓度，期望这种浓度是治疗有效的。表 19
TNF-警体拮抗剂的治疗和优诜浓度化合物治疗浓度(nM)sTNFR0. 1—2000嵌合的rhTNFR:Fc0.1-2000抗TNF-a 抗体0. 2—20003.白介素警体激动剂某些细胞因子是信号糖蛋白，其是滑膜炎和软骨损坏的重要介质。近来对软骨损 害机制的分析表明，不仅促炎主要细胞因子IL-1的绝对水平在决定软骨损伤中非常重要， 而且软骨体内稳态的细胞因子控制也是由分解代谢及合成代谢的调节细胞因子，及合成代 谢生长因子间的平衡支配的。如果IL-10和IL-IRa产物的平衡在有利于IL-10的炎症 状态中改变，那么它将有助于慢性炎症和软骨损坏的发病，如在膝关节外科手术后发生。能 够抑制关节炎症部位促炎细胞因子产生的有效治疗药剂包括抗炎细胞因子，IL-4, IL-10和 IL-13。这些细胞因子可显著减轻体内和体外的关节软骨损坏，这一点是通过它们对各种途 径发挥作用而实现的，所述途径指的是减轻IL-1冲击的途径。因此，抗炎细胞因子如IL-4， IL-10和IL-13可通过下列方法有效地减轻炎症，1)减少促炎细胞因子的产生，2)减少天 然抗炎细胞因子，如IL-IRa的产生，近来，IL-4已经在体内加以证实。IL-4可减轻类风湿性关节炎(RA)患者滑膜中的炎性过程。在类风湿性滑膜中， IL-4可抑制由滑膜片导致的促炎细胞因子的产生，从而抑制滑膜细胞的增殖并减少骨的再 吸收。IL-4还可以通过抑制人关节软骨细胞中基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的合成而促进 直接的软骨保护作用。将应用人关节软骨细胞的细胞培养系统用于评估IL-4对IL-1诱导 的MMP-3的产生及金属蛋白酶-1 (TIMP-1)所起的作用。人们发现，IL-4可抑制IL-1刺激 的MMP-3蛋白和酶的活性。此外，IL-4还抑制IL-1诱导的MMP-3mRNA。iNOS的诱导可由 IL-4，IL-10和IL-3来抑制。因此，在炎性关节疾病中，可见到IL-4作为一种关节损坏的 保护介质而起作用。此外，IL-4对IL-1调节细胞因子水平的平衡所起的作用支持了软骨保护的作用。 IL-4和IL-10均可抑制由新制备的类风湿性滑膜细胞所产生的炎性细胞因子。虽然各白介 素的单独使用均有效果，不过IL-4和IL-10的组合可协同抑制IL-1和TNF- a刺激的IL-6 和IL-8的产生，而对细胞的生存力没有影响。将IL-4加入到滑膜培养物中可增加IL-IRa 的产生，并减少IL-10的产生。近来已经报道过用IL-4进行体内治疗，其通过区别作用 于IL-1 0 /IL-IRa的平衡而促进大鼠试验性关节炎症状的减轻。另一种细胞因子IL-13与 IL-4共有许多特性，其也诱导RA滑膜中的IL-IRa。因此，IL-4和IL-13组合物的局部递 送可提供协同的治疗价值。IL-10具有许多特性，这表明它是一种抑制软骨损坏的良好侯选物质。它抑制 IL-1和TNF- a的释放，并刺激TIMP-1的产生，同时抑制MMP-2。近来已经报道过IL-10在 RA滑膜中的产生，并描述了 IL-10抗炎作用的特性。IL-10可抑制ex vivo RA模型中使用 滑膜片所产生的IL-1 0，但其比IL-4的抑制程度要小。在使用非-局部方法传递细胞因子的关节炎动物模型中，已经发现了 IL-4和 IL-10对软骨损坏的保护效果。在鼠科动物胶原诱导的关节炎模型中，IL-4和IL-10组合 治疗可产生巨大的改善。除了肉眼可见炎症的抑制之外，用IL-4和IL-10组合治疗还可
最优选浓度(nM) 200 200 200以减轻滑膜组织中的细胞浸润，并引起对软骨损坏的显著保护效果。此外，TNF-a和IL-1 的mRNA水平可在滑膜组织和关节软骨中被高度抑制。相反地，IL-1受体拮抗剂(IL-lRa) 的mRNA水平则继续升高，其暗示保护机制可能与TNF-a和IL-1的抑制产生有关，并伴有 IL-lRa/IL-1平衡的正向调节。这些数据与IL-10在炎症应答和关节软骨损坏的内源性抑 制中的主要作用一致，IL-4与11-10的组合治疗显示了潜在的治疗价值。内源性IL-4和IL-10的作用和这些细胞因子对关节炎症和软骨损坏的治疗效果 已经在巨噬细胞依赖的鼠科动物链球菌细胞壁(SCW)关节炎模型的早期阶段中被研究过。 且已经证实内源性IL-10在SCW关节炎的调节中起作用。外源性IL-10的加入进一步扩大 了内源性IL-10的抑制效果。使用IL-4和IL-10的组合物可发现一更显著的效果。这种 组合可使肿胀减轻，并使软骨细胞蛋白多糖的合成增加。用IL-4和IL-10的组合物治疗， 可基本上减少TNF-a的水平，就像用IL-10单独治疗那样，但也导致滑膜中IL-10水平的 显著降低，一种附加的潜在临床作用。总的说来，该数据与IL-4和IL-10作为软骨保护剂 被局部递送到关节从而防止软骨损坏的作用相一致，并显示含IL-4和IL-10的组合物可提 供比单独使用一种药剂更大的有效治疗价值。将重度联合免疫缺损(SCID)小鼠用作模型来评估将IL-4或IL-10体内注射 到人类风湿性滑膜中时，对软骨退化和单核细胞(MNC)募集反应的作用。用重组的人 IL-4 (rhIL-4, lOOng ；rhIL-10, lOOng)，IL-4 和 IL-10 的组合物，或 TNF- a (1000U)，或磷酸 盐缓冲盐水每周两次，共四周注射到来源于五个类风湿性关节炎患者的人类风湿性滑膜和 软骨中。人们发现，人IL-4和IL-10的组合物可抑制人滑膜组织的发病和软骨退化，证明 这些白介素激动剂具有软骨保护作用。已经克隆并测序了人IL-13，且其拥有IL-4的许多特性。IL-13与IL_4的同源性 大约为25%。像IL-4 一样，IL-13可减少由滑液单核细胞产生的促炎细胞因子，包括IL-1 和TNF-a。IL-13显示了体内抗炎作用，因而在关节软骨损伤的治疗中具有治疗有效性。作为IL-4，IL-10和IL-13激动剂有效的化合物包括天然存在的人IL_4，IL-10和 IL-13，人重组IL-4(rhIL-4)，rhIL-lo，和rhIL_13及其部分序列，或肽序列，其已经通过使 用重组DNA技术而被构造，以识别IL-4，IL-10和IL-13受体，且能够激活细胞表面上的这 些受体。其特别包括由抗Fc受体部分和抗IL-4，抗-IL-10，及抗IL-13受体部分组成的多 特异性分子，其中至少一部分是使用重组DNA技术构造的。在用白介素激动剂作为药物激 动剂的情况下，术语白介素激动剂包括，但不限制于⑴肽序列，其与天然(内源性的)产 生的氨基酸序列或其片段相对应，(2)重组白介素，其是全长天然存在的白介素氨基酸序列 的截短或部分序列，其保留结合相关受体的能力，并保留生物活性，及其类似物，(3)嵌合白 介素，一种重组多肽，其是由与全长氨基酸序列的一部分相对应的截短或部分序列组成的， 其中全长氨基酸序列是通过低聚物(例如，氨基酸)附着在与IgG多肽(例如，IgG铰合区 和Fc域)的一部分相对应的序列上的，其保留结合相关受体的能力，并保留生物活性。适于本发明的白介素激动剂的实施例列在下面。对于所有局部递送(例如，注射， 输注和冲洗)形式来说，各个适宜药剂的最佳给药剂量和/或浓度是治疗有效的。作为一 个实施例，对于各所列药剂来说，提供了含所列药剂的冲洗液的优选及最优选浓度，期望这 种浓度是治疗有效的。表 20
白介素激动剂的治疗和优诜浓度
化合物治疗浓度(nanomolar)(nanomolar)
rhuman IL-40. 5-5，0005-500
rhuman IL-100. 5-5，0005-500
rhuman IL-130. 5-5，0005-500
4.转化生长因子超家族激动剂
转化生长因子(TGF-0)超家族成员是25kD的，能够影响各种细胞功能的多效
多功能蛋白，已知其涉及组织的修复和再成型(remodeling)。在许多情况中，它可提高细 胞与胞外基质(ECM)的相互作用，并通过刺激ECM蛋白和蛋白酶抑制剂的分泌和产生而增 加ECM的积聚。TGF-0与其它细胞因子具有协同的相互作用，通常显示抗炎活性。人们已 经鉴定了 TGF-0的多种同型，其共有类似的氨基酸序列同源性。在人的组织中已经发现了 TGF-0 1，TGF-0 2和TGF-0 3，虽然它们的结合亲和力不同，但它们均在哺乳动物细胞中发 挥作用。TGF-0超家族成员是软骨细胞增殖，分化和胞外基质积聚的有效调制剂。在软骨 器官培养物中，TGF-0 1可调节蛋白多糖的代谢并通过兔关节软骨细胞刺激胶原和糖胺聚 糖的合成。此外，TGF-0 1可增加TIMP在人关节软骨细胞中的表达，并减量调节IL-1受体 在关节软骨中的表达。骨形态发生蛋白(BMPs)是细胞生长，分化和编程性细胞死亡的多功能调节剂，其 属于转化生长因子(TGF-0)超家族。已经鉴定了超过一打的哺乳动物BMP蛋白家族成 员，其中可根据它们的结构将其亚分类为许多组。BMP-2和BMP-4彼此非常相似。BMP-5， BMP-6，成骨蛋白(0P)-1(也称BMP-7)，和0P-2/BMP-8在彼此结构上相似。生长变异因子 (⑶F) -5 (也称软骨衍生的形态发生蛋白-1)，⑶F-6 (也称软骨衍生的形态发生蛋白_2)，和 ⑶F-7形成另一相关组。与BMP-2，BMP-4，BMP-6和0P-1/BMP-7形成对照，其诱导体内骨和 软骨的形成，⑶F-5，⑶F-6和⑶F-7可更有效地诱导软骨和腱-样结构(Wolfman等，1997)。TGF-0超家族成员通过与两种类型的丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合而发挥它们 的作用，这两者对于信号转导而言均很重要(MaSSagUe，1998)。II型受体是组成活性激酶， 其使配体结合的I型受体进行转磷酸化作用。I型受体激活胞内底物，如Smad蛋白，且它是 通过此胞内信号转导特异性的机制而发生的。已经分离出哺乳动物七种不同的I型受体， 最初其被称为活化素受体样激酶(ALK)-1-ALK7。IA型BMP受体(BMPR-IA或ALK-3)和IB 型BMP受体(BMPR-IB或ALK-6)在结构上彼此类似，且特异性地结合BMPs和II型受体。 已经证明ALK-2可结合活化素，但最新的数据显示，它是确定的BMPs，例如，0P-1/BMP-7的 I型受体(Macias-Silva等，1998)。ALK-1在结构上与ALK-2非常相似，但还不知道它的生 理配体。ALK-5和ALK-4分别是TGF-3 (T3R-I)和活化素(ActR-IB)的I型受体。ALK-7 与ALK-4和ALK-5在结构上非常相似，但仍然没有确定它的配体。适于本发明软骨保护溶液的，天然存在的TGF- 0和BMP激动剂及合成的或人重组 (rh)的激动剂可与上述任一 BMP受体相互作用。这里使用的术语“TGF-0和BMP激动剂” 包括其片段，缺失，加成，氨基酸置换，突变和修饰，其保留了天然存在的TGF- 0和BMP激动 剂配体的生物特性。TGF-0或BMP激动剂可单独使用，或作为合成代谢的软骨药剂(成软 骨的或促进软骨基质的修复)与其它TGF-0超家族成员协同组合使用，或与阻断软骨分解代谢的抑制剂组合使用。I型受体可起II型受体下游成分的作用。I型受体胞内信号的特异性是由丝氨酸 /苏氨酸激酶域中的特异性区确定的，其被称为L45环。因此，BMPR-IA/ALK-3和BMPR-IB/ ALK-6 (BMPR-I组)的L45环的结构彼此相同，且它们可转导相似的细胞信号。同样，T ^ R-1/ ALK-5，ActR-IB/ALK-4，和ALK-7 (T ^ R-I组)的L45环彼此相同，且它们可激活相似的底物 (Chen等，1998)。ALK-1和ALK_2(ALK_1组)的L45环与其它的I型受体明显不同，但它们 可激活与BMPR-1组的I型受体相似的底物(Armes等，1999)。各种蛋白可从TGF-0和BMP丝氨酸/苏氨酸激酶受体转导信号。它们之中，被深 入研究过的分子是Smad家族的蛋白。