专利名称：具有最高迁移效率的神经干细胞的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制品领域，具体涉及一种具有最高迁移效率的神经干细胞的制备 方法及其治疗各种神经系统疾病、运动系统疾病、心血管系统疾病的应用。
背景技术：
长期以来，神经系统疾病包括帕金森病、Alzheimer's病、脑卒中、恶性神经胶质瘤 及中枢和外周神经损伤等缺乏有效的治疗方法，严重影响着人类的生命健康和生活质量。 临床上对中枢和外周神经系统损伤治疗的常规方法主要是以减少或防止继发性损伤为主， 基本上没有治愈的可能。自从20世纪90年代神经干细胞被发现以来，人们对其寄予厚望， 希望能在神经系统康复方面有重大突破，从而掀起了神经干细胞研究热潮。随着实验室研 究的深入，人们对神经干细胞的自我更新、自我复制、永生化的特性认识越来越深，并且对 于神经干细胞的提取、培养、纯化、诱导等方面都积累了丰富的经验，为临床应用奠定了深 厚的基础。从理论上讲，神经干细胞移植可应用于各种神经系统疾病的治疗，包括神经系统 损伤、坏死性疾病、退行性疾病、遗传代谢性疾病、肿瘤等。现临床开展的神经干细胞移植已 经应用于帕金森病、脱髓鞘病变和脑、脊髓损伤的治疗。神经干细胞移植疗效取决于与宿主 神经系统在结构和功能上的整合性。神经干细胞天生具有向脑损伤区域趋化性迁移的能 力。Gao等(2006)研究发现，在受损伤的发育期脑内，移植的神经干细胞向损伤部位移行并 替代缺失的细胞，这为治疗中枢神经损伤后引起的广泛神经元受损提供了理论依据，借助 它们的迁移能力，可以避免多点移植带来的副损伤。并且，神经干细胞移植后可定位分化为 功能细胞，替代补充缺失细胞的结构和功能，释放神经递质、产生神经营养因子等，促进病 损神经组织再生和抑制神经变性。原代、永生化及胚胎干细胞来源的神经干细胞也可以趋 向性迁移至脑胶质瘤、恶性黑色素瘤、髓母细胞瘤和成神经细胞瘤等肿瘤区域，从而使之成 为基因工程药物的载体靶向性攻击肿瘤细胞，肿瘤细胞分泌的多种炎症趋化因子和生长因 子介导了神经干细胞的这种趋向性迁移。虽然干细胞移植取得了一定的临床效果，但治疗后与正常人仍有较大的差异。其 中很重要的一个原因是由于移植的干细胞须由移植部位迁移到受损伤部位，且迁移到损伤 部位的细胞数量要足够多并且要同时分化为神经元才能起到明显的修复效果。如果干细胞 的迁移效率低、迁移细胞数量少或者分化效率低都会极大地影响修复效果。而目前临床上 的细胞移植往往是将未知状态的神经干细胞注射入体内，在治疗周期完成后，真正迁移到 病灶部位的细胞十分有限，其中真正分化为神经元并行使功能的细胞更为稀少。这使得神 经干细胞在临床应用上遇到了 一个瓶颈。
发明内容
本发明目的是提供一种具有最高迁移效率的神经干细胞的制备方法，以提高神经 干细胞的迁移效率，增加迁移到病灶部位的神经干细胞数量。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种具有最高迁移效率的神经干细 胞的制备方法，包括以下步骤
111分离培养神经干细胞，诱导分化，在分化的不同时段收集细胞，得到处于不同分化状 态的神经干细胞；
