专利名称：：一种富硒猴头菌菇胶囊的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种富硒猴头菌菇胶囊的制备方法，属于医药领域。
背景技术：
：微量元素硒具有抗癌抗肿瘤以及提高机体免疫力，抗氧化保护心血管、提高红细胞的携氧能力、拮抗和降低某些有毒元素及物质的毒性、保护视器官的健全功能等保健作用。近年来，各种具有补硒功能的保健品不断涌现，已成为保健品市场一支生力军。目前国内外普遍采用的无机强化剂主要为亚硒酸钠，主要用于制备口服液，亚硒酸钠片和亚硒酸钠强化食盐等。有研究表明，有机硒对动物的毒性明显低于无机硒，且有机硒在动物组织中的保留量大于无机硒。有机硒作为重要的硒源引起了人们的重视。微生物由于生长速度快，收获周期短，培养方便，各种条件易于控制，因此微生物无机硒的转化成为生物源有机硒的主要来源。且不少微生物具有良好的富硒能力。目前常见的有机硒富硒产品有富硒酵母，富硒香菇，富硒灵芝等。猴头菌菇是著名的药食两用菌，含有多肽、多糖和酰胺等高分子化合物，对消化系统的癌变、溃疡及神经衰弱等疾患具有显著疗效。并有抗溃疡、抗肿瘤、助消化、抗衰老、提高机体耐缺氧能力、增加心肌血液输出量、加速机体血液循环、降血糖、降血脂、保肝护肝等作用。猴头富硒除了能有效将无机硒转化为有机硒从而降低毒性以外，更有可能提高猴头中有效成分保健功效。达到1+1>2的良好效果。猴头对硒的转化率较高，且人体对菌类有机硒的利用率较高，可以达到70%-90%。在猴头的培养料中加入一定量的硒能够提高子实体的产量并且能够提高猴头中有效成分的含量。使得富硒猴头菇成为一种极具开发潜质的具有优良功效的保健食品。猴头作为一种传统各药学典籍中早有记载。猴头栽培工艺简单，设备要求低，富硒猴头毒性低，安全性高。研究猴头菌富硒将为人们的日常摄取提供新的硒源。
发明内容本发明中的猴头菌(拉丁名称(Hericiumerinaceus(Bull.:Fr.)Pers.)，广布种，是现有技术中已知菌种，并可以从商业途径购买获得。本发明中，发明人还直接从安徽黄山的野生猴头菌子实体分离到该菌种，保存于安徽省微生物防治重点实验室菌种库(液氮及冻干保存)，菌株编号RCEF0923，需要时可向本室购买，亦可用其它食用菌厂或研究所提供的猴头菌菌种。本发明的一个目的在于提供一种制备富硒猴头菌菇粉的方法，该方法采用在猴头菌菇培养基中添加定量的亚硒酸钠，即Na2SeO3的方法，通过微生物转化后，制成的富硒猴头菌菇粉，所得产品中有机硒和多糖的含量高，食用安全、方便，可满足各类人群的补硒要求。本发明的另一目的在于提供一种富硒猴头菌菇胶囊，该胶囊的内容物为本发明的富硒猴头菌菇粉。本发明一方面提供了一种制备富硒猴头菌菇粉的方法，该方法包括以下步骤(1)斜面试管培养将分离纯化的菌种接种于斜面试管中培养；(2)三角瓶培养将斜面试管培养得到的菌种接种到三角瓶培养基中培养；(3)发酵罐培养将三角瓶培养得到的菌种接入发酵罐培养基中进行培养；(4)富硒猴头菌菇的栽培在20-27°C向盛有培养基的容器中，接种培养基重量1.0-3.0%的步骤；(3)得到的菌种，培养，直到猴头子实体长出；(5)富硒猴头菌菇粉的制备将步骤⑷得到的富硒猴头菌菇干燥、粉碎，得到富硒猴头菌菇粉；在步骤(2)-(4)的培养基中均含有亚硒酸钠。与现有技术不同的是，本发明还将发酵培养后的菌种再次进行接种，直到猴头子实体长出，如此操作不但省去了现有技术中，制备富硒猴头菌菇时分离纯化发酵罐培养基的操作步骤，而且制备得到的富硒猴头菌菇中有机硒和多糖的含量均得以提高。优选的，在所述的步骤(1)中，所述的斜面试管培养基的每1升液体培养基中含有180-220g的土豆、18-22g的葡萄糖、l_2g的磷酸二氢钾、0.7-0.8g的硫酸镁、18_22g的琼月旨，并且所述培养基的PH值为4.5-6。更优选的，所述的斜面试管培养基的每1升液体培养基中含有200g土豆、20g葡萄糖、Ig磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁、20g琼脂，并加水至1L，并且所述培养基的PH值为5.02。优选的，在所述的三角瓶培养基和发酵罐培养基的每1升液体培养基中均含有，45-55g的麦麸、18-22g的葡萄糖、1.8-2.2g的蛋白胨、1.8-2.2g的酵母粉、1.3-1.7g的磷酸二氢钾、0.7-0.8g的硫酸镁、80-120mg的亚硒酸钠，并且所述培养基的pH值为4.5_6。