已经鉴定了哺乳动物中多个不同的Smad蛋白，并将这 些蛋白分成三个亚组，即，受体-调节的Smads(R-Smads)，共同配偶体Smads(Co-Smads)，和 抑制Smads。R-Smads来源于具有Co-Smads的复合体，由I型受体直接激活的，并转移到核 中。Smad异聚体直接或通过其它DNA-结合蛋白与DNA结合，从而调节靶基因的转录。Smadl， Smad5和Smad8是由BMPs激活的，Smad2和Smad3是由TGF-3激活的。例如，与Smad4组 合，作为Co-Smad发挥作用的Smad2被转移到核中，它在其中激活介导TGF生物作用的基因 的转录。Smad6和Smad7在结构上与其它Smads无关，并起抑制Smads的作用。已经证明 BMPs可诱导体外和体内新的软骨和骨的形成，并调节软骨细胞的生长和分化。而且，这些蛋 白还涉及软骨修复过程。各种研究已经证实BMPs还可促进和保持成软骨的表型，其是通过 它们在小鸡肢芽细胞培养物和胎儿大鼠成软骨细胞，及兔和牛关节软骨细胞中刺激蛋白多 糖合成的能力表示的。BMPs对于软骨和骨形成的重要性已经通过转基因方法加以证实，其 中研究了特异性BMP基因的剔除。BMP家族的一个成员，成骨蛋白(0P-1或BMP-7)对于正常和病理条件下，如软骨 修复期间的软骨体内稳态似乎特别重要。0P-1似乎是BMP家族的唯一成员，与由成人关 节软骨细胞表达的软骨衍生的形态发生蛋白一起。(Chubinskaya，S.，J. Histochemistry andCytochemistry 48 :239_50 (2000))。0P-1最初是从骨基质中纯化的，并可诱导软骨和 骨的形成。已经克隆出人的0P-1基因，并生产出生物活性的重组0P-1同型二聚体。人重组 0P-1可通过体外人关节软骨细胞来刺激聚集蛋白聚糖和II型胶原的合成。它还可以阻碍 IL-1对这些软骨细胞代谢的有害作用，并阻断纤连蛋白片段介导的牛软骨损伤。这种作用 可通过研究重组人0P-1对人关节软骨细胞的蛋白多糖，前列腺素E2，和IL-1受体拮抗剂产 生的作用加以证实，其中人关节软骨细胞是在有白介素参与的情况下培养的。用0P-1 处理人关节软骨细胞可有效的克服低剂量IL-1 0诱导的蛋白多糖合成的减量调节。而且， 研究发现，0P-1可刺激hyaluronan和CD44人软骨细胞的基质集合要求其它分子的合成。 对0P-1在人成熟软骨中调节和表达的研究证明了 0P-1在软骨保护和修复中的作用，且可 将0P-1用作促进软骨合成代谢和人关节软骨修复的治疗剂。当被植入到体内的骨骼内或骨骼外部位时，0P-1 (BMP-7)诱导软骨和骨的形成。 0P-1愈合全层皮关节软骨损伤的作用是通过下列方法研究的，即穿过兔膝关节的关节软骨 钻两个相邻的孔。0P-1引起关节软骨的愈合及关节表面的再生，其包括类似成熟关节软骨 细胞的细胞。这些资料显示，为了在外科手术创伤后防止人软骨退化并保持关节软骨的生物体 内稳态，本发明实践所用溶液的优选实施方案包括TGF-0超家族成员的局部应用，优选TGF0 2，BMP-7(0P-1)或BMP-2，或通过相同受体发挥作用的等效激动剂，其被这些配体所 用。局部递送可与一种或多种药物组合而进行，其中该药物是软骨分解代谢过程的抑制剂 (例如，MAP激酶抑制剂，MMP抑制剂或氧化氮合酶抑制剂)和/或其它用于抑制疼痛和炎 症的药剂。在使用TGF-0和BMP激动剂作为药物激动剂的情况中，术语TGF-0和BMP激 动剂包括，但不限制于(1)肽序列，其与天然(内源性)产生的氨基酸序列或其片段相对 应，(2)重组TGF- 0 s和BMPs，其是全长的，天然存在的TGF- ^和BMP氨基酸序列的截短 或部分序列，其保留结合它们各自受体的能力，并保留有生物活性及其类似物，⑶嵌合的 TGF-^s和BMPs，其是由截短或部分序列组成的重组多肽，该截短或部分序列与全长氨基 酸序列的一部分相对应，该全长氨基酸序列通过低聚物(例如，氨基酸)附着于与IgG多肽 (例如，IgG铰合区和Fc域)的一部分相对应的序列上，其保留有结合相关受体的能力和生 物活性。适于本发明的TGF-0和BMP激动剂的实施例列在下面。对于所有局部递送(即， 注射，输注和冲洗)形式来说，各个适宜药剂的最佳给药剂量和/或浓度是治疗有效的。作 为一个实施例，对于各所列药剂来说，提供了含所列药剂的冲洗液的优选和最优选浓度，期 望此浓度是治疗有效的。用于传递到关节的外科手术溶液治疗浓度的范围可从其相关受体的各配体的解 离(Kd)常数值来评估。而对于特殊的细胞类型和组织来说，这些值是不同的，下面是BMP-4 的实施例。具有125I-BMP-4的结合试验揭示了特异性，高亲和力结合位点的存在，其具有 llOpM的解离常数，且每个细胞具有约6000个受体。因此，在llnM BMP-4时，配体的结合达 到最大，且有效的受体被完全占据(饱和)。BMP-4功能性受体在原代关节软骨细胞中的存 在已经被证实。表 21TGF-g和BMP-受体激动剂的治疗及优选浓度化合物治疗浓度(nanomolar) 最优选浓度(nanomolar)TGF-旦 10.05-5000.5—100TGF-旦 20.05—5000.5—100BMP-20. 1-20001-200BMP-40.1-20001-200BMP-7(0P-1)0. 1-20001-2005.环加氧酶-2 (Cox-2)抑制剂虽然非类固醇类抗炎药物(NSAIDs)被广泛地用作抗炎剂，但还没有特别研究过 其用作软骨保护剂的治疗用途。NSAID药物直接的分子靶是前列腺素合成途径中的第一个 酶，其被称作前列腺素内过氧化物合成酶或脂肪酸环加氧酶。已经描述过环加氧酶的两种 相关形式，环加氧酶-1或1型(C0X-1)和环加氧酶-2(C0X-2)的特性。这些同功酶作为前 列腺素G/H合成酶(PGHS)-l和PGSH-2是已知的。这两种酶均可催化前列腺素类形成中的 限速步骤，其中前列腺素类的形成是花生四烯酸到前列腺素H 2的转化。C0X-1存在于血小 板和内皮细胞中，并具有基本活性。比较起来，已经在关节的内皮细胞，巨噬细胞，成纤维细 胞和其它细胞中鉴定了 C0X-2，且它的表达是由促炎细胞因子，如IL-1和TNF-a诱导的。
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在发炎的关节中，C0X-2的表达被正向调节，且C0X-2的活性随着其正向调节而增 加，导致前列腺素的合成增加，其中的前列腺素存在于炎性关节病患者的滑液中。关节中前 列腺素(PGs)的细胞源包括活化的软骨细胞，A和B型滑膜细胞及浸润性巨噬细胞。由PGs 调制的关节代谢中重要的细胞功能包括基因表达，胞外基质的合成和增殖。因为C0X-2是 在发炎关节组织中，或在暴露于炎症(例如，由损伤或外科创伤引起的)介质之后表达的， 因此期望C0X-2抑制剂的使用可提供抗炎和软骨保护活性。关节损伤和关节内窥镜外科手术过程可引发炎性关节病的软骨损坏。软骨细胞是 关节软骨中仅有的细胞类型，并通过内源炎性介质，包括PGs的释放而参与它们自身基质 的损坏。研究证明正常人关节软骨细胞中的C0X-2基因表达，蛋白合成和PG释放是由细 胞因子，包括IL-1，TNF-a和IL-6迅速诱导的。mRNA的水平可在细胞因子诱导后2小时 被较早地检测出来，在6小时的时候达到较高水平，并具有至少72小时的非常长的表达持 续时间。同样，人滑膜细胞IL-la和TNF-a活化的细胞培养研究显示C0X-2的表达及前 列腺素E2 (PGE2)的产物显著增加。使用各种NSAIDS，如酮洛芬治疗可消灭诱导的PGE2应 答。在软骨细胞培养系统中，特异性的C0X-2抑制剂化合物NS-398可防止由细胞因子诱 导的PGE2产物的增加，而C0X-1的水平则保持稳定(Morisset，S.，1998，J. Rheumatol. 25 1146-53)。因而，推断出通过激活软骨细胞而阻断PG产生可提供软骨保护作用，其中的软 骨细胞与C0X-2的表达有关。NSAIDS通常被用于骨关节炎或类风湿性关节炎患者的治疗，但它们对这些关节炎 疾病中关节软骨代谢的作用则还有争议。例如，用NSAIDs临床治疗类风湿性关节炎和骨关 节炎对于减轻炎症是成功的。然而，某些对C0X-2没有选择性的NSAIDs，主要是水杨酸盐和 消心痛，可通过损害软骨细胞合成的蛋白多糖而促进骨关节的软骨损坏，而其它NSAIDs则 通过刺激软骨修复而具有某些软骨保护作用。许多研究均已证实，NSAIDS对软骨的作用很 小或没有作用。由于目前用于治疗创伤性关节损伤和外科手术创伤后的滑膜和软骨损伤的 药物很少，因而需要建立各NSAID作用于导致软骨损坏的病理生理机制的独特性能。因为这两种C0X同功酶的药理学不同，因而研制了用于抗炎治疗的同功酶-特异 性(选择性)环加氧酶抑制剂，且已经在关节炎症模型中试验了这些相同C0X-2抑制剂的 一部分。然而，C0X-2抑制剂对软骨蛋白多糖的合成和退化，及滑膜中IL-1，IL-6，IL-8和 前列腺素类的产生的体外作用显示，某些NSAIDs对体内软骨和滑膜中白介素和类花生酸 产生的作用可发生显著的变化，这些参数的综合作用可影响C0X-2抑制剂对软骨完整性的 作用。例如，某些NSAIDS由于提高促炎细胞因子的产生或抑制软骨蛋白多糖的合成而加速 类风湿关节炎的关节损伤。然而，尽管C0X-2特异性抑制剂的临床效果可能发生变化，但 C0X-2的抑制典型地减轻滑膜炎，并减轻软骨损坏的危险。已经开展了各种生物化学，细胞，及动物试验，以评估C0X-1和C0X-2同型抑制剂 的相对选择性。通常，定义选择性的标准是相对于给定的生物化学或细胞试验系统得到的 C0X-1/C0X-2抑制常数(或C0X-2/C0X-1)的比值。该选择性的比值可用于说明不同的酶活 性抑制的绝对IC5(I值，其是在微粒体和细胞试验系统间得到的(例如，稳定表达重组人C0X 同功酶的血小板和巨噬细胞系)。而且，C0X-2的抑制模拟由软骨保护(抑制)细胞因子， 如IL-4引发的抑制作用，其减量调节胞内C0X-2的合成。多于45个NSAIDs和C0X-2抑 制剂的选择性对比显示了 C0X-2对C0X-1相对选择性的排列顺序DuP697 > SC-58451 =celecoxib > nimesulide = me 1 oxicam = piroxicam = NS—398 = RS—57067 > SC—57666 > SC-58125 > flosulide > etodolac > L-745, 337 > DFU-T-614，具有 7nM_17 ii M 的 IC50 值。根据选择性C0X-2抑制剂，如celecoxib和rotecoxib的分子和细胞作用机制，并 根据动物研究，期望当将这些化合物以冲洗液或注射液形式围术期直接用于关节时，这些 化合物可显示软骨保护作用。特别是，期望C0X-2抑制剂是这样一种有效的药物，其在关节 内窥镜手术期间以冲洗液的形式传递，或在外科手术过程或其它关节损伤之前，之中或之 后，被直接注射到关节中。适于本发明的C0X-2抑制剂的实施例在下面列出。对于所有局部递送(例如，注 射，输注和冲洗)形式来说，各适宜药剂的最佳给药剂量和/或浓度是治疗有效的。作为一 个实施例，对于各所列药剂来说，提供了含所列药剂的冲洗液的优选和最优选浓度，期望这 种浓度是治疗有效的。表22
环加氧酶_2抑制剂的治疗和优选浓度
化合物治疗优选浓度(nM)最优选浓度(nM)
rofecoxib0.3-30，00030-3，000
(MK 966)
SC-584510.3-30，00030-3，000
celecoxib(SC-58125)0.3-30，00030-3，000
me1oxicam0.5-50，00050-5，000
nimesulide0.5-50，00050-5，000
diclofenac0.3-30，00030-3，000
NS-3980.3-30，00030-3，000
L-745,3370.2-100|，00020-10|，000
RS570670.2-100|，00020-10|，000
SC-576660.2-100|，00020-10|，000
flosulide0.2-100|，00020-10|，000
