专利名称：一种人小RNA-148a表达载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种人小RNA_148a表达载体以及该载体转染的细胞和制备治疗结直肠癌疾病药物中的应用。
背景技术：
人小RNA (MicroRNA, miRNA)是一类近年发现的长度为20个核苷酸左右的非编码 小分子RNA，大量的研究证明其能识别靶基因3’非编区通过不完全互补转录后沉默靶基因 表达。MiRNA不仅在哺乳动物细胞的生长、增殖、凋亡和分化具有时向和组织特异性，而且 在干细胞的生成过程中同样也发挥重要作用；如果我们考虑到细胞间的信号转导及相互作 用可能也需要miRNA介导的调节，那么在不同肿瘤及肿瘤的不同阶段miRNA不同的表达方 式也不足为奇。2002年Carlo Croce研究小组首次在慢性B淋巴细胞白血病中确认miRNA 与肿瘤有直接关系以来，有关肿瘤与miRNA的研究涉及各种肿瘤，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、 胃癌和结直肠癌等。随着miRNA芯片技术的介入，使得miRNA组学研究越来越容易。目前 在与相对应正常组织比较许多肿瘤中都发现表达上调和下调的miRNA ；miRNA表达谱除了 能区分肿瘤组织和正常组织外，还能根据其不同的组成表达方式判断肿瘤的分型、临床分 期等；LuJ等通过几百例肿瘤组织和正常组织进行系统的miRNA组学分析，成功的将这些肿 瘤分类和分期，而且使人惊奇的是他们证明了 miRNA组学比mRNA表达谱能更好的预测肿瘤 的分型和分期。MiRNA在肿瘤中的作用与编码基因相似。同样可以作为原癌基因起作用，也 可以作为抑癌基因起作用；作为原癌基因起作用的miRNA通过转录后抑制抑癌基因，使其 表达下降从而促进肿瘤生成，而作为抑癌基因起作用的miRNA通过转录后抑制原癌基因而 抑制肿瘤形成。因此，进一步研究miRNA的在肿瘤的发生、作用机理和功能，将会揭示肿瘤 发生发展过程乃至为肿瘤诊治奠定分子基础。
发明内容
本发明目的是提供一种人小RNA_148a表达载体，是根据人小RNA_148a的前体序 列设计并合成寡核苷酸片段，装载入pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR表达载体，具有SEQ ID No 1 和SEQ ID No 2的互补寡核苷酸序列，SEQ ID No 1 5’ -TGCTGAGGCAAAGTTCTGAGACACTCCGACTCTGAGTATGATAGAAGTCAGTGCACTACAGAACTTTGTCTC-3，SEQ ID No 2 5’ -CCTGGAGACAAAGTTCTGTAGTGCACTGACTTCTATCATACTCAGAGTCGGAGTGTCTCAGAACTTTGCCTC-3，；本发明中的小RNA_148a表达载体通过以下方法构建合成两条寡核苷酸片段，正 义链序列(SEQ ID No 1)和反义链序列(SEQ ID No 2)；将上述合成好的寡核苷酸用双蒸 水溶解成1001^，各取5111混勻，加入退火缓冲液2111，用双蒸水补足2(^1，951加热5分 钟，然后放置室温自然冷却20分钟。将退火后的双链寡核苷酸稀释至ΙΟηΜ，取4μ 1与2μ 1pcDNA 6. 2-Gff/EmGFPmiR载体混合，加入4 μ 1连接缓冲液，用双蒸水补足20 μ 1后16°C过 夜。将连接产物加入200 μ 1制备好的感受态大肠杆菌中，冰浴30分钟后42°C热激90秒 后冰浴3分钟；加入800 μ 1 LB液体培养基，370C，150转/分钟摇菌1个小时后取200 μ 1 菌液均勻涂布于大观霉素阳性(50 μ g/ml)的LB琼脂培养板上。倒置平板，37°C培养箱内 12-16h，每个转化平板分别挑取3个克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否 与设计的寡核苷酸序列一致。本发明发明的另一个目的是提供所述人小RNA_148a表达载体在制备促进结直肠 癌细胞凋亡药物中的应用。