12J确定迁移区域趋化因子情况，所述趋化因子情况包括趋化因子的种类和浓度，分析 计算步骤tn所得不同分化状态神经干细胞对该趋化因子情况作用下的迁移效率，找到迁移 效率最高的神经干细胞的分化状态，由此即可制备得到对该迁移区域所需的具有最高迁移 效率的神经干细胞。上述技术方案中，步所述神经干细胞的体外培养，分化的方法为本领域技术 人员公知的现有技术。上述技术方案中，步〗k[2) h所述迁移区域为目的病灶区域，迁移区域趋化因子 情况一般指病灶区域的趋化因子的种类和浓度；优选的技术方案中，可以向病灶区域补充 趋化因子，更好地诱导移植的神经干细胞趋向性迁移到病灶部位，提高治疗效果，所述补充 趋化因子的方法为本领域技术人员惯用手段。其中，测定目标病灶区的趋化因子的种类和 浓度为本领域技术人员公知的现有技术，例如临床上测定病人体内诱导干细胞迁移的细 胞因子的含量的方法为采集病人血液样品，经夹心酶联免疫吸附试验(Sandwich ELISA) 法测定即可(参见A. Morita等.临床化学学报$1111103 Chimica Acta) 322 (2002) 67-75 \ S. V. Maru 等.神经免疫学杂志(Journal of Neuroimmunology) 199(2008) 35-45)0上述技术方案中，步听述迁移效率，是指细胞迁移起始点到终点的最短距离 与细胞迁移总距离的比值，数值越大表明迁移的持续性越高，定向迁移至病灶部位的能力 越强；测定神经干细胞的迁移效率的方法可选自但不限于运用Dunn chamber测定干细 胞的迁移效率(参见Zhang等.细胞生物学杂志(The Journal of Cell Biology) 163 (2003) 1375-1384、。上述技术方案中，步骤(2〗具体包括以下步骤确定迁移区域趋化因子情况，所述 趋化因子情况包括趋化因子的种类和浓度，在分化培养基中加入与迁移区域相同种类、相 同浓度的趋化因子，诱导细胞迁移；对细胞的定向迁移效率进行分析，找到对迁移区域具有 最高迁移效率的神经干细胞的分化状态，所述分化状态的神经干细胞即为该迁移区域所需 的具有最高迁移效率的神经干细胞。上述技术方案中，所述的神经干细胞来源于人、动物(包括猿、猴、猪、大鼠、小鼠、 兔等)的胚胎或成体脑组织、脐带血、实施癫痫病灶切除或外伤手术的患者的脑组织、经过 基因工程修饰或其他经过人工改造的神经干细胞或神经干细胞系；在完全培养液中培养 3-6 d开始诱导分化。上述技术方案中，制备处于不同的分化状态的神经干细胞的方法为在完全培养 液中培养3-6 d的神经干细胞，细胞汇合度达到50-90%左右时，吸掉完全培养液，更换为分 化培养基(H-DMEM+0. 1-1% FCS，或撤掉bFGF的完全培养基)，从更换分化培养基开始，不同 时间段取样即得到不同分化状态的神经干细胞。上述技术方案中，所述神经干细胞迁移效率的分析方法为运用邓恩室(Dunn
4chamber)，结合活细胞工作站(Leica AF6000，Germany)对单个细胞的迁移行为进行追踪， 使用Image J软件分析神经干细胞迁移的具体轨迹，计算干细胞的迁移效率，即从细胞迁移 起始点到终点的最短距离与细胞迁移总距离的比值。上述技术方案中，所述趋化因子为诱导神经干细胞趋向性迁移的因子，包括所有 能够引起不同分化状态的神经干细胞定向迁移的炎症趋化因子和细胞生长因子，如SDF、 TPO, G-CSF, bFGF, EGF, PDGF, EGF, BDNF, LIF, VEGF, SCF, HGF, NGF, TGF-旦,TNF- a、IL-l, IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15 等。所述具有最高迁移效率的神经干细胞可以结合组织工程材料再应用于临床移植。 通过体外培养、诱导得到不同分化状态的神经干细胞，结合或不结合趋化因子，应用于组织 工程材料上再移植；或将神经干细胞与组织工程材料共培养，结合或不结合趋化因子，以取 得最佳迁移状态的神经干细胞，再用于移植。