6. MAP激酶抑制剂
促细胞分裂剂-激活的蛋白(MAP)激酶是一连L蛋白丝氨麵？ /苏氨酸激酶，其是在
应答各种胞外刺激物，并发挥从细胞表面转导信号至核的作用时被激活的。该MAP激酶级 联是一种主要的胞内信号途径，其从生长因子，激素和炎性细胞因子发射信号至中早期基 因。与其它信号途径结合，这些活化的促细胞分裂剂-激活蛋白-激酶(MAPKs)分别改变 转录因子的活性和磷酸化状态，并最终调节细胞的增殖，变异和与细胞对环境应激的应答。 例如，MAPK家族的成员(p38)从潜在的促炎细胞因子，IL-1和TNF-a介导主要的生物化学 信号途径，从而通过涉及C0X-2基因转录调节的顺式作用因子诱导受刺激巨噬细胞中的环 加氧酶 _2 (C0X-2)。 MAP激酶类药剂的成员是由至少三个家族组成，已知它们的序列，活化环的大小， 及通过胞外刺激物的激活均不同，且它们参与不同的信号转导途径。MAP激酶家族中的主要 成员包括胞外信号调节激酶(ERKs)，ERK1和ERK2 (分别是p44MAPK和p42MAPK)；应激激活的蛋白激酶1 (SAPK1)家族，其也被称作JNK或jun N-端激酶家族；和p38MAP激酶家族，其 还被称为应激激活的激酶2/3 (SAPK-2/3)。P38激酶是通过应激激活的，是最著名的促炎细 胞因子。在P38家族中，至少有四个不同的同源物(同型或同功酶)，其标准的名称分别为 SAPK2a, SAPK2b, SAPK2d, SAPK3,或 p38 a，旦，S (SAPK4)禾口 Y。用于本发明的 MAP 激酶抑 制剂可与上述任一 MAP激酶或其组合相互作用。对于特异性MAP激酶抑制剂来说，通过体 外酶纯化的试验方法和细胞试验方法表征的抑制常数可在较宽的浓度范围内变化，并证明 了其在此应用中的功用。P38MAP激酶的活化是由苏氨酸和丝氨酸残基的双重磷酸化作用 介导的。已经证明用TNFa和IL-1处理细胞均可迅速(5分钟内)增加磷酸化作用并激活 P38MAP 激酶。先前工作已经证实小分子抑制剂可特异性地抑制P38MAP激酶(Lee，J.等， Nature 372:739-746(1994)并在各种动物模型中产生生物化学水平的抗炎作用。Cuenda 和合作者(Cuenda，A.等，F^SLett. 264 229(1995))证明，化合物，SB203580[4-(4-氟苯 基)-2- (4-甲基亚硫酰基苯基)-5- (4-吡啶基)咪唑]体外抑制p38 (IC50 = 0. 6 u M),抑制 激活蛋白激酶_2的MAPK的活化，并阻止热激蛋白(hsp) 27在应答IL-1和细胞应激时的体 内磷酸化作用。可抑制P38的SB203580的激酶选择性是通过对至少15个其它蛋白激酶， 包括PKC，PKA，src和受体丝氨酸激酶家族体外的微弱抑制或抑制的失败加以证实的(Lee， J. Pharmacol. Ther. 82 :389_397 (1999))。在细胞研究中，预先用 SB203580 培养可阻断 IL-1 和TNF-a诱导的酶磷酸化作用及后来IL-8的产生。其支持在外科手术过程期间传递抑制 剂的优选作用。已经使用特异性抑制该酶的SB203580研究p38促细胞分裂原-激活的蛋白激酶 (MAPK)在导致软骨损坏的生物化学炎症应答中的作用。IL-1，其是由p38MAPK选择性控制 的，的作用是调节前列腺素H合成酶-2 (C0X-2)，金属蛋白酶，和IL-6 (Ridley, S等，1997， J. Immunol. 158 :3165_73)。在人成纤维细胞和血管内皮细胞中，SB203850抑制(IC50 = 0. 5 u M) IL-1诱导的成纤维细胞中hsp 27 ( 一种p38MAPK活性的指示物)的磷酸化作用，而 不会影响其它已知的IL-1激活的蛋白激酶途径(p42/44MAPK，p54MAPK/C-Jun N-端激酶)。 此外，SB203580可显著抑制IL-1刺激的IL-6 (1 y M时，约30-50% )，而没有IL-8从人成 纤维细胞和内皮细胞产生。重要地，SB203580强烈地抑制IL_1激发的，成纤维细胞和人内皮细胞的前列腺素 产生。其与C0X-2蛋白和mRNA诱导的抑制有关。PGE2有助于增加基质金属蛋白酶的表达， 所述基质金属蛋白酶是软骨退化的重要介质。当被细胞因子和胞外刺激物激活时，滑膜成 纤维细胞和软骨细胞均可高水平地表达C0X-2基因。MAPK抑制剂由于其对MAP激酶的抑制 活性而提供软骨保护活性，其中该MAP激酶是在这些和其它细胞类型中表达的。当局部用于各种炎性或病理生理疾病的关节组织时，期望MAPK抑制剂作为软骨 保护剂是有效的。在许多体内药理模型中均已经描述过SB203580的特性，且证明在口服给 药时，其具有长期的活性。SB203580可抑制IL-1产生的胶原酶_1和溶基质素_1的刺激， 而不影响TIMP-1的合成。此外，SB203580可防止IL-1-激发的胶原酶_1和溶基质素mRNA 的增加。在软骨损坏模型中，短期IL-1激发的蛋白多糖重吸收和蛋白多糖合成的抑制不受 SB203580影响，但可防止长期的胶原损害。此外，SB203580可有效抑制IL-1诱导的牛关节 软骨外植体和软骨细胞中氧化氮的产生(Badger 1998)。这些体外观察为MAP激酶抑制剂的软骨保护活性提供了依据，其中该可被MAP激酶直接或局部给予到这些关节组织中。p38MAP激酶涉及TNF-诱导的细胞因子表达，且作为p38MAP激酶活性抑制 剂而发挥作用的该药物可阻断促炎细胞因子的产生(Beyaert，R.等，EMBO J. 15 1914-23(1996))。用TNF a处理细胞可激活p38MAPK途径，这是通过p38MAPK自身磷酸化 作用的增加及其底物蛋白的活化加以证实的。用SB203580预处理细胞可完全阻断TNFa 诱导的激活蛋白激酶_2的MAPK的激活及hsp27的磷酸化作用。在相同条件下，SB203580 还可完全抑制TNFa诱导的IL-6合成及报道基因的表达，其是由含两种NF-6B因子的最小 启动子驱动的。因此，这些研究及对其它P38抑制剂的相关研究证明了抑制剂，如SB203580 和FR133605对p38MAPK作用的选择性，其选择性地阻碍TNF- a和IL-1诱导的，与软骨退 化有关的蛋白的活化。因此，通过抑制受体下游的激酶来选择性抑制这些重要促炎细胞因 子的MAP激酶信号途径证明了 MAP激酶抑制剂可提供软骨保护作用。已经在很多细胞因子抑制和炎症疾病的动物模型中评估了 SB203580。证实了它是 一种有效的，具有15_25mg/kg IC5Q值的大鼠和小鼠体内炎性细胞因子产生的抑制剂。50mg/ kg给药剂量的SB203580在DBA/LACJ小鼠的胶原诱导关节炎中具有治疗活性，其可显著抑 制爪的炎症。当以30和60mg/kg/天的剂量p.o.给予SB203580时，可在Lewis大鼠辅剂 诱导的关节炎中观察到抗关节炎的活性。附加的证据是相对于具有0.6 yM IC5(I的骨重吸 收有益效果得到的。总之，各种生物化学，细胞和动物研究显示P38MAPK在调节对IL_1和TNF- a的应 答中起重要的作用，且其涉及某些炎性应答基因，如C0X-2mRNA水平的调节。p38抑制剂可 阻断促炎细胞因子的生产并抑制MMPs的产生，且已证实可抑制软骨外植体中胶原的损坏。MAPK抑制剂阻断重要的促炎细胞因子，如IL-1和TNF-a作用的用途对于关节中 的许多细胞类型，包括滑膜成纤维细胞，巨噬细胞，和软骨细胞均有有益的作用，从而抑制 后来的病理作用，如炎性细胞到关节的浸润，滑膜的增殖，滑膜细胞的活化，和软骨的损伤。 因此，MAPK抑制剂应通过前述细胞因子阻断炎症应答的增殖，由此干扰疾病过程。适于本发明的MAPK抑制剂的实施例列在下面。对于所有局部递送(即，注射，输 注和冲洗)形式来说，各适宜药剂的最佳给药剂量和/或浓度是治疗有效的。作为一个实 施例，对于所列药剂来说，提供了含所列药剂的冲洗液的优选和最优选浓度，期望这种浓度
是治疗有效的。
表23
MAP激酶抑制剂的治疗和优选浓度
化合物治疗浓度(nanomolar)优选浓度(nanomolar)
SB 2035800. 5-50，00050-5, 000
SB 203580 碘0. 5-50，00050-5, 000
SB 2021900. 2-20，00020-2，000
SB 2422350. 2-10，00020-1，000
SB 2200250. 2-10，00020-1，000
RWJ 676570. 3-30，00030-3，000
RWJ 683540. 9-90，00090-9，000
FR1336051-100，00010-10，000
L-1673070. 5-50,00050-5,000PD 980590.1-10,00010-1000PD 1693161-100，00010-10，0007.基质金属蛋白酶的抑制剂关节软骨损伤是关节疾病，如骨关节炎和类风湿性关节炎中的一个共同特征，但 也发生在关节损伤之后。病理生理学地，可观察到蛋白多糖和胶原的结构损坏，其损害软骨 的生物活性特性。正常健康的胞外基质的维持可反映基质组分掺入及生物合成速率间的平 衡，它们的退化速率和随后从软骨到滑液中的损耗。各种蛋白酶均有使软骨裂开的潜力，且 其涉及退化过程，特别是基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶(MMPs)，或matrixins，是一族至少15个的锌内肽酶，其在胞外发 挥作用，并在组织病理退化中起重要的作用。表23提供了 MMP成员目前的命名及选择性名 称。很多MMPs均被高度调节，且很多均不是在正常组织中基本表达。然而，促炎细胞因子， 如IL-1和TNF- a，引发转录和表达。由使组织退化的MMPs的激活和正向调节所产生的不 平衡是慢性炎症疾病和关节损伤后持续的滑膜炎症应答过程中，软骨损坏过程的主要成因 因素。已经在膝部meniscal损伤或先前交叉韧带断裂的患者中研究了软骨基质的代谢。溶 基质素-1(MMP_3)，胶原酶，金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)和蛋白多糖片段的浓度在创 伤性膝损伤后的人膝部滑液中增加。暂时地，这些值立即增加，超过参考水平，并在一年以 上的时间内显著地保持升高(10倍增加)。这些变化可能促进蛋白多糖片段浓度的增加，其 是在膝部韧带损伤后，在滑液中观察到的。表 24基质金属蛋白酶MMP 可供选择的名称 EC号
MMP-1 胶原酶
成纤维细胞 胶原酶 间质的 胶原酵
EC3. 4. 24. 7
底物
胶原(I, II II，VII，和 X);明胶； 聚集蛋白聚糖；透明质酸酶-处理的多能聚糖；蛋白多糖连接蛋白； 大腱生蛋白-C; a ,-抗胰蛋白酶 /- 1蛋白酶抑制剂((！1-八丁)； a, 抗凝乳蛋白酶(a ,-ACHYM)； a 2 M; 大鼠onM;任娠区蛋白； 大鼠a丨13 (a,-抑制剂3); ovostatin;巢蛋白；MBP; GST-TNF/TNF 肽；L-选择；IL-1 P ； 血清淀粉状蛋白A; IGF-BP5; MMP-2; MMP-13_
MMP-2 72-kDa 明胶酶 EC3. 4. 24. 24 明胶酶A IV型胶原酶 嗜中性明胶酶
胶原(I，IV, V, VI，X, XI，和 XIV); 明股；弹性蛋白；纤连蛋白；层粘连 蛋白-1，层粘连蛋白-5;明胶-3;聚 集蛋白聚糖；核心蛋白聚糖；透明质 酸酶-处理的多能聚糖；蛋白多糖连接 蛋白；骨粘连蛋白；MBP; GST- TNF/ TNF 肽；IL-1 p ； A P ,-4o ； A p ,0-20； APP6,5 ； a i-AT; prolysyl 氧化薛融合 蛋白；IGF-BP5; IGF-BP3; FGF R1; MMP-1; MMP-9； MMP-13_
MMP-3 溶基质素-1 EC3.4. 24. 17 Trans in
股原(III, IV，V，IX);明胶；聚集蛋白 多糖；多能聚糖和透明质酸酶-处理的