同时也在制备以BCL2基因为靶基因的抗肿瘤药物中的应用。为了证实本发明所提供的人小RNA_148a表达载体的有效性和实用性，本发明 采用脂质体转染法结直肠癌细胞系RKO细胞，经细胞培养，提取RNA，采用茎环逆转录荧 光定量PCR检测了转然后RKO细胞的人小RNA-148a，结果证明了该载体能够过表达人小 RNA-148a。为了探究人小RNA_148a作用机制，本发明通过转染构建好的pcDNA6. 2-GW/ EmGFP-人小RNA-148a表达载体至RKO细胞，建立了人小RNA_148a稳定转染结直肠癌细胞 模型RK0-miR-148a。采用流式细胞术检测细胞凋亡，结果发现与转染对照载体的细胞模 型RKO-miR-NTC比较，发现人小RNA_148a具有明显诱导RKO细胞凋亡的作用；为了进一步 验证该作用，本发明采用人小RNA-148a反义寡核苷酸拮抗过表达的人小RNA_148a，发现 人小RNA-148a被抑制后具有拮抗过表达的人小RNA_148a诱导凋亡的作用。为了探讨人 小RNA-148a诱导细胞凋亡机制，本发明采用生物信息学软件预测了人小RNA_148a的靶基 因，并采用蛋白免疫印迹方法进行了实验验证，结果表明人小RNA-148a诱导细胞凋亡的作 用机制与其抑制BCL2基因表达有关。该人小RNA-148a表达载体，具有特异性过表达人小 RNA-148a的特点，并利用该载体转染结直肠癌细胞，诱导其凋亡，提供制备治疗结直肠癌药 物中的用途。
图1为人小RNA_148a稳定转染结直肠癌细胞模型RK0_miR-148中人小RNA_148a 的表达情况，人小RNA-148a的表达明显高于对照组RKO-miR-NTC。图2为人小RNA_148a诱导RKO细胞凋亡情况，RK0_miR-148a细胞凋亡明显高 于RKO-miR-NTC细胞，采用人小RNA-148a反义寡核苷酸(Anti-miRNA-148a)拮抗人小 RNA-148a后凋亡减少。其中A图为未经任何处理的RKO细胞，B图为转染对照表达载体的 RKO细胞，C图为转染本发明的人小RNA-148a表达载体的RKO细胞，D图为本发明的人小 RNA-148a表达载体和人小RNA_148a反义寡核苷酸共转染的RKO细胞。图3为人小RNA_148a诱导RKO细胞凋亡的定量分析；转染本发明的人小RNA_148a 表达载体的RKO细胞凋亡明显增高，本发明的人小RNA-148a表达载体和人小RNA_148a反 义寡核苷酸共转染的RKO细胞(miR-148a+Anti-miRNA-148a)凋亡小降。图4为人小RNA_148a稳定转染结直肠癌细胞后BCL2基因表达情况， RKO-miRNA-148a细胞BCL2表达明显下降，采用人小RNA_148a反义寡核苷酸 (Anti-miRNA-148a)拮抗人小 RNA_148a 后 BCL2 表达升高。本发明中，以上所述和以下的实施例中，所使用的技术包括基因克隆、基因测序、细胞培养和细胞转染等分子生物学技术，除特殊说明外均为本领域研究技术人员已知的常 规技术；所使用的仪器设备、试剂、细胞株等除特殊说明外均为本领域的研究技术人员可以 通过公共途径获得。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此。实施例一人小RNA_148a表达载体构建1.寡核苷酸设计与合成设计并合成以下两条寡核苷酸片段，正义链(SEQID No 1)为 5' -TGCTGAGGCAAAGTTCTGAGACACTCCGACTCTGAGTATGATAGAAGTCAGTGCACTACAGAACTTTGT CTC-3，，反义链(SEQ ID No 2)为 5，-CCTGGAGACAAAGTTCTGTAGTGCACTGACTTCTATCATACTCAG AGTCGGAGTGTCTCAGAACTTTGCCTC-3’。2.人小RNA_148a的克隆将上述合成好的寡核苷酸用双蒸水溶解成lOOuM，各取 5μ1混勻，加入退火缓冲液2 μ 1，用双蒸水补足20μ 1，95°C加热5分钟，然后放置室温自 然冷却20分钟。将退火后的双链寡核苷酸稀释至ΙΟηΜ，取4 μ 1与2 μ 1 pcDNA 6. 