采用上述技术方案所得的具有最佳迁移效率的神经干细胞的临床适用范围包括 各种神经系统疾病(帕金森病、阿尔海默兹病、中枢神经系统损伤、外周神经系统损伤、脑卒 中、恶性胶质瘤、脑出血后遗症、老年性痴呆)、运动系统疾病(运动神经元病、共济失调)、心 血管系统(缺血性心脏病)、视神经发育不全、视神经萎缩等。采用上述技术方案所得的具有最佳迁移效率的神经干细胞可以通过注射或其它 途径应用于临床移植治疗，注射方式包括肌肉注射、血液(静脉、动脉)注射、局部定点注 射、脑脊液注射、立体定位注射法(病灶近端、远端)、腰穿细胞悬液注射法、静脉内细胞悬液 输入法等。因此，本发明同时要求保护一种治疗神经系统疾病、运动系统疾病、心血管系统疾 病的药物，所述药物包括采用上述技术方案所得的神经干细胞；优选的技术方案中，还包 括趋化因子。本发明同时要求保护一种治疗神经系统疾病、运动系统疾病、心血管系统疾病的 药物载体，所述药物载体包括采用上述技术方案所得的神经干细胞；优选的技术方案中， 还包括趋化因子。所述趋化因子为诱导神经干细胞趋向性迁移的因子，选自所有能够引起不同分 化状态的神经干细胞定向迁移的炎症趋化因子或细胞生长因子中的一种或两种以上的混 合物。 上述技术方案中，所述趋化因子包括SDF、TP0、G-CSF、bFGF、EGF、PDGF、EGF、BDNF、 LIF、VEGF、SCF、HGF、NGF、TGF-3、TNF-a、IL-1、IL-6, IL-7, IL-8, IL-11、IL-12, IL-14, IL-15 等。 本发明的思路是发明人创造性的研究发现，不同分化状态的神经干细胞的趋向 性迁移能力不同。未分化的神经干细胞往往具有较强的向损伤部位迁移的能力，但是这种 细胞的定向分化能力差，可以不定向的分化为神经元或者胶质细胞，消减了临床治疗的效 果。成熟的神经元迁移能力很弱，但它们却可以为组织损伤提供替代的功能细胞。因此只有 在这两者中找到最适合的平衡点才能更好的使用细胞移植治疗神经系统疾病。另外，不同 分化状态的神经干细胞对各种趋化因子的应答强弱不同，表现为趋向性迁移能力，尤其是 迁移效率的差异。所谓迁移效率，是指细胞迁移起始点到终点的最短距离与细胞迁移总距 离的比值，数值越大表明迁移的持续性越高，定向迁移至病灶部位的能力越强。因此，如果利用具有最高迁移效率的神经干细胞进行临床移植，那么定向迁移到病灶部位的神经干细 胞数无疑会大大增加，从而提高治疗效果。鉴于临床上神经系统疾病和神经损伤的复杂性、 多样性及病灶部位所分泌细胞因子的种类和含量的多样性，用于移植的神经干细胞的分化 状态也应是不同的，但所要达到的临床效果都是相同的，那就是所移植的神经干细胞群体 具有最高的迁移效率，能够高效地迁移到病灶部位，提高治疗效果。因此，本发明根据目标病灶部位的趋化因子的具体情况，包括趋化因子的浓度和 种类，测定该情况下不同分化程度的神经干细胞的迁移效率，选出迁移效率最佳的分化状 态的神经干细胞。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
利用本发明建立的方法制备得到的神经干细胞，处于特定的分化状态且具有最佳的趋 化性迁移效率(针对目的病灶区的趋化因子的情况种类、浓度)，解决了困扰神经干细胞临 床应用的主要问题，可以针对不同情况的病灶区提供最佳迁移效率的神经干细胞，增加迁 移到病灶区的神经干细胞，改善治疗效果，为干细胞移植治疗提供了最根本的保障。
图1为实施例一种神经干细胞在PLL(A、C、E，分别培养3 d、4 d、6 d)和Matrigel (B、D、F，分别培养3 d、4 d、6 d)包被的培养皿上贴壁生长的形态；其中，比例条(Bar) =50 y m ；