聚集蛋白聚糖；弹性蛋白；蛋白多糖 连接蛋白；MMP-1; MMP-8MMP--11溶基质素-3人的酶a 1 -AT; a 2M ；路蛋白， 层连蛋白，纤连蛋白，明胶，胶原IV 和羧甲基化的转铁蛋白MMP--12巨噬细胞 Metalloelastase胶原IV;明胶；弹性蛋白和K-弹性蛋白； 酪蛋白；cu -AT;纤连蛋白；玻连蛋白；层 连蛋白；议定菌素；蛋白多糖单体；GST-TNF; MBP;纤维蛋白原；纤维蛋白；纤溶酶原MMP--13胶原酶-3胶原(I, II 和 III，IV，IX，X 和 XIV);明胶， a , -ACHYM和纤溶酶原激活剂抑制剂2; 聚集蛋白聚糖；基底膜聚糖；大腱生蛋白 -C;骨粘连蛋白；MMP-9MMP--14MT-MMP-1胶原(I, II and III);明胶，酪蛋白， K-弹性蛋白；纤连蛋白，层连蛋白， 玻连蛋白和蛋白多糖；大腱生蛋白-c，议定菌素； a ,-AT, a2 M; GST-TNF; MMP-2; MMP-13MMP--15MT-MMP-2纤连蛋白，大腱生蛋白-c，议定菌素，层连 蛋白，聚集蛋白聚糖，基底膜聚糖； GST-TNF; MMP-2MMP家族的酶是从人软骨细胞和滑膜细胞，如滑膜成纤维细胞中分泌的。此外，使 用原位杂交，人滑膜可合成溶基质素-1和胶原酶。溶基质素-1 (MMP-3)能够使软骨基质的 所有组分退化。有证据证明软骨细胞通过使基质退化的酶，胶原酶_3的释放，而有助于软 骨退化。MMPs以潜伏形式的细胞中分泌，在胞外被激活，并被金属蛋白酶(TIMPs)的组织抑 制剂所抑制。MMPs和TIMPs活性间的平衡对于完整软骨基质的保持是非常重要的。在病理 条件，如骨关节炎和类风湿性关节炎的条件下，许多研究均已经证明MMPs量的升高，其导 致MMPs和TIMPs间的不平衡，这种不平衡被认为是所观察到软骨损坏的原因。MMPs是由细胞因子，如白介素-l(IL-l)，和生长因子调节的，其作用于软骨细胞 和滑膜细胞，从而提高它们蛋白酶的产生。其它促炎细胞因子，如IL-6，IL-8和TNF-a 2也 可正向调节基质-退化酶的产生。其导致软骨损坏，其通常是由硫酸化糖胺聚糖(GAGs)的 损耗和胶原的分裂来评估的。IL-1，其存在于关节病患者的关节液中，刺激软骨细胞合成的酶，如溶基质素，成纤维细胞和嗜中性胶原酶，及纤溶酶原激活剂的量增加。此外，IL-1抑制 纤溶酶原激活剂的抑制剂-1和TIMP的合成，还抑制基质组分如胶原的合成。抑制剂和酶水 平间的不平衡导致活性蛋白酶的量增加，并与基质生物合成的抑制相结合，导致软骨退化。使用软骨切片作为体外模型，已经证实了胶原酶抑制剂可通过类风湿性滑膜成纤 维细胞(RSF)抑制IL-1或IL-8激发的关节软骨损害。胶原酶抑制剂，1，10-邻-菲酮和膦 酰二肽，基本上抑制了 10-150 yM浓度RSF细胞以浓度依赖的方式渗透进软骨中。细胞因子 对蛋白酶分泌的选择性作用证明了滑膜成纤维样细胞介导的关节退化是一种高度调节的 过程。因此，期望局部抑制关节中的蛋白酶活性及有关的关节基质退化的能力能够抑制软 骨损坏过程。抑制剂在有限的体外系统中的作用表明，局部递送具有适宜pharmokinetics 的合成MMP抑制剂的治疗干预作为软骨保护剂是有效的。适于本发明的MMP抑制剂的实施例包括U-24522 ((R，S) _N_ [2~ [2~ (羟基氨 基)-2-氧乙基]-4-甲基-1-氧戊基]-L-亮氨酰-L-phenylalaniamid)，肽如MMP抑制剂 I和MMP-3抑制剂，和较大的蛋白，如TIMP-1或其片段，并将其列在下面的表中对于所有 局部递送(即，注射，输注和冲洗)形式来说，各适宜药剂的最佳给药剂量和/或浓度是治 疗有效的。作为一个实施例，对于各个所列药剂来说，提供了含所列药剂冲洗液的优选和最 优选浓度，期望这种浓度是治疗有效的。表25
基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂的治疗和优选浓度
化合物治疗浓度最优选浓度
(nanomolar)(nanomolar)
U-245220. 2-2，00020-200
米诺环素30-500, 000300-3，000
MMP抑制剂I0. 3-3，0003-600
4-Abz-Gly-Pro-D-Leu-D-Ala-NHOH
MMP-3抑制剂0. 5-5，0005-500
Ac-Arg-Cys-Gly-Val-Pro-Asp-NH2
Rhuman TIMP10. 5-5，0005-500
Rhuman TIMP20. 5-3，0003-600
膦酰二肽1，000-500，0005，000--100, 000
8.核因子kB(NFkB)的抑制剂
促炎和软骨损伤的细胞途径是由胞外和胞内信号机理调节的，;其是新的治疗性局
部药物传递的靶。通过促炎细胞因子白介素-l(IL-l)利用的，可激活转录因子，核因子 KB(NFKB)的完全分子信号机制被较差地定义。然而，与基因转录水平的胞内信号有关的 重要分子是促炎转录因子，(NFKB)。NFKB的活性是由一族转录因子亚单位所介导的，其 可与同型二聚体或异型二聚体形式的DNA相结合。由于被称作I k B的抑制亚单位的结合， 这些亚单位典型地是以非活性形式存在于细胞胞质内的。IL-1受体和其它胞外信号的激活 可导致I k B的降解及伴生的NFK B从抑制剂上的分离，然后转移到核中。NFK B，涉及IL-1 诱导的表达，且能够增加促炎C0X-2蛋白在RA滑膜成纤维细胞中的表达。
NFKB作为重要分子靶的鉴定是以其作为共同下游信号因子的作用为基础的，该 共同下游信号因子可调节许多与关节炎症和软骨损害途径有关的重要炎性介质的基因表 达。许多基因(C0X-2，胶原酶，IL-6，IL-8)的应答均是由启动子支配的，该启动子包含 NFkB启动子因子。NFKB的激活可介导滑膜细胞中，许多对于炎症过程非常重要的蛋白的 诱导，如细胞因子，细胞_粘附分子，金属蛋白酶和其它参与滑膜细胞中前列腺素和白三烯 (C0X-2)产生的蛋白。因而，此转录因子代表一种生理上非常重要的靶，其在治疗中直接对 准人滑膜成纤维细胞，人关节软骨细胞，及其它关节细胞对损伤的应答。特别是，已经证明人类风湿性滑膜成纤维细胞(RSF)在白介素1 0 (IL-1 0 )上的 暴露导致85kD的磷脂酶A2(PLA2)和诱导型环加氧酶(C0X-2)的共同正向调节。这两个酶 均可促进随后PGE2，关节中一种主要的炎性介质的生物合成。将寡核苷酸诱捕器和反义用 于证实NFkB参与了前列腺素类代谢酶的调节。使用反义寡核苷酸拮抗NFKB的mRNA，可 导致与C0X基因启动子结合的减少。Hymenialdisine，一种天然的海产品，近来已经证明了它是NFk B的激活，及IL-1 刺激的RSF抑制的PGE2产物以浓度依赖方式(IC50 = 1 u M)暴露的抑制剂。分子靶的特 异性是通过使用类似物，aldisine，和蛋白激酶C抑制剂，R032-0432，其是非活性的，证明 的。Hymenialdisine对IL-1诱导的NFk B激活的直接作用是通过与典型k B共有序列基 序相结合的NFk B的显著减少，及对受刺激的p65从所处理细胞的细胞溶胶迁移的抑制加 以证实的。像所期望的一种NFk B转录调节的抑制剂一样，hymenialdisine-处理的RSF不 能转录应答IL-1的C0X-2或PLA2的mRNA。因此，可观察到这些酶诱导的蛋白水平的下降 和产生PGE2的诱导能力的降低。此外，IL-1-刺激的白介素-8(IL-8)产物，已知其是一种 NF k B-调节事件，也是由hymenialdisine抑制的，而IL-1诱导的血管内皮生长因子，一种 非-NFk B-调节的基因，的产生不受暴露于hemenialdisine的影响。因此，hymenialdisine 可通过其对NFk B激活的抑制作用来抑制IL-1-刺激的滑膜成纤维细胞中PGE2的形成。其 为定义它作为新的抑制剂，阻断NF k B在关节炎症和软骨损伤中的作用提供了基础。适于本发明的NFKB抑制剂的实施例列在下面。对于所有局部递送(即，注射，输 注和冲洗)形式来说，各适宜药剂的最佳给药剂量和/或浓度是治疗有效的。作为一个实 施例，对于所列各药剂来说，提供了含所列药剂的冲洗液的优选和最优选浓度，期望这种浓 度是治疗有效的。表 26NFKB抑制剂的治疗和优选浓度化合物治疗浓度(nanomolar)最优选浓度(nanomolar)咖啡酸苯基乙基酯(CAPE)1-100,000 50-20，000DM-CAPE0. 5-50,000 50-5,000SN-50 月太0. 1—100，000 100—20，000Hymenialdisine1-100,000 100-10,000Pyrolidone dithiocarbamate 1-50,00050-10,0009.氧化氮合酶抑制剂氧化氮(N0)是一种广泛分布于胞内和胞外的介质，其涉及某些相关组织疾病的 病理生理机制。N0是通过一族酶，N0合酶从L-精氨酸形成的，该酶是胞内定位的。已经克隆可测序了 NO合酶的三种同型。内皮细胞NO合酶(ecNOS)和脑NO合酶(bNOS)基本上是 活性的。NO合酶不同的同型，诱导型NOS(iNOS)，可在多种细胞类型，包括软骨细胞中找到。 它在基础条件下很少，但它在应答促炎介质如IL-10和TNF-a时被正向调节。近来的发 现表明IL-1是一种非常有效的软骨细胞NO合酶的刺激剂，且IL-1通过其正向调节iNOS 的水平而发挥作用。在关节内，软骨细胞是NO的主要源，且由促炎细胞因子诱导的软骨细 胞iNOS被认为可介导炎性关节病中IL-1的多种作用。特异性抑制软骨细胞诱导型NO合酶(iNOS)的药物具有防止因关节损伤(例如， 关节的外科手术过程)产生的软骨损伤的治疗作用。支持这种有益治疗效果的证据是以 许多基本研究为基础的，这种基本研究评估了各种iNOS抑制所培养软骨细胞及骨关节炎 患者软骨外植体中的诱导型NO合酶活性的能力。一类化合物，被称为S-取代的异硫脲， 是一种有效的，软骨中NO生物合成的抑制剂。S-甲基异硫脲和S-(氨基乙基)异硫脲 的有效性比单甲基-L精氨酸高2-4倍，比氨基胍高5-10倍，比N"-硝基-L-精氨酸 及N"-硝基-L-精氨酸甲基酯高300多倍。这些异硫脲化合物可提供一种有效的，对软 骨中的iNOS具有相对特异性的抑制剂，从而适于本发明的局部递送(Jang，D.，1996，Eur. J.Pharmacol. 312-341347)。使用体外系统，如分离的软骨细胞定义对软骨基质的作用，从而可评估N0合酶抑 制剂的软骨保护的治疗有效性。通过单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)，一种已经公开的N0 合酶抑制剂，抑制内源性NO的产生，可抑制由IL-1 刺激的软骨细胞所产生的明胶酶，胶 原酶和溶基质素。抑制N0的产生还可部分降低乳酸盐产物的增加，其中乳酸盐产物是从软 骨细胞在IL-10上的暴露而出现的。用L-NMMA处理软骨片段，可使IL-10抑制糖胺聚糖 合成的作用逆转，抑制IL-10刺激的MMP活性，增加IL-1受体拮抗剂(IL-lra)的产生。NO 还可通过减少TGF-0 1的产生而间接调制蛋白多糖的合成，其中TGF 0 1是由于软骨细胞 在IL-10上的暴露而产生的。它还可防止自分泌-刺激的TGF 的增加，从而消除此软 骨中的细胞因子的合成代谢作用。一个研究已经比较了新的氨基胍，S-甲基异硫脲(SMT)，S-氨基乙基异硫脲 (AETU)，L-NMMA和N-硝基_L_精氨酸甲基酯(L-NAME)NOS抑制剂对重组人IL-1 0应答 蛋白多糖合成和N0产生时的抑制作用的有效性。不同的培养系统是以浓度依赖方式应答 IL-10攻击的，其中N0产物大大增加，且蛋白多糖的合成被显著地抑制。上述N0S抑制剂 (1-1000 uM)抑制了用IL-10处理的软骨细胞所产生的N0，且其对恢复软骨细胞中蛋白多 糖的合成具有显著的作用。因此，如果使用治疗有效浓度和剂量可阻断N0的产生，那么可 以防止IL-10抑制蛋白多糖的合成。N0合酶是在从关节炎病患者关节中得到的软骨中表达的。