更优选的，在三角瓶培养基的每1升液体培养基中含有50g麦麸、20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉、1.5g磷酸二氢钾、0.75g硫酸镁、109.7mg亚硒酸钠，并用水补足至1L，并且所述培养基的PH值为5.0。优选的，在所述的步骤(3)中，所述的发酵罐培养包括一级发酵罐培养和二级发酵罐培养。优选的，在所述的步骤(4)的培养基中含有750_800g的玉米芯、180_220g的麦麸、8-12g的蔗糖、8-10g的石膏和87.76-109.70mg的亚硒酸钠，更优选的，所述的培养基中含有780g的玉米芯、200g的麦麸、IOg的蔗糖、IOg的石膏和109.7mg的亚硒酸钠。优选的，在所述的步骤⑵中，三角瓶培养的条件为在24_26°C温度下，120-160转/分钟的振动速度下，在恒温振荡培养箱中培养时间为5-7天。更优选的，所述的振动速度为140转/分钟。优选的，所述步骤(3)的发酵培养条件为首先将发酵罐中的液体培养基灭菌，将灭菌后的培养基冷却，再将三角瓶培养后的菌种接入培养基中培养。更优选的，所述的灭菌条件为在50L气升式发酵罐中装入20L液体培养基，培养基温度为25°C-27°C,pH值为4.5_6，并加入0.045-0.055%培养基重量的食用消泡剂，在14.7XIO4Pa压力下，通入蒸汽加热到115_125°C，保持30-45分钟。优选的，在所述的步骤(3)中，所述的培养条件如下培养温度为25-26°C，通气量为10.5V/V·min，压力保持4.903-7.0845XIO4Pa,培养4-6天。优选的，在所述的步骤(4)中的培养条件如下，首先将所述的培养基物料混合均勻后，加入适量的水，其重量份为物料水=12，拌勻装入聚丙烯塑料袋中灭菌，将灭菌后的固体培养基放置于无菌通风室中冷却至24°C_25°C，向培养基接种其总重量的1.7%的液体菌种；放入培养室中培养；温度保持在25V_28°C湿度保持在95%-100%培养80-100天。更优选的，培养90天。本发明另一方面还提供了一种富硒猴头菌菇胶囊，该胶囊的内容物为本发明的富硒猴头菌菇粉末。与现有技术不同的是本发明将发酵罐生产出的菌种接种到固体培养基中继续培养，直到得到猴头子实体，本发明得到的猴头菌菇胶囊的内容物是干燥并粉碎后的猴头子实体。其中的硒含量达到114.05士8.0911^/1^，多糖含量达到25.38士0.321^/1^。然而采用现有技术，直接将发酵罐的菌种分离提取并干燥得到的富硒猴头菌中的硒含量仅为400-700μg/100g。此外，由于本发明是将猴头子实体粉碎干燥得到的猴头菌菇粉末，再将粉末装入胶囊得到富硒猴头菌菇胶囊，所以制备方法更为简单，相对与现有的技术，本发明方法的猴头菌菇在制备过程中的损耗小。本发明方法生产的富硒强化营养食品具有独特的先进性1、猴头菌菇是著名的药食两用菌，含有多肽、多糖和酰胺等高分子化合物，有抗溃疡、抗肿瘤、助消化的作用。对消化系统的癌变、溃疡及神经衰弱等疾患具有显著疗效。用猴头作为富硒载体，其安全性和有效性易于被人接受和认可；2、动物试验结果表明本发明所得产品安全无毒；3、经药理试验证实，所述产品富硒猴头菌菇子实体提取物的抑菌效果略优于普通猴头子实体提取物的抑菌效果。动物试验结果证明小鼠经口给予富硒猴头菇冻干粉21天后，能促进小鼠肠道中益生菌的增殖。说明该产品具有调节肠道菌群功能。4、本发明的生产方法工艺简单，设备要求低，不仅适合企业，也适用于农户创业。投入少，经济效益好。生产原料主要为麦麸、玉米芯等农业废料，具有很高的经济和社会效益。具体实施例方式实施例1该富g猴头If菇粉末的牛产方法,甸J舌下述母产工序A、液体菌种培养将分离纯化的菌种接种于斜面试管中，斜面试管培养基的每1升液体培养基中含有200g土豆、20g葡萄糖、Ig磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁、20g琼脂，并且所述培养基的pH值为5.02。