图2为实施例一中神经干细胞分化潜能的免疫荧光鉴定。A在Matrigel贴壁培养第5 d的神经干细胞；B诱导分化48 h的神经干细胞；C神经干细胞Nestin免疫荧光鉴定；D、E、 F神经干细胞诱导分化48 h的GFAP和Tujl免疫荧光鉴定；其中，比例条(Bar) =50 u m ； 图3为实施例一中神经干细胞在H-DMEM+1% FCS分化培养基中诱导分化(T48 h的形 态学观察；其中，比例条(Bar) =50 u m ；
图4为实施例一中神经干细胞在C6 conditioned medium+1% FCS分化培养基中诱导 分化0 48 h的形态学观察；其中，比例条(Bar) =50 u m ；
图5为实施例一中Dunn chamber示意图，其中，B中白色箭头所指方向为外槽方向； 图6为实施例一中不同分化状态神经干细胞的迁移行为观察(分化培养基为 H-DMEM+1% FCS)，其中A为单个神经干细胞在不同分化阶段((T12 h)的形态学照片(*) ；B 为5个神经干细胞在分化(T4 h内的非定向迁移路径，每个细胞的迁移起始点都被标准化 为X、Y轴的交叉点(0，0)；其中，比例条(Bar) =50 um；
图7为实施例一中不同分化状态神经干细胞的迁移效率，其中A实线为细胞迁移的实 际路径，虚线为迁移起点和终点的距离，迁移效率FMI为二者的比值；B为不同分化状态神 经干细胞的迁移效率(mean士SE，来自至少三次独立实验，*/X0. 05)；
图8为实施例二中C6胶质瘤细胞培养及条件培养基的收集；其中，A为C6胶质瘤细胞 1 5传代后第1 d的形态；B为C6细胞融合度达到60%，收集条件培养基前细胞形态；C为更 换为H-DMEM，24 h后收集C6条件培养基时C6的细胞形态；其中，比例条(Bar) =50 um；
图9为实施例三中不同分化状态的神经干细胞对不同浓度SDF-1 a的趋化性迁移效率 (mean士SE，来自至少三次独立实验，* ^<0. 05)；
图10为实施例四中不同分化状态的神经干细胞对不同浓度SCF-1的趋化性迁移效率；其中，A为实线为细胞迁移的实际路径，虚线为迁移起点和终点的距离，迁移效率FMI 为二者的比值；B为不同分化状态NSCs的迁移效率(mean士SE，来自至少三次独立实验，* P<Q. 05)；
图11为实施例五中不同分化阶段C17. 2细胞系的免疫荧光染色结果；Nestin 神经干 细胞特异性标志物，绿色荧光；β _ III tubulin 早期神经元标志物，绿色荧光；A2B5 神经 胶质细胞标志物，绿色荧光；GFAP 星形胶质细胞标志物，绿色荧光；比例尺(Bar) =50 μ m ； 图12为实施例五中不同分化状态的C17. 2细胞对50 ng/ml VEGF的趋向性迁移效率； 以0 d、不添加VEGF的分化培养基为对照组；* P<0. 05 (与对照组相比较)，** P<0. 05 (与 分化Od和12 h相比较)；
图13为实施例六中不同分化状态的C17. 2细胞对50 ng/ml HGF的趋向性迁移效率； 以不添加HGF的分化培养基为对照组；* P<0. 05 (与对照组相比较)。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 实施例一
1神经干细胞的分离、培养与鉴定
1.1 神经干细胞完全培养液含有 20 ng/ml bFGF、2 mmol/L N-acetyl_cysteine、2 mmol/L L-glutamate,1 mmol/L sodium pyruvate>2% B27、l% penicillin - streptomycin 的 Neurobasal medium。1. 2神经干细胞的分离、培养