2-Gff/ EmGFPmiR载体混合，加入4 μ 1连接缓冲液，用双蒸水补足20 μ 1后16°C过夜。将连接产物 加入200 μ 1制备好的感受态大肠杆菌中，冰浴30分钟后42°C热激90秒后冰浴3分钟；力口 入800 μ 1 LB液体培养基，370C，150转/分钟摇菌1个小时后取200 μ 1菌液均勻涂布于大 观霉素阳性(50yg/ml)的LB琼脂培养板上。倒置平板，37°C培养箱内12_16h，每个转化平 板分别挑取3个克隆进行测序，测序结果显示插入的序列与设计的寡核苷酸序列一致。实施例二人小RNA_148a表达载体细胞转染与检测1.质粒提取将实施例一中挑取的单克隆转移到大观霉素阳性(50 μ g/ml)的LB 液体培养基中220转/分钟摇菌16个小时后使用吸附柱离心法提取质粒。2.细胞转染转染前一天，将1 X 105细胞铺至6孔板；转染方法参照Invitrogen 公司提供的Lipofectmine2000使用说明书操作。500 μ L无血清培养基与4 μ g质粒混勻 后加入10μ L转染试剂，V0TEX10秒后，常温静置5min。PBS温和清洗细胞两次，加入1. 5ml 含血清的培养基。将上述质粒与转染试剂的混勻物滴滴加入细胞培养上清中，同时轻微摇 晃板。盖盖子，移出超净台，再在平面上前后左右顺时针，逆时针均勻摇晃板，使其均勻后入 孵箱培养。24小时后使用稻瘟素进行药物筛选，筛选后的细胞转移至96孔板挑取单克隆进 行扩大培养。3.人小RNA_148a的检测使用TRIZOL提取细胞总RNA，按下列体系(ABI， 4366596,4373130)进行逆转录，IOOmM dNTPs(with dTTP)0. 15 μ L,MultiScribe Reverse Transcriptase 1.00 μ L,10 X Reverse Transcription Bufferl. 50 μ L, RNase Inhibitor 0. 19 μ L, RT-primer 3. 00 μ L,总 RNAlOng,补足 DEPC 水至 15 μ L ；混勻后置 PCR 仪 16°C，30 分钟；42°C，30分钟；85°C，5分钟。反应结束后按照下列体系(ABI，4324018)进行荧光PCR 反应,TaqMan MicroRNMssay (20 X) 1. 00 μ L, Product from RT reaction 1. 33 μ L, TaqMan 2 X Universal PCRMaster Mix 10. 00 μ L, Nuclease-free water 7. 67 μ L ；M^BS^ct^PCR仪(ABI7900) 95°C，10分钟；95°C，15秒，60°C，45秒，40个循环。根据荧光曲线获得CT 值计算相对表达量。结果参见图1，人小RNA-148a稳定转染结直肠癌细胞模型RKO-miR-148 中人小RNA-148a的表达明显高于对照组细胞RKO-miR-NTC。实施例三人小RNA_148a促进结直肠癌细胞凋亡1.人小RNA_148a表达载体转染结直肠癌细胞后凋亡检测收集细胞并估算细胞 数量，PBS洗1次，800 μ 1结合缓冲液洗一次，调整细胞浓度为1 X106/ml，取100 μ 1细胞悬 液(1父105细胞)，加入5口1^ Annexin V/FITC，弹勻，避光染10分钟，加入IOyL ΡΙ，立即 上流式细胞仪分析。结果参见图2中C图和B图所示人小RNA-148a表达载体转染RKO细 胞后细胞凋亡率达90%，明显高于对照组细胞，从正向证明了人小RNA-148a具有明显诱导 RKO细胞凋亡的作用。2.人小RNA_148a反义寡核苷酸抑制过表达的人小RNA_148a后细胞凋亡检测采用人小RNA-148a反义寡核苷酸转染过表达人小RNA_148a的结直肠癌细胞RKO细胞，按实 施例三中1的方法检测细胞凋亡，结果参见图2中C图和D图，人小RNA-148a表达载体和 人小RNA-148a反义寡核苷酸共转染的RKO细胞凋亡明显下降，说明人小RNA_148a被抑制 后具有拮抗过表达的人小RNA-148a诱导凋亡的作用，从反向证明了人小RNA_148a具有明 显诱导RKO细胞凋亡的作用。