再将接种菌种的斜面试管放入25°C培养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；在500ml三角瓶中装入200ml培养基，用1.2Kg/cm2高压灭菌30分钟，待冷却至室温时，将经1支斜面试管的菌种接种到500ml三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度25士1°C，140转/分钟条件下培养，培养时间为5天；在50L气升式发酵罐中装入20L液体培养基，培养基温度大于95°C、pH值为4.5-6，并加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03%，在14.7XIO4Pa压力下，通入蒸汽加热到121°C，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20°C时将4瓶上述培养好的500ml摇瓶菌种接入培养，培养温度为25-26°C，通气量为10.5V/V·min，保压4.903-7.0845XIO4Pa,经5天通气培养，达到对数生长期后即可。终培养体积为20L。三角瓶和发酵罐中的每IL液体培养基均含有50g麦麸、20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉、1.5g磷酸二氢钾、0.75g硫酸镁、109.7mg亚硒酸钠，并且所述培养基的pH值为5.0。B、富硒猴头菇袋料栽培所述菌种的固体基质培养基原料重量配比为在IOOOg培养基中含玉米芯780g、麦麸200g、蔗糖10g、石膏IOg和亚硒酸钠109.70mg。将固体物料混合均勻后，加入适量的水，其重量份为物料水=12;拌勻装入聚丙烯塑料袋中灭菌；将灭菌后的固体培养基放置于无菌通风室中冷却至24°C，以固体培养基重量的1.7%的接种量接入步骤A得到的发酵罐中的液体菌种；将接种后的物料放入培养室中培养；温度保持在25°C，湿度保持在95%，培养90天后，猴头子实体长出，菌刺变长；C、富硒猴头菌菇粉末生产低温干燥将步骤B得到的子实体，采用50°C以下温度干燥，粉碎，得到富硒猴头菌菇粉末。D、富硒猴头菌菇胶囊的生产将步骤C得到的富硒猴头菌菇粉末装入胶囊中，得到富硒猴头菌菇胶囊。实施例2富硒猴头菌菇的胶囊的检测将实施例1方法制备得到的富硒猴头菌菇胶囊进行检测，检测结果见下表有机硒含量(mg/kg)蛋白质含量(mg/kg)多糖含量(mg/kg)~114.05+8.09mg/kg22.61+0.57mg/kg25.38+0.32mg/kg~实施例3富硒猴头菌菇粉末安全性的评价急性毒性试验，给药量每次5.6g/kg·Bff受试动物，一次性给予。富硒猴头菌粉急性毒性实验结果证实，富硒猴头菌胶囊无急性毒性作用，5.6mg/kg*BW给药浓度下，未测出明显的LD5(i。用药后动物未出现明显的中毒症状及死亡情况，连续观察一周，动物全部存活，活动自如，毛发光滑，饮食正常，呼吸、鼻、眼、口腔无异常分泌物。体重增加。一周后解剖动物，肉眼及显微镜观察重要脏器，未出现明显的病理学改变，因此急性实验结果提示富硒猴头菌菇胶囊安全无毒。实施例4富硒猴头菌菇胶囊的体外抑菌实验实验选取大肠杆菌(Escherichiacoli)——革兰氏阴性，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)——革兰氏阳性，白假丝酵母(Candidaalbicans)——真菌,考察猴头菌菇的抑菌能力。试验方法将实施例1得到的粉碎干燥的猴头菌菇的子实体处理，(水提物普通猴头和富硒猴头冻干粉各20g，分别加入400ml蒸馏水，超声浸提lh，真空减压浓缩至200ml。乙醇提取物普通猴头和富硒猴头冻干粉各20g，分别加入400ml乙醇，超声浸提lh，真空减压浓缩至干。用200ml蒸馏水溶解。乙酸乙酯提取普通猴头和富硒猴头冻干粉各20g，分别加入400ml乙酸乙酯，超声浸提lh，真空减压浓缩至干。用200ml蒸馏水溶解。丙酮提取物普通猴头和富硒猴头冻干粉各20g，分别加入400ml丙酮，超声浸提lh，真空减压浓缩至干。用200ml蒸馏水溶解。并加入下表1的溶液中，加入量为IOOyL,其抑菌率通过下表中的“富硒”一栏得以体现；下表中的“普通”表示普通的猴头菌菇子实体粉末，它的处理方法同实施例1得到的猴头菌菇的子实体粉末，在表1溶液中的加入量与富硒猴头菌菇的加入量相同。表1猴头菌制备物对十种供试菌的抑菌圈<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可见，普通猴头子实体粉末和富硒猴头子实体粉末对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母均有一定程度的抑制作用。