在类风湿性关节炎或 骨关节炎患者中，可观察到滑液中亚硝酸盐的水平增加，且证明了这些患者中N0产物的重 要的源是得自关节软骨。此外，L-NIL，一种有效的iNOS抑制剂的持续全身传递可减轻狗 试验性0A(是由ACL的解剖诱导的)的发展，并引起IL-1 0，PGE2，N0和MMP产物的基本下 降。这些发现暗示了 N0是一种有效的，IL-10作用的调节剂，并有助于关节疾病的病理生 理学。因此，这些体外和体内结果表明特异性的N0合酶抑制剂是临床治疗滑膜炎的有 效的新药物，且当将其与一种或多种药物组合局部递送时，可提供软骨保护作用，其中的一种或多种药物选自用于治疗外科手术处理过的关节或其它损伤的关节的抗炎，软骨保护， 和抗疼痛类药物。适于本发明的NO合酶抑制剂的实施例列在下面。对于所有局部递送(即，注射， 输注和冲洗)形式来说，各适宜药剂的最佳给药剂量和/或浓度是治疗有效的。作为一个 实施例，对于所列的各个药剂来说，提供了含所列药剂的冲洗液的优选浓度和最优选浓度， 期望这种浓度是治疗有效的。在一个实施方案中，用于本发明溶液中的优选NO合酶抑制剂 是1400W((N-3-(氨基甲基)苄基)乙脒)，一种选择性的，缓慢的，紧密结合的iNOS抑制 剂，diphenyleneiodinium 禾口 1,3-PBIT。表 27氧化氮合酶抑制剂的治疗和优选浓度化合物治疗浓度(P M) 最优选浓度(P M)NG_ 单甲基-L-精氨酸 50,50,0003,0001400ff-diphenyleneiodium 0.1-1,0001-20S-甲基异硫脲 1-1，00010-100S-(氨基乙基)异硫脲 1-1,00010-100L-N6-(l-亚氨基乙基)赖氨酸 1-1,00010-1001,3-PBITU 0.5-5005-1002-乙基-2-thiopseudourea 2-20,00020-2,00010.细胞粘着分子10a整联蛋白的激动剂和拮抗剂整联蛋白是位于质膜上的异型二聚体，其包含结合配体的a和0亚单位，该配 体是胞外基质(ECM)成分或可以是其它大的蛋白，如胶原，层连蛋白，玻连蛋白，骨连蛋白 (0PN)和纤连蛋白(FN)。软骨基质的退化是根据这些细胞与ECM相互作用的机制，由软骨 细胞调节的。软骨细胞基因的表达是，部分地，通过细胞接触而控制的，这种细胞结合包括 整联蛋白与软骨细胞周围环境中的ECM成分的相互作用。因此，软骨细胞上的整联蛋白涉 及软骨体内稳态的控制，且此族受体代表一类可防止软骨退化的治疗的靶。人软骨细胞可表达一系列由不同的a和日亚单位，包括aJi，aji，aV^* 其它量较少的亚单位组成的整联蛋白受体。其中特别重要的是a 整联蛋白，已知其结 合0PN。阻断单克隆抗体(mAb) LM609的a V 0 3复合体-特异性功能作为与配体0PN相似 形式的激动剂起作用。它可减少很多促炎和软骨损坏介质，如IL_1，N0和PGE2的产生。因 此，激动剂mAb LM609有适于本发明使用。此外，已经在II期临床中研究了两种p印tidomimetic，MK-383 (Merck)和 R0-4483 (Hoffmann-LaRoche)。因为这些均是小分子，因此他们的半衰期较短，效能较高。然 而，似乎它们与其它密切相关的整联蛋白相互作用的特异性较小。这些p印tidomimetics 也适于本发明。表 28整联蛋白的治疗和优选浓度药剂的种类治疗浓度(P g/ml) 优选浓度(P g/ml)整联蛋白
a V 旦 3mAB LM 6090. 05-5, 0005-500锯鳞血抑月太(echistatine)0. 1-10，000100-1，00011.抗-趋化剂抗趋化剂可防止炎性细胞的趋化性。可发挥作用的抗趋化靶的代表性实施例包 括，但不限制于，F-Met-Leu-Phe受体，IL-8受体，MCP-1受体，和MIP-1-I/RANTES受体。很 早就已经研究了此类药剂中的药物，但它们适用于本发明的情况还未被理论化。12.胞内信号抑制剂12a.蛋白激酶抑制剂i.蛋白激酶(PKC)抑制剂蛋白激酶C(PKC)在许多生理过程中的细胞表面信号转导中起重要的作用。PKC同 功酶可作为下游靶被激活，该靶是由G蛋白偶联受体(例如，5-羟色胺，缓激肽等)或促炎 细胞因子的最初活化所引起的。这些受体种类均在介导软骨退化中起重要的作用。分子克隆分析显示，PKC作为由至少8个亚种(同功酶)组成的一大族而存在。 这些同功酶的结构及连接受体活化与特异性细胞增殖应答的变化的机制基本不同。特异性 同功酶可在各种细胞类型表达，包括滑膜细胞，软骨细胞，嗜中性白细胞，骨髓细胞，和平滑 肌细胞。因此PKC的抑制剂很可能影响多种细胞类型的信号途径，除非该抑制剂具有同功 酶特异性。因此，可预测PKC的抑制剂对于阻断滑膜细胞和软骨细胞的激活是有效的，且 可能具有阻断嗜中性白细胞激活及随后附着的抗炎作用。已经描述了很多抑制剂，最初的 报道表明，50iiM的IC5(1可用于抑制钙感光蛋白C的活性。G-603(也叫Go 6976)是一种 新的，有效的PKC抑制剂，其对于某些具有2-10 u M IC50值的PKC同型具有高度的选择性。 下面列出这些和其它药物的浓度，GF109203X，也叫Go 6850或bisindoylmaleimide (从 Warner-Lambert购得)，相信它们适用于本发明。表 29软骨损坏抑制剂的治疗浓度和优选浓度药剂种类治疗浓度优选浓度(Nanomolar)(Nanomolar)蛋白激酶C抑制剂钙感光蛋白c0.,5-50:’ 000100-5，000
GF 109203X0.1-10，0001-1，000
G-6203 (Go 6976)0.1-10，0001-1，000ii.蛋白酪氨酸激酶的抑制剂虽然很多受体酪氨酸激酶(RTK)家族成员间存在着巨大的差异，但这些受体的信 号机制共有许多共同的特征。生物化学和分子遗传研究显示配体与RTK胞外域的结合可迅 速激活胞内域内在酪氨酸激酶的催化活性(见图5)。活性增加导致许多胞内底物的酪氨酸 特异性磷酸化作用，其中的胞内底物包括一个共有序列基序。因此，其引起很多“下游”信 号分子和胞内途径级联的激活，其中该胞内途径级联可调节磷脂代谢，花生四烯酸酯代谢， 蛋白磷酸化作用(包含除蛋白激酶之外的机制)，钙活动化和转录活化(见图2)。RTK胞质 域的生长因子依赖性酪氨酸激酶的活性是胞内信号产生的主要机制，其导致细胞增殖。因 此，抑制剂具有阻断此信号的有效性，并由此防止滑膜细胞和软骨细胞的活化。
各种酪氨酸磷酸化抑制作用化合物的任意一种作为酪氨酸激酶活性(o．5一1．o u M范围内的体外工C。。)的特异性抑制剂均具有有效性，这是因为它们对其它蛋白激酶和其它信号转导系统几乎没有作用。仅有一小部分酪氨酸磷酸化抑制作用化合物可从商业上得到，用于本发明的这些药剂的适宜浓度在下面列出。此外，已经报道过星形孢菌素，并证实了其对SrC超家族许多蛋白酪氨酸激酶的潜在抑制作用，用于本发明的此药剂的适宜浓度在下面列出。
表30
抑制剂的治疗和优选浓度
治疗浓度优选浓度
药齐0种类(Nan。m。lar)(Nan。m。lar)
蛋白激酶抑制剂
薰草菌素Alo—lOO，000lOO—lo，000
酪氨酸磷酸化抑制剂 lo—lOO，000lOO—lo，000
AGl296
酪氨酸磷酸化抑制剂 lo—lOO，000lOO—lo，000
AG 1295
星形孢菌素卜lOO，000lo—l，000
PD 158"／80o．1一lo，000lo一500
PD 174265o．1一lo．000lo一500
12b．胞内蛋白酪氨酸磷酸酶的调制剂
含SrC一同源物，SH2域的非一跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPaSeS)是已知的，根据命名之左称它什]为SH—PTPl矛口SH—PTP2。此夕＼，SH—PTPl被认为是PTPlC，HCP或SHP。SH—PTP2被认为是PTPlD或PTP2C。同样，SH—PTPl在所有谱系的造血细胞中和所有变异阶段中均以高水平表达，且已经鉴定SH—PTPl基因负责m。theaten(me)小鼠的表型，并提供预测抑制剂作用的基础，该抑制剂可阻断其与细胞底物的相互作用。用趋化肽刺激嗜中性白细胞可导致酪氨酸激酶的激活，该酪氨酸激酶可介导嗜中性应答(Cui，et a1．，1994丁．工mmtJn。1)和PTPaSe的活性，并通过逆转在最初细胞刺激阶段激活的酪氨酸激酶的作用而调制激动剂诱导的活性。能够刺激PTPaSe活性的药剂作为抗炎介质具有潜在的治疗应用。
这些相同的PTPaSe还可以调制某些RTKS的活性。它们似乎反向平衡活化受体激酶的作用，因而可代表重要药物的靶。体外试验证实，注射PTPaSe可阻断胰岛素刺激的，内源蛋白上酪氨酰残基的磷酸化作用。因此，PTPaSe活性的激活剂可反向激活RTK受体在reSten。SiS中的作用，相信可将它用于本发明的溶液。此外，与那些细胞粘着分子相似，受体一连接PTPaSe还可作为胞外配体起作用。配体与胞外域结合的功能性结果还未被定义，但这种结合可调制细胞内磷酸酶活性的假设是合理的(FaShena和Zinn，1995，CurrentBi。l。gy，5，1367一1369)。这种作用可阻断由其它细胞表面粘着分子(N仁；AM)介导的粘着，并提供一种抗炎作用。至今还未研制出用于这些用途的药物。
12C．SH2域(SrC同源物2域)的抑制剂
SH2域，最初是在蛋白酪氨酸激酶(PTKS)的SrC亚族中鉴定的，是非催化的蛋白序列，并由在各种信号转导蛋白中保存的约lOO个氨基酸组成(C。hen等，1995)。SH2域作为磷酸酪氨酸_结合分子发挥作用，并由此介导细胞内信号转导途径中决定性的蛋白_蛋 白缔合(Pawson，Nature，573-580，1995)。特别是，已经清楚地定义了 SH2域的作用对于受 体酪氨酸激酶(RTK)介导的信号非常重要，如在血小板衍生的生长因子(PDGF)受体的情况 下。自磷酸化RTKs上含磷酸酪氨酸的位点可起SH2-蛋白结合位点的作用，并由此介导生物 化学信号途径的激活(见图 2) (Carpenter,G.，FASEB J. 6 :3283_3289，1992 ；Sierke，S.和 Koland, J. Biochem. 32 10102-10108,1993)。SH2域可负责将活化的生长因子受体偶联到 细胞应答上，这种细胞应答包括基因表达的改变，和最终的细胞增殖。因此，预测了选择性 地阻断在滑膜细胞表面上表达的特异性RTKs (排除IGFR和FGFR)激活作用的抑制剂可在 关节内窥镜检查过程后，有效的阻断软骨退化。 已经鉴定了至少20个胞质蛋白，其包括SH2域并在胞内信号中发挥作用。SH2域的 分布没有被限制在一个特殊的蛋白族，但可在多类蛋白，蛋白激酶，脂类激酶，蛋白磷酸酶， 磷脂酶，控制Ras的蛋白和某些转录因子中找到。许多含SH2的蛋白均具有已知的酶活性， 而其它(Grb2和Crk)则起细胞表面受体和“下游”效应分子间“连接体”和“接合体”的作 用(Marengere，L.，等，Nature369 :502_505，1994)。含SH2域，具有酶活性，并在信号转导中 被激活的蛋白的实施例包括，但不限制于，蛋白酪氨酸激酶的src亚家族(src(pp6(TSM)， abl, lck, fyn, fgr和其它)，磷脂酶CY (PLCY)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3-激酶)，p21-ras GTPase，其激活蛋白(GAP)及含SH2蛋白酪氨酸磷酸酶(SH-PTPases) (Songyang等，Cell 72，767-778，1993)。由于这些不同的SH2-蛋白具有从活化细胞表面受体发射信号到附加 分子相互作用的级联中的重要作用，其最终定义细胞应答，因此阻断特异性SH2蛋白结合， 例如c-src的抑制剂在软骨保护中具有潜在的治疗用途。此外，许多免疫/炎症应答的调节是通过受体介导的，该受体通过含SH2域的非受 体酪氨酸激酶传输信号。通过抗原特异性T-细胞受体(TCR)而激活T-细胞，可引发导致 淋巴因子分泌和T-细胞增殖的信号转导级联。TCR激活后最早的一个生物化学应答是酪 氨酸激酶活性的增加。特别是，嗜中性白细胞的激活部分是通过细胞表面免疫球蛋白G受 体的应答而控制的。这些受体的激活可介导未鉴定过的，具有SH2域的酪氨酸激酶的激活。 附加的证据显示许多src-家族激酶(lck，blk，fyn)均参与从细胞因子和整联蛋白受体引 导的信号转导途径，因此可整合从许多独立受体结构得到的刺激物。因此，特异性SH2域的 抑制剂具有阻断多种嗜中性白细胞功能的潜力，并起抗炎介质的作用。研制对准SH2域的药物的工作是在体外的生物化学和细胞水平进行的。这种努力 应当是成功的，最终的药物在本发明的实践中理应有效。II.抗疼痛和/或抗炎药剂与其它软骨保护溶液中药剂的治疗组合物的协同作用鉴于与关节内窥镜治疗过程后，炎症和软骨体内稳态损耗有关的疾病过程的复杂 性，和涉及单分子靶阻断或抑制的分子靶的多重性，不可能提供防止软骨退化和骨关节炎 发展的适当效果。事实上，许多目标指向不同分子受体和/或酶的动物研究还没有证明在 动物模型中有效，或还没有在临床试验中产生效果。因此，对不同分子靶起作用并局部递送 的药物的治疗组合物在软骨保护的治疗方法中是临床有效的。像下面所描述的，这种协同 性分子靶疗法的原理是从近年在了解基本的生化机制方面所取得的进展推论出来的，根据 这种机制，在关节内窥镜过程中，滑膜和软骨中的滑膜细胞和软骨细胞可传输并整合暴露 于其上的刺激物。