3.定量分析人小RNA_148a诱导RKO细胞凋亡经过重复上述实验，结果参见图3， 人小RNA-148a能够促进结直肠癌细胞凋亡。实施例四人小RNA_148a通过抑制BCL-2促进结直肠癌细胞凋亡1.采用生物信息学软件预测了 BCL-2为人小RNA_148a的靶基因。2.蛋白免疫印迹检测人小RNA_148a抑制BCL-2的表达制备15% SDS-PAGE凝 胶，将蛋白定量后与上样缓冲液混勻煮沸5分钟后，假如上样孔，80V电泳30分钟后，改为 120V电泳90分钟。将目的蛋白100V转移100分钟至PVDF膜上。5%脱脂奶封闭2小时 后，BCL-2 —抗4°C孵育过夜，洗膜3次后荧光二抗孵育45分钟，洗膜3次后扫描分析结果。 结果参见图4，小RNA-148a稳定转染结直肠癌细胞(RK0_miRNA-148a)BCL2表达明显下降， 采用人小RNA-148a反义寡核苷酸(Anti-miRNA-148a)拮抗人小RNA_148a后BCL2表达升 闻。
权利要求
一种人小RNA-148a表达载体，是根据人小RNA-148a的前体序列设计并合成寡核苷酸片段，装载入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达载体，具有SEQ ID №1和SEQ ID №2的互补寡核苷酸序列，SEQ ID №15’-TGCTGAGGCAAAGTTCTGAGACACTCCGACTCTGAGTATGATAGAAGTCAGTGCACTACAGAACTTTGTCTC-3’SEQ ID №25’-CCTGGAGACAAAGTTCTGTAGTGCACTGACTTCTATCATACTCAGAGTCGGAGTGTCTCAGAACTTTGCCTC-3’；通过以下方法构建合成SEQ ID №1和SEQ ID №2两条寡核苷酸片段，将上述合成好的寡核苷酸用双蒸水溶解成100uM，各取5μl混匀，加入退火缓冲液2μl，用双蒸水补足20μl，95℃加热5分钟，然后放置室温自然冷却20分钟，将退火后的双链寡核苷酸稀释至10nM，取4μl与2μlpcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR载体混合，加入4μl连接缓冲液，用双蒸水补足20μl后16℃过夜，将连接产物加入200μl制备好的感受态大肠杆菌中，冰浴30分钟后42℃热激90秒后冰浴3分钟；加入800μl LB液体培养基，37℃，150转/分钟摇菌1个小时后取200μl菌液均匀涂布于大观霉素阳性的LB琼脂培养板上，倒置平板，37℃培养箱内12-16h，每个转化平板分别挑取3个克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡核苷酸序列一致。
2.根据权利要求1所述的一种人小RNA-148a表达载体在制备促进结直肠癌细胞凋亡 药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种人小RNA-148a表达载体在制备以BCL2基因为靶基因的 抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种人小RNA-148a表达载体，是根据人小RNA-148a的前体序列设计并合成寡核苷酸片段，装载入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达载体，具有SEQ ID No1和SEQ ID No2的互补寡核苷酸序列。本发明所述人小RNA-148a表达载体具有特异性过表达人小RNA-148a的特点，利用该载体转染结直肠癌细胞，诱导其凋亡，可在制备促进结直肠癌细胞凋亡药物中的应用。同时在制备以BCL2基因为靶基因的抗肿瘤药物中的应用。
文档编号A61K48/00GK101831461SQ20101016159
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者张红河, 来茂德 申请人:浙江大学