尤以对大肠杆菌的抑制作用最为明显。富硒猴头子实体提取物的抑菌效果略优于普通猴头子实体提取物的抑菌效果。抑菌物质的提取方法一超声浸提为优，以乙醇为溶剂的提取物的抑菌效果最好。本实验中猴头多糖和水煎液的抑菌效果不明显。最低抑菌浓度(英文简称MIC)的测定富硒猴头醇提物的MIC采用微量稀释法，富硒猴头乙醇提取物真空减压浓缩至干，加入蒸馏水配成药液，过滤除去细菌，二倍法梯度稀释。各组最终药物浓度如表2-3所示表2MIC实验浓度梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>度(mg/ml:接种时，先用培养基讲菌液调至IXIO6IXIO8个/ml。每孔带药培养基100μL，菌液50μL0表3MIC的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从表2-3可以看出，本发明的富硒猴头菌菇粉末对大肠杆菌大肠杆菌G+和金黄色葡萄球菌抑菌效果最为明显，对白假丝酵母的抑菌效果稍弱。实施例5富硒猴头菌菇粉末对小鼠肠道的调节作用富硒猴头菇粉末对实验老鼠体重的影响，实验方法50只小鼠随机分为5组，分别为蒸馏水对照组，普通猴头菇冻干粉组和富硒猴头冻干粉高、中、低3个剂量组，每组10只。高、中、低剂量组分别给予富硒猴头菇冻干粉3g/d/kg·BW、0.06g/d/kg·Bff和0.006g/d/kg·BW。普通猴头菇冻干粉对照组给予0.06g/d/kg·Bff普通猴头菇冻干粉，空白对照给蒸馏水。灌胃给药，灌胃容量0.2ml/10g体重。每天一次，持续3周。除灌胃外，小鼠给予正常饲料和饮水。表4富硒猴头菌菇粉末对实验老鼠体重的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从表4可以看出，富硒猴头菌菇粉末对实验老鼠体重的影响很小。表5不同剂量富硒猴头菇粉末对小鼠肠道大肠杆菌的影响(lgCFU/g，X±s,η=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实验期间小鼠粪便中肠杆菌属的变化如表5所示，实验期间小鼠粪便中肠杆菌无与对照组相比无明显变化(Ρ>0.05)。经口给予富硒猴头冻干粉21天后，小鼠肠道中的大肠杆菌生长繁殖未受明显抑制表6不同剂量富硒猴头菇粉末对小鼠肠道双岐杆菌的影响(lgCFU/g，X土S，n=<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与正常对照组比较，*Ρ<0.05表6不同剂量富硒猴头菇粉末对小鼠肠道乳酸菌的影响(lgCFU/g，X±S,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>与正常对照组比较，*Ρ<0.05实验期间小鼠粪便中乳酸菌的变化如表6所示，对照组小鼠粪便中肠杆菌属无明显变化，实验期间菌数无显著性变化(ρ>0.05)；实验组小鼠经口给予富硒猴头菇冻干粉以后，高剂量组小鼠肠道中乳酸菌的数量增加，达到显著水平(P<0.05)。实验结束后第3d，实验组小鼠乳酸菌数量与对照相比仍然较多。说明富硒猴头冻干粉对乳酸菌的生长繁殖有一定的促进作用。根据中华人民共和国卫生部颁布的《保健食品检验与评价技术规范》中“调节肠道菌群功能”的判定依据.证实小鼠经口给予富硒猴头菇粉末21天后，能促进小鼠肠道中益生菌的增殖，起到调节肠道菌群功能的效果。权利要求一种制备富硒猴头菌菇粉末的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)斜面试管培养将分离纯化的菌种接种于斜面试管中培养；(2)三角瓶培养将斜面试管培养得到的菌种接种到三角瓶培养基中培养；(3)发酵罐培养将三角瓶培养得到的菌种接入发酵罐培养基中进行培养；(4)富硒猴头菌菇的栽培在20-27℃向盛有培养基的容器中，接种培养基重量1.0-3.0％的步骤(3)得到的菌种，培养，直到猴头子实体长出；(5)富硒猴头菌菇粉末的制备将步骤(4)得到的富硒猴头菌菇干燥、粉碎，得到富硒猴头菌菇粉末；在步骤(2)-(4)的培养基中均含有亚硒酸钠。