主要信号途径中的“串话”和趋同传统上，将负责细胞信号的分子开关分成主要的分离信号途径，每个均包含一组 不同的蛋白家族，其作为一组特殊胞外刺激物的转导物起作用，并介导不同的细胞应答。这 种途径中的其中一个通过G-蛋白偶联受体(GPCRs)从神经递质和激素转导信号，以产生收 缩性应答，这种应答包括炎性介质，如PGE2的产生。GPCRs通过三聚G蛋白的激活而与胞 内靶偶联(见图2)。涉及通过GPCR途径激活滑膜细胞和软骨细胞的信号分子实施例是组 胺，缓激肽，5-羟色胺和ATP。第二个主要途径通过激酶级联和NF-6B从促炎细胞因子，如 IL-1转导信号，以调节基因表达和分解代谢的细胞因子及其它分解代谢因子，包括NO的产 生。从神经递质和激素传输的信号可刺激两类受体中的一类GPCRs，由七_螺旋跨膜 区，或配体-门控的离子通道组成。来源于两种受体的“下游”信号在控制胞质Ca2+浓度上 趋同(见图3)。各GPCR跨膜受体可激活一类特异性的三聚G蛋白，包括、，&或其它。Gq 亚单位可激活磷酸酶Cy，其导致蛋白激酶C(PKC)的活化和胞质钙水平的增加(见图3)。 依次，胞内钙的升高导致cPLA2的活化，和花生四烯酸(AA)的产生。AA作为滑膜细胞和软 骨细胞中C0X的底物起作用，其导致PGE2的产生。PKC的活化还可导致MAP激酶的活化，该 MAP激酶可导致细胞和组织中NF-B的活化，这种活化是通过暴露于促炎细胞因子上而引发 的，并可调制涉及软骨分解代谢的蛋白基因表达的增加。通过不同的趋同受体(cognate receptor)，由IL-1和TNF_ a介导的促炎细胞因 子信号也在调节细胞基因表达上趋同。这些不同受体所采用的信号转导途径，使用不同的 激酶，该激酶与受体而不是信号途径相邻，在MAP激酶水平趋同(图3和4)。信号转导取决 于激酶级联中残基的磷酸化作用，其中的激酶包括“下游”酶，如P38MAP激酶。IL-1受体和 TNF-受体的活化还导致刺激MAP激酶，与Gq偶联的GPCRs共有的共同步骤(见图3)。现 在认识到，配体依赖性“串话”可转激活激酶途径，该激酶途径应答特异性GPCRs和细胞因 子，如IL-1的共同刺激，导致系统的细胞应答(见图3)。因此，导致促炎细胞因子，iNOS， C0X-2和MMPs基因表达的增加的选择性抑制剂的组合，其阻断共有信号途径的转激活(如 图1和2所示)协同发挥作用，从而防止关节内窥镜手术过程后的炎症和软骨退化。IV 概述根据这些软骨保护剂作用的分子和细胞机制，期望当将这些化合物以冲洗液的形 式围术期应用时(与其它软骨保护剂组合，或与上述其它抗疼痛，抗炎剂组合)或通过注 射或输注直接给予关节时，期望其能够显示软骨保护作用。特别是，当在关节内窥镜手术 期间，以冲洗液形式传递这些药剂时，期望其是有效的药物。各种代谢活性的软骨保护剂 可与一种或多种其它的软骨保护剂，包括小分子药物，肽，蛋白，重组嵌合蛋白，抗体，寡核 苷酸或基因治疗载体(病毒的和非病毒的)，组合传递到关节的间隙。例如，一种药物，如 MAPK抑制剂可发挥它对任一与关节液间隙和结构有关的细胞的作用，该结构包含涉及正常 关节功能或由于病理条件而存在的关节。这些细胞和结构包括，但不限制于，滑膜细胞，包 括A型成纤维细胞和B型巨噬细胞；关节软骨成分，如成软骨细胞和软骨细胞；与骨有关的 细胞，包括骨膜细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞；炎性细胞，包括淋巴细胞，巨噬细胞，肥 大细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞；和其它细胞，包括内皮细胞，平滑肌细胞，成纤维细胞和 神经细胞；及上述的组合。
52
本发明还提供活性治疗药剂的制剂，其可以对药物引入和给予关节有益的制剂形 式传递，这种传递可提高软骨保护剂的传递，吸收，稳定性和药动学。这种制剂可包括，但 不限制于由蛋白，脂质体，碳水化合物，合成有机化合物，或无机化合物组成的微粒，微球或 毫微颗粒。本发明还提供软骨保护剂的组合物，或一种或多种软骨保护剂与一种或多种抗 疼痛和/或抗炎剂的组合物的传递，这些组合物可作为均勻赋形剂内(例如，单一包囊的微 球)的多种药物活性物质而存在，或作为各个传递赋形剂(例如，包囊一种或多种药剂的一 组微球)的分散混合物而存在。制剂分子的实施例包括，但不限制于，亲水聚合物，聚阳离 子(例如，精蛋白，精脒，多熔素)，肽或合成配体和抗体，其能够将材料导向特异的细胞类 型，凝胶，缓释基质，可溶性和不溶性的颗粒，和未列出的制剂组分。在其中一个方面，本发明提供两种或多种软骨保护剂的组合物，或可与一种或多 种抗疼痛和/或抗炎剂组合的单独的软骨保护剂，或与一种或多种抗疼痛和/或抗炎剂组 合的传递，这种传递是通过含药物的输注液，冲洗液而局部递送的，其中的药物以治疗有效 的低浓度存在，且可使药物被直接传递到受影响的组织或关节。含药物的输注液或冲洗液 可在与外科手术过程有关的手术前和/或手术中和/或手术后使用，或在与外科手术过程 无关的其它时间使用。其它用于药物传递的常规方法要求全身(例如，肌肉内，静脉内，皮 下)给药，其需要将更高的药物浓度(和更高的总给药剂量)给予患者，以在目标关节中获 得显著的治疗浓度。全身给药还导致除目标关节之外的组织的高浓度，这是我们所不期望 的，根据给药剂量，可导致不利的副作用。这些全身方法使药物经历二过代谢和快速降解， 由此限制有效治疗浓度的持续时间。因为软骨保护剂(与或不与一种或多种抗疼痛和/或 抗炎剂)的组合物是通过输注或冲洗直接给予关节的，不需要通过血管灌注将药物运送到 目标组织。此显著的优点可使各种软骨保护剂以较低的治疗有效的总给药剂量局部递送。V.施用方法本发明的溶液有多种应用，可供包括手术，诊断和治疗技术在内的各种手术/介 入过程使用。本发明软骨保护剂的组合物可通过注射或冲洗给药。对于注射溶液来说，可 与载体材料组合从而产生单一剂量的活性成分的量可根据所治疗的患者，溶液中活性药剂 的特性和给药的特殊方式而决定。应当理解，然而，任一特殊患者的特殊给药剂量的水平 取决于各种因素，包括所用特殊化合物的活性，患者的年龄，体重，一般健康状况，性别和饮 食，给药时间，给药途径，药物组合物的排泄速率，及经历治疗的特殊疾病的严重性。注射用制剂，例如，无菌注射用水性或油性混悬液可根据已知技术，使用适当的分 散或湿润剂和混悬剂来配制。该无菌注射用制剂还可以在无毒的，非肠道可接受的稀释剂 或溶剂中的无菌注射用溶液或混悬液，如1/3-丙二醇的溶液。可使用的，可接受的赋形剂 和溶剂是水，格林氏溶液，和等渗氯化钠溶液。此外，通常将无菌的，确定的油用作溶剂或混 悬介质。为了达到此目的，可使用任一温和的，确定的油，其包括合成的单-或二-甘油酯。 此外，脂肪酸，如油酸也可用于制备注射用制剂。本发明的注射用溶液可在关节内窥镜外科手术过程的相关时间内，或在指导患者 的医师所期望的任意时间给予。本发明的冲洗液可在解剖学上关节的内窥镜外科手术期间围术期使用。这里使 用的术语“围术期”包括过程前应用，过程前和过程中联合应用，过程中和过程后联合应用， 过程前，过程中和过程后联合应用。优选该溶液在过程前和/或过程后以及过程中一起使用。这样过程通常采用生理冲洗液，如生理盐水或乳酸盐林格氏溶液，由本领域的普通技术 人员用于外科手术部位。本发明的方法包括用本发明的抗疼痛/抗炎/软骨保护的冲洗液 替代常规使用的冲洗液。在过程开始之前，最好在组织创伤之前，将该冲洗液应用到伤口或 外科手术部位，并连续贯穿过程的整个持续时间，以优先阻断疼痛和炎症，及软骨退化。本 文自始至终所使用的“冲洗液” 一词是指用液流冲洗伤口或解剖学结构。术语“应用” 一词 是包括局部引入本发明溶液的冲洗和其它方法，例如，将该溶液的一种可形成胶体的剂型 引入到手术部位，于是在整个过程中，该胶化的溶液保留在该部位。本文自始至终所使用的 “连续地”一词是指以足以维持预定的所用药物局部治疗浓度的频率反复经常地冲洗伤口 ； 以及手术技术所需的冲洗液流的间歇中断。本发明溶液中每种药物的所列浓度，是该药在没有代谢转化的条件下，局部递送 到手术部位，以在手术部位获得预定效果水平所用的浓度。据了解，所给溶液中的药物浓度 可能需要调整，以便达到(account for)传递时的局部稀释度。不需要根据全身分布情况 调整溶液浓度来达到代谢性转化或稀释，因为这些情况可通过局部递送而避免，这一点与 口服，静脉内，皮下或肌肉内的应用相反。可使用本发明溶液的关节内窥镜检查技术，作为非限制的实施例，包括膝部的部 分半月板切除术和韧带重建，肩肩峰整形术，(rotator cuff)清创术，肘滑膜切除术，以及 腕和踝关节内窥镜检查。本发明溶液以足以使关节囊膨胀的流速连续地，手术中供给关节， 以除去手术碎片，并使关节内部造影不受阻碍。下面的实施例1-4提供了在这种关节内窥镜检查技术期间，用于抑制软骨退化并 控制疼痛和炎症的适宜的关节内窥镜冲洗液。在本发明各溶液中，药剂的浓度较低，并以与用传统给药方法获得所期望治疗效 果所需的药物浓度和剂量相比，相对较低的给药剂量局部递送。经其它给药途径(例如静 脉内，皮下，肌肉内或口服)传递相似剂量的药物，并获得相等的治疗效果是不可能的，因 为全身给予的药物要经过一过和二过代谢，且经常被快速地从系统循环中清除掉。本发明的实施与关节内窥镜检查或“开放”关节(如膝、肩等)过程完成时，向关 节内注射阿片制剂和/或局麻药的传统方法不同。本发明的溶液用于整个外科手术过程中 的连续输注，以优先抑制疼痛和炎症。相反，目前使用局麻药恒速输注来获得治疗效果所必 需的高浓度可导致极深的全身毒性。在完成本发明过程后，最好在手术部位注射或以别的方式应用高浓度的，与本发 明冲洗液相同的软骨保护剂和/或疼痛和/或炎症抑制剂，作为阿片制剂的替代品或补充。 用于注射的适当软骨保护溶液在下面的实施例5中提供。实施例下面是适于特定手术过程的本发明的几个制剂，接着是利用本发明药剂所作的三 项临床研究的概述。实施例1关节内窥镜检杳用冲洗液下列组合物适用于关节内窥镜检查过程中解剖学关节的冲洗。与下面实施例所描 述的其它冲洗液一样，各种药物均溶在含生理电解液，如生理盐水或乳酸盐林格氏液的载 体液中。
药物类型 MAP激酶抑制剂 基质金属蛋白酶抑制剂 TGF-P激动剂
药物
SB 203580 U-24522 TGF- P 2
浓度(Nanomolar) 200 200 200剂。
实施例2
用于关节内窥镜检杳的诜择件冲洗液
下列组合物是在关节内窥镜检查过程期间，适用于解剖学关节冲洗液的选择性制
药剂类型药物
MAP激醉抑制剂SB203580
氧化氮合酶抑制剂L-NIL
白介素受体激动剂IL-10
实施例3 诜择件冲洗液