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的斜面试管培养基的每1升液体培养基中含有180-220g的土豆、18-22g的葡萄糖、l_2g的磷酸二氢钾、0.7-0.8g的硫酸镁、18-22g的琼脂，并且所述培养基的pH值为4.5-6；优选的，所述的斜面试管培养基的每1升液体培养基中含有200g土豆、20g葡萄糖、lg磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁、20g琼脂，并且所述培养基的pH值为5.02。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述的三角瓶培养基和发酵罐培养基的每1升液体培养基中含有，45-55g的麦麸、18-22g的葡萄糖、1.8-2.2g的蛋白胨、1.8-2.2g的酵母粉、1.3-1.7g的磷酸二氢钾、0.7-0.8g的硫酸镁、80_120mg的亚硒酸钠，并且所述培养基的PH值为4.5-6，优选的，在三角瓶培养基的每1升液体培养基中含有50g麦麸、20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉、1.5g磷酸二氢钾、0.75g硫酸镁、109.7mg亚硒酸钠，并且所述培养基的PH值为5.0。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，所述的发酵罐培养包括一级发酵罐培养和二级发酵罐培养。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(4)的培养基中含有750-800g的玉米芯、180-220g的麦麸、8_12g的蔗糖、8_10g的石膏和87.76-109.70mg的亚硒酸钠，优选的，所述的培养基中含有780g的玉米芯、200g的麦麸、10g的蔗糖、10g的石膏和109.70mg的亚硒酸钠。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，三角瓶培养的条件为在24-26°C温度下，120-160转/分钟的振动速度下，在恒温振荡培养箱中培养时间为5-7天；优选的振动速度为140转/分钟。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的发酵培养条件为首先将发酵罐中的液体培养基灭菌，将灭菌后的培养基冷却，再将三角瓶培养后的菌种接入培养基中培养，优选的，所述的灭菌条件为在50L气升式发酵罐中装入20L液体培养基，培养基温度为25°C-27pH值为4.5_6，并加入0.04-0.05%培养基重量的食用消泡剂，在14.7X104Pa压力下，通入蒸汽加热到115-125°C，保持30-45分钟。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，所述的培养条件如下培养温度为25-26°C，通气量为10.5V/V*min，压力保持4.903-7.0845X104Pa,培养4-6天。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中的培养条件如下，首先将所述的培养基物料混合均勻后，加入适量的水，其重量份为物料水=12，拌勻装入聚丙烯塑料袋中灭菌，将灭菌后的培养基放置于无菌通风室中冷却至24°C-25向培养基接种其总重量的1.7%的液体菌种；放入培养室中培养；温度保持在25°C-28°C，湿度保持在95%-100%培养80-100天，优选的，培养90天。10.一种富硒猴头菌菇胶囊，该胶囊的内容物为权利要求1-9中任一项所述方法制备得到的富硒猴头菌菇粉末。全文摘要本发明提供了一种制备富硒猴头菌菇胶囊的方法，该方法包括以下步骤(1)斜面试管培养；(2)三角瓶培养；(3)发酵罐培养；(4)富硒猴头菌菇的栽培在20-27℃向盛有培养基的容器中，接种培养基重量1.0-3.0％的步骤(3)得到的菌种，培养，直到猴头子实体长出；(5)富硒猴头菌菇粉末的制备将步骤(4)得到的富硒猴头菌菇干燥、粉碎，并且在步骤(1)-(4)的培养基中均含有亚硒酸钠。本发明还提供了一种富硒猴头菌菇胶囊，该胶囊的内容物为上述所述方法制得的富硒猴头菌菇粉末。本发明得到的富硒猴头菌菇胶囊具有安全性和有效性高，产品的抑菌效果好和制备方法简单的优点。文档编号A61P1/00GK101829159SQ20101019073公开日2010年9月15日申请日期2010年6月3日优先权日2010年6月3日发明者孙自伟,李好,李春如,樊美珍,王伟申请人:樊美珍