生理载体液的溶液中的下列药物及其浓度范围适用于本发明,
浪度(Nanomolar)
200
1, 000
100
药物类型 MAP激酶抑制剂 氧化氮合酶抑制剂 TGF-P激动剂
实施例4 诜择件冲洗液
下列组合物也适用于本发明。 药剂种类药物
MAP激酶抑制剂 SB242235 MMP 抑制剂U-24522
药物
SB242235 L-NIL TGF- P 2
浓度(Nanomolar) 200 10，000 100
浓度(Nanomolar) 200 200实施例5注射用软骨保护溶液下列组合物适于注射到解剖学的关节中。各药物是在含生理电解液，如生理盐水 或乳酸盐林格氏溶液的载体液中溶解的。适于将20ml给药剂量的溶液给予患者。药剂种类药物浓度 BMP受体激动剂
氧化氮合酶抑制剂 TGF-3激动剂
BMP-7 1,3PBIT
100ng/ml 4. 4 y g/ml
吡咯烷_ 二硫代氨基甲酸酯16. 4 u g/ml
实施例6
快速PGE2裂解暴露于IL-1和GPCR激动剂的协同刺激
成纤维样滑膜细胞具有炎性细胞的特性，且似乎是关节炎症和软骨退化的重要调节剂。将滑膜细胞培养模型系统用于描述IL-1和非细胞因子炎症介质间协同相互作用 的特征，其对于介导关节组织的损坏，包括由于关节内窥镜手术过程期间的组织损伤而出 现的损坏非常重要。进行试验以研究G-蛋白偶联受体(GPCR)激动剂(组胺，缓激肽，异 丙肾上腺素)对所培养的人滑膜成纤维细胞中的细胞因子和前列腺素产物的调节，并描 述此系统中酮洛芬的活性。描述了应答白介素-l(IL-l)刺激的前列腺素E2(PGE2)，白介 素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的诱导动力学。研究了在IL-1引发后，GPCR配体加强细 胞因子产生的能力。在实施例6-8中，除非另有说明，使用下列试验方法和材料。细胞培养滑膜组织是从经历过CIinicalResearch Center, MacNeal Hospital 关 节置换手术的骨关节炎患者获得的，并被送到实验室的Dulbecco' s Modified Eagle' s 介质(DMEM)中，该介质含青霉素(lOOunits/ml)，链霉素(100，ug/ml)，和二性霉素 B(0.25ug/ml)。用剪刀解剖并切碎滑膜，并将其作为外植体接种到培养基中，该培养基是 由含L-谷氨酸盐(2mM)，加热灭活的胎儿小牛血清(10% v/v)，加抗生素的DMEM组成的。 37°C时，在5% C02的潮湿空气中保藏该培养物。2-3周内，粘着的滑膜细胞从外植体里面 长出，并经过受胰蛋白酶作用。每周给种子培养物补料两次，并汇合。试验是在来源于通 道3-8的细胞上进行的。将试验培养物接种到35mm的皿上，其中2ml培养基中的密度为 7. 5X103cellS/cm2。培养物靠近试验汇合处生长，并含有2. 3士0. 3X105个细胞(平均值 士 S.E.M.，n = 3)，及104 士 13 yg的蛋白(n = 10)。该生长介质每周换两次。试验处理在讲行试验处理开始前，将介质换成试验件牛长介质，其是由含2% 热_灭活胎儿小牛血清的DMEM，加上述L-谷氨酸盐和抗生素组成的，以使细胞静止。第二 天，以12-24小时的间隔将特殊浓度的IL-1或其他配体加入到条件生长介质中来引发培养 物。在某些试验中，为了进行分析，在用IL-1引发之后，收集条件生长介质。急性试验处理 是在此引发间隔后进行的。从培养箱中除去培养物，用2ml Locke' s生理缓冲液(LB组 合物 mM :NaCl，154 ；KC1，2. 6 ；KH2P04，2. 15 ；K2HP04，0. 85 ；MgCl2，5 ；CaCl2，2 ；D-葡萄糖，10 ； HEPES, 10 ；pH 7.4，BSA,0. l%w/v)的等分试样清洗，然后在37°C的水浴中，用附加的含特 殊配体的LB等分试样平衡10分钟。通过吸引术除去此溶液，并在37°C时，用含指定配体的 新鲜缓冲液等分试样置换一定的时间间隔。典型地，在10分钟的培养前间隔过程中，加入 药物抑制剂，且激动剂加特殊抑制剂均存在于3分钟的攻击间隔过程中。前列腺素E2的测量.在指定处理方案进行之后，收集培养物上清液的等分试样 (lml)，并在液氮中迅速冷冻。在-80°C存储样品直到进行处理。使用与前列腺素E2和E1 具有等价反应活性的抗体，通过制造者(Sigma Chemical Co.)指定的竞争性结合放射免疫 测定法分析培养物上清液的等分试样。为了量化，使用固定浓度的[3H]前列腺素E2和浓 度逐渐增加的，可靠的竞争前列腺素E2绘制各测定法的标准曲线。IL-6的测量.细胞因子IL-6的产物也是在上清液培养基的等分试样中测量的，该 培养基在_80°C冷冻保存。IL-6是通过夹层ELISA，用上述制造者(Pharmingen)描述的碱 性磷酸酶检测测量的，并使用各纯的重组人细胞因子制备的标准曲线定量。试验测定是在 复制的培养物上进行的。raHl胸腺嘧啶核甙掺入和MTT的试验方法滑膜细胞系通常是相对于扩增应答IL-1的能力而评估的，其是以[3H]胸腺嘧啶核甙掺入而测量的(Kimball&Fisher，1988)。与保持在2%血清中的静止培养物相比，在此 试剂中，IL-1最有效的浓度可刺激10-20倍[3H]胸腺嘧啶核甙的掺入(没有标出数据)。SMii^免疫测定法通常是在各培养物的复制等分试样中进行的。试验测定法 是在两倍或三倍的培养物上进行的。各试验在至少两种细胞系中重复进行。使用Graph-PAD Prism软件(San Diego, CA)进行非线性回归曲线和统计分析。材料.细胞培养细胞培养介质是从Sigma或Gibco/BRL得到的。胎儿小牛 血清来源于Atlanta Biologicals Inc. (Norcross，GA)。药物重组人白介素_1是从 Genzyme (Cambridge, MA)得至lj的。丽洛芬是由 Omeros Medical Systems, Inc. (Seattle, WA)提供的。阿米替林，白喉素，5-羟色胺，异丙肾上腺素，缓激肽，组胺，和前列腺素E2均来 源于Sigma。放射性化学物质[3H]前列腺素E2，是从American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, M0)得到的。所有其它的试剂是以最高纯度从标准商业供应商处购买的。GPCR激动剂，组胺和缓激肽对人滑膜细胞中PGE2产生的作用是在刺激或没刺激 IL-1之前测量的，以评估激动剂之间的功能性相互作用，该激动剂通过不同种类的受体介 导共同的药物作用。将所培养的人滑膜成纤维细胞整夜暴露于IL-10(10U/ml)，导致延迟 的(4小时)和持续的PGE2产物的大量升高，其可以通过放射免疫法测定培养物上清液中 PGE2的增加而测量。在延长的IL-1处理过程(16-24小时)中，PGE2产物的逐渐增加是由 于cPLA2和C0X-2的协调的，被正向调节的表达(Crofford，1984，Hulkower等，1984)。已 经通过整夜暴露于IL-1而被引发的培养物应答随后最大有效浓度的组胺(100 yM)或缓激 肽(1，PM)的攻击，其具有附加的快速(分钟)和粗壮的PGE2的产生。应答组胺或缓激肽 刺激的PGE2产生时间过程的代表性数据在图7中列出。在这些条件下，与没有接收GPCR 激动剂加入量的IL-1引发的细胞相比，组胺引发5-10倍PGE2的增长。缓激肽引发10-15 倍的增长。在简单的2分钟激动剂攻击方法过程中产生的PGE2产物的绝对量超过在整个 18小时IL-1引发间隔过程中累积产生的量。在图7中可很明显地看出，在PGE2生产中，最 大多数组胺引发的裂解出现在最初的2分钟内，因为最小的附加积累是在60分钟后观察到 的。缓激肽_刺激的PGE2应答在超过相同时间的周期内继续增加(2-倍)。在没有IL-1 引发的条件下，天然的滑膜细胞显示，没有可检测的PGE2产物应答单独用GPCR激动剂的刺 激。在IL-1引发的条件下，组胺和缓激肽协同地加强PGE2的释放。使用来源于骨关节炎患者的培养滑膜成纤维细胞，我们发现促炎细胞因子，IL-1 和生理相关的G-蛋白偶联受体间的时间依赖性协同相互作用对PGE2产生的作用，并评估 了靶治疗剂的作用。GPCR激动剂通过内源滑膜受体起作用，该受体被偶联以增加胞内的钙 和肌醇磷酸盐，且PKC信号途径迅速突然地扩大细胞中PGE2的产物，该细胞预先用IL-1引 发。C0X抑制剂有效地减弱激动剂引起的快速爆发和PGE2的长期累积。因此，用于胞内信 号转导的不同GPCR和IL-1途径协同作用，产生快速或缓慢的，PGE2应答的长期调节。产生快速的PGE2爆发的，滑膜细胞中IL-1和钙-调节GPCRs间的协同作用部分 是通过花生四烯酸释放的快速增长，cPLA2在许多细胞类型中的活化测量值来说明的。除了 诱导C0X-2的表达外，，IL-1还可增加cPLA2的表达(Hulkower等，1994)。这两个蛋白共 同提供C0X-2的游离花生四烯酸底物。IL-1诱导的重要的类二十烷酸代谢酶的正向调节， GPCR配体激活花生四烯酸盐释放的能力结合，因此预测其可通过前列腺素的合成而增加整 个底物的流出。cPLA2是唯一已知的PLA2，其具有指示受体调节的功能性性能，且可能涉及二十烷酸的产生和胞内信号。因为CPLA2是为了全部的活，增加钙浓度而被激活的，且缓激 肽B2和组胺HI受体的活化与胞内钙的活动有关，这可能是调节PGE2产物中快速激动剂刺 激的爆发的重要因素。最终，非常快速和瞬间的胞质钙的增加是由B2或HI受体的激活而 引发的，其与cPLA2激活，花生四烯酸释放和观察到的PGE2爆发的动力学相似。实施例7通过环加氧酶抑制剂抑制PGE2裂解的形成酮洛芬，一种环加氧酶抑制剂减弱PGE2形成的作用是通过在延长暴露期间，与 IL-1共同培养而测定的；如图8所示，在随后的GPCR激动剂攻击间隔之前，进行简单的 前培养。在用IL-1引发过夜过程中，特殊浓度酮洛芬的加入消灭了 PGE2的形成，具有 通过非线性回归分析确定的IC5Q = 4. 5士0. 8nM(平均值士SEM，n = 4滑膜细胞系)。相 似的测定(未标出数据)是用环加氧酶抑制剂依托度酸(IC5Q = 15. 2士4. 6nM, n = 4), ketorolac (2. 2士0. 4nM, n = 4)，和吲哚美辛(3. 2士 1. 5nM, n = 2)进行的。图8还显示了激动剂-引发PGE2裂解的酮洛芬浓度依赖性抑制，其中PGE2裂解应 答 IL-1 (10U/ml)过夜引发的滑膜细胞中 lOOiiM 组胺(IC5。= 3.4±0.2nM，n = 3)Or luM 缓激肽(IC5Q = 9. 5士2. OnM, n = 3)的攻击。将这些值与在PGE2过夜IL-1诱导期间观察 的酮洛芬抑制值比较。这个结果证明通过C0X抑制剂的抑制开始出现在GPCR激动剂加入 前的10分钟预处理间隔内，与C0X活性的直接可逆抑制相一致，而不是由于与前列腺素调 节酶表达水平变化有关的机制。此立即的抑制作用还为在关节内窥镜外科手术期间，以冲 洗液形式局部递送到关节内时，此药物的立即有效性提供了基础。实施例8由IL-1和GPCR激动剂产生的IL-6的诱导和酮洛芬的抑制描述了应答IL-1刺激的白介素-6的诱导动力学。将滑膜细胞培养物暴露，用IL-1 加组胺处理以通过肌醇三磷酸盐(InsP3)/蛋白激酶C途径激活信号，或加异丙肾上腺素激 活胞内cAMP的增加。PGE2，IL-6，和IL-8的产生是在处理1，2，4，6，和24小时后，在培养 物上清液中测量的。在此试验中，各个处理的间隔是在分离的培养物中进行的。在上述处 理情况中，IL-6的产物是在24小时暴露后，由IL-1强烈增加的，但在最初的6小时间隔内 没有检测到IL-6。应答IL-1的IL-6产物不是通过加入组胺而被进一步扩增的，且组胺不 能刺激IL-6的产生。IL-1还可使IL-8显著增加(2000pg/ml)，其是在处理的第6个小时 首次测量的。IL-8产物在暴露于IL-1的第24小时，持续显著地增加。检测酮洛芬对IL-1产生的细胞因子的诱导及GPCR激动剂的作用。该方案还可测 试IL-1对IL-6稳定状态诱导的浓度依赖性作用。将滑膜细胞培养物暴露于指定浓度的 IL-1和GPCR激动剂中。收集培养物上清液，每8小时用含相同激动剂添加物的新鲜介质等 分试样替换。测定上清液中的PGE2，IL-6，和IL-8。IL-6产物的数据在图9中列出，其在有指定浓度的IL-1和附加配体存在的情况 下，第16小时(相当于8-16小时的处理间隔)产出IL-6。与单独的IL-1相比，组胺或异丙 肾上腺素的加入不能提高IL-6的产生。在1. 0pg/ml IL-1时，酮洛芬引起局部(< 50% ) IL-1引发的IL-6生产的抑制。此外，酮洛芬可抑制在组胺或异丙肾上腺素/IL-1共同刺激 的样品中IL-6的产生。将滑膜细胞培养模型系统用于描述IL-1和非细胞因子炎性介质间的协同作用的
58特征，其对于调制关节组织的损伤非常重要，所述损伤包括在关节内窥镜手术过程中出现 的组织损伤。结果概括如下(1) IL-1导致所培养滑膜细胞中PGE2，IL-6，和IL-8的大大增 加，而静止培养物不能产生可检测量的这些介质，(2)PGE2的诱导迅速出现，并导致在第4 小时PGE2释放到培养物上清液中，IL-8在第6小时释放，IL-6以更长的间隔释放，和(3) 在24小时的IL-1暴露后，所有这三个介质在培养物上清液中均保持升高。与它们对PGE2生产的作用相比，GPCR激动剂不能提高IL-1诱导的IL-8或IL_6， 且不能在用IL-1引发后，增加IL-8和IL-6的释放。IL-1诱导的IL-8和IL-6似乎可通过 伴随的PGE2的诱导而被加强，因为酮洛芬减少了应答IL-1的这些细胞因子的产生。此结 果表明当在手术过程中将酮洛芬传递到关节时，其可提供治疗性的软骨保护作用。这些结果证实，特异性G-偶联受体信号途径和通过IL-1促炎刺激产生的滑膜细 胞激活间的相互作用。期望相似的机制在软骨细胞中是可操作的。这些相互作用提供了一 种整合和调制滑膜细胞和软骨细胞促炎应答的方法，其取决于从关节内的其它内分泌物或 神经递质受体系统的输入。这些发现强调了治疗干预的潜在临床益处和原理，这种治疗干 预直指G-蛋白偶联受体的抑制，该受体可通过钙活动化，磷酸肌醇水解和PKC活化而介导 信号，且与关节内窥镜手术中PGE2产物的增加有关。这些作用于滑膜细胞和软骨细胞上的 受体包括组胺&，缓激肽，物质P，5HT2和purinergic P2Y受体。
权利要求
一种制造药剂的方法，该药剂包含一种溶液，该溶液包括一种多种药剂，其中第一个药剂是一种合成代谢的软骨保护剂，其选自促进软骨合成代谢过程的白介素激动剂，促进软骨合成代谢过程的包括TGF-β激动剂和骨形态发生蛋白激动剂在内的转化生长因子-β超家族成员，促进软骨合成代谢过程的胰岛素样生长因子和促进软骨合成代谢过程的成纤维细胞生长因子；第二个药剂是一种软骨分解代谢的抑制剂，其选自抑制软骨分解代谢的IL-1受体拮抗剂，抑制软骨分解代谢的TNF-α受体拮抗剂，抑制软骨分解代谢的环加氧酶-2特异性抑制剂，抑制软骨分解代谢的MAP激酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的氧化氮合酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的核因子κB抑制剂，抑制软骨分解代谢的基质金属蛋白酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的整联蛋白激动剂和整联蛋白拮抗剂，抑制软骨分解代谢的蛋白激酶C抑制剂和蛋白酪氨酸激酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的胞内蛋白酪氨酸磷酸酶的调制剂，及抑制软骨分解代谢的SH2域抑制剂；并且所述溶液还含有一种适用于将该溶液传递到患者关节中的载体，由此有效地同时抑制关节软骨的分解代谢过程和促进关节软骨的合成代谢过程。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述载体适用于将溶液在外科手术过程期间，围术 期传递到关节中。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述载体包含冲洗液载体。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述载体适用于将溶液通过关节内注射传递到关节中。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述载体包含一种持续释放传递的赋形剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中持续释放传递的赋形剂选自微粒，微球，毫微颗粒， 蛋白，脂质体，碳水化合物，合成的有机化合物和无机化合物。
7.如权利要求1所述的方法，其中该合成代谢的软骨保护剂选自IL-4，IL-10,IL-13， TGF^ 1，TGF^ 2，TGF^ 3，BMP-2, BMP-4, BMP—6，BMP-7, IGF-I 禾口 bFGF。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述软骨分解代谢的抑制剂选自抑制软骨分解代谢 的IL-I受体拮抗剂，抑制软骨分解代谢的TNF- α受体拮抗剂，抑制软骨分解代谢的环加氧 酶_2特异性抑制剂，抑制软骨分解代谢的MAP激酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的氧化氮合 酶抑制剂，和抑制软骨分解代谢的核因子κ B抑制剂。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述软骨分解代谢的抑制剂选自抑制软骨分解代谢 的基质金属蛋白酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的整联蛋白激动剂和整联蛋白拮抗剂，抑制 软骨分解代谢的蛋白激酶C抑制剂和蛋白酪氨酸激酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的胞内蛋 白酪氨酸磷酸酶的调制剂，及抑制软骨分解代谢的SH2域抑制剂。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述软骨保护剂是可溶性受体，该可溶性受体选自 可溶性的白介素-1受体和可溶性的肿瘤坏死因子受体。
11.如权利要求10所述的方法，其中该可溶性受体选自重组的可溶性人IL-I受体及嵌 合的 rhTNFR :Fc。
12.如权利要求1所述的方法，其中该溶液进一步包含一种或多种疼痛或炎症抑制剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中该疼痛或炎症抑制剂选自5-羟色胺受体拮抗剂， 5_羟色胺受体激动剂，组胺受体拮抗剂，缓激肽受体拮抗剂，激肽释放酶抑制剂，速激肽受体拮抗剂，降钙素基因相关肽的受体拮抗剂，白介素受体拮抗剂，作用于花生四烯酸代谢 物合成途径的酶抑制剂，前列腺素类受体拮抗剂，白三烯受体拮抗剂，阿片样物质受体激动 齐 ，嘌呤受体激动剂和拮抗剂，三磷酸腺苷-敏感的钾通道开启剂和钙通道拮抗剂。
14.一种用于抑制软骨退化的溶液，包含至少一种第一个软骨保护剂，其是一种合成代 谢的软骨保护剂，和至少一种第二个软骨保护剂，其是一种软骨分解代谢的抑制剂，其中所述第一个软骨保护剂是一种合成代谢的软骨保护剂，其选自促进软骨合成代谢过程 的白介素激动剂，促进软骨合成代谢过程的包括TGF-β激动剂和骨形态发生蛋白激动剂 在内的转化生长因子_ β超家族成员，促进软骨合成代谢过程的胰岛素样生长因子和促进 软骨合成代谢过程的成纤维细胞生长因子；所述第二个软骨保护剂是一种软骨分解代谢的抑制剂，其选自抑制软骨分解代谢的 IL-I受体拮抗剂，抑制软骨分解代谢的TNF-α受体拮抗剂，抑制软骨分解代谢的环加氧 酶_2特异性抑制剂，抑制软骨分解代谢的MAP激酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的氧化氮合 酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的核因子κ B抑制剂，抑制软骨分解代谢的基质金属蛋白酶 抑制剂，抑制软骨分解代谢的整联蛋白激动剂和整联蛋白拮抗剂，抑制软骨分解代谢的蛋 白激酶C抑制剂和蛋白酪氨酸激酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的胞内蛋白酪氨酸磷酸酶的 调制剂，及抑制软骨分解代谢的SH2域抑制剂；并且当该溶液局部传递到关节中时，所述药剂对同时抑制关节软骨的分解代谢过程和促进 关节软骨的合成代谢过程是治疗有效的。
15.如权利要求14所述的溶液，其中合成代谢的软骨保护剂选自IL-4，IL-10,IL-13， TGF^ 1，TGF^ 2，TGF^ 3，BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, IGF-I 禾口 bFGF。
16.如权利要求14所述的溶液，其中软骨分解代谢的抑制剂选自抑制软骨分解代谢的 IL-I受体拮抗剂，抑制软骨分解代谢的TNF-α受体拮抗剂，抑制软骨分解代谢的环加氧 酶_2特异性抑制剂，抑制软骨分解代谢的MAP激酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的氧化氮合 酶抑制剂，和抑制软骨分解代谢的核因子κ B抑制剂。
17.如权利要求14所述的溶液，其中该软骨分解代谢的抑制剂选自抑制软骨分解代谢 的基质金属蛋白酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的整联蛋白激动剂和整联蛋白拮抗剂，抑制 软骨分解代谢的蛋白激酶C抑制剂和蛋白酪氨酸激酶抑制剂，抑制软骨分解代谢的胞内蛋 白酪氨酸磷酸酶的调制剂，及抑制软骨分解代谢的SH2域抑制剂。
18.如权利要求14所述的溶液，其中所述软骨分解代谢的抑制剂是可溶性受体，该可 溶性受体选自可溶性的白介素-1受体和可溶性的肿瘤坏死因子受体。
19.如权利要求18所述的溶液，其中该可溶性受体选自重组的可溶性人IL-I受体及嵌 合的 rhTNFR :Fc。
20.如权利要求14所述的溶液，其中该溶液进一步包含一种或多种疼痛或炎症抑制剂。
21.如权利要求20所述的溶液，其中该疼痛或炎症抑制剂选自5-羟色胺受体拮抗剂， 5_羟色胺受体激动剂，组胺受体拮抗剂，缓激肽受体拮抗剂，激肽释放酶抑制剂，速激肽受 体拮抗剂，降钙素基因相关肽受体拮抗剂，白介素受体拮抗剂，作用于花生四烯酸代谢物合 成途径的酶抑制剂，前列腺素类受体拮抗剂，白三烯受体拮抗剂，阿片样物质受体激动剂， 嘌呤受体激动剂和拮抗剂，三磷酸腺苷_敏感的钾通道开启剂和钙通道拮抗剂。
22.如权利要求14所述的溶液，其中该溶液包含一种持续释放传递的赋形剂。
23.如权利要求22所述的溶液，其中该持续释放传递的赋形剂选自微粒，微球，毫微颗 粒，蛋白，脂质体，碳水化合物，合成的有机化合物和无机化合物。
全文摘要
本发明公开了用于抑制疼痛，炎症和软骨退化的溶液及方法，其中的各种疼痛和炎症是由包括关节内窥镜检查过程在内的一般外科手术过程的伤口引起的。该溶液优选在生理载体，如生理盐水或乳酸盐林格氏溶液中包含稀释浓度的多种疼痛和炎症抑制剂。在外科手术过程中，可通过连续冲洗伤口而应用该溶液，以便优先抑制疼痛，并避免人们所不期望的，与大剂量药剂的口服，肌肉内，皮下或静脉内应用有关的副作用。选择性地，相对于软骨退化抑制剂的组合物而言，可将该溶液直接注射到关节中。
文档编号A61K38/55GK101850120SQ20101016206
公开日2010年10月6日 申请日期2000年7月21日 优先权日1999年7月21日
发明者G·A·德莫普洛斯, J·M·赫尔茨, P·P·帕尔黙 申请人:奥默罗斯公司