取新生48 h内的SD大鼠，75%酒精擦拭消毒后断头处死。剪开头部皮肤，外撕，然后剪 破颅骨，用眼科镊沿大脑前方夹断视神经，小心取出大脑置于90 mm塑料培养皿预冷的无菌 D-Hank’S液中。半球正面朝上。用薄的手术刀片垂直于皿底方向切取，然后用脑膜镊在解 剖显微镜下分离得到SVZ区域，置于预冷的9 ml D-Hank’S中，按照10 μ 1/大脑的比例加 入0. 25%的胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTA)，缓慢吹打均勻后置于37°C培养箱中消化15 min。消化的同时，在10 ml离心管内配制22%的Percoll即7. 8 ml的D-Hank’ s内加入 2.2 ml Percoll, 1730 rpm 离心 10 min。随后加入 1 ml 的胎牛血清(fetal calf serum, FCS)缓慢吹打均勻终止消化，800 rpm离心8 min，弃上清，用1 ml D-Hanks重悬后加入到 22% 的 Percoll 液的顶部，1730 rpm 离心 10 min，弃上清。再使用 Neurobasal medium, 800 rpm,8 min离心三次，弃上清。用Neurobasal medium制成单细胞悬液，血球计数板计数， 以3 X IO5Mish的密度接种到含有完全培养液的35 mm dish中，置于37°C、5% CO2培养箱 培养。35 mm dish预先使用Matrigel进行包被，Matrigel提前置于4°C冰箱内冰上过夜， 使用前用 Neurobasal medium 按照 1 500 稀释 Matrigel，1. 5 ml/dish 室温包被 2 h。接种 细胞前吸掉包被液，并用Neurobasal medium清洗一遍，随后加上2 ml/dish完全培养液。 取第;Γ6 d细胞诱导分化，并观察分化后的细胞，得图1。1.3神经干细胞的鉴定将贴壁培养的神经干细胞培养液吸出后，0.01 M PBS (pH7. 2)洗两次，每次5-10 min。吸去PBS，加入4%多聚甲醛，4°C冰箱固定过夜。吸去4%多 聚甲醛,PBS洗三次，每次 5-10 min。滴加用 PBS + NaN3 (0.02%)+ BSA (3%) + TritonX-100 (0. 2%) mouse anti-Nestin IgG (1 :200)，4°C冰箱固定过夜后PBS洗三次，每次5-10 min,
7加入1 μ M Η33258室温孵育5 min，PBS洗两次，共5 min，最后50%缓冲甘油(PBS配制) 封片，荧光显微镜下观察阳性细胞。阴性对照采用PBS代替一抗，结果阴性。正常培养第？Γ d时，吸去完全培养液，PBS洗两遍，加入含有0. 1-1% FCS的 H-DMEM 培养基，培养 48 h 后，分别使用 mouse anti-GFAP (1 1000)和 Tujl (1 500)鉴定 NSCs分化为神经元和星形胶质细胞的能力。PBS洗两遍，每次5-10 min. 4%多聚甲醛室温固 定 2 h，然后 PBS 洗三次，每次 5-10min。滴加用 PBS + NaN3 (0. 02%) + BSA (3%) + Triton X-100 (0· 2%)稀释的 mouse anti-GFAP IgG (1 1000)或mouse anti- Tujl (1:500) ,4°C 冰箱固定过夜后PBS洗三遍，每次5-lOmin。加入FITC标记山羊抗鼠二抗或PE标记的山 羊抗兔二抗。室温孵育5-10 min，PBS洗两次，每次5-10 min，最后使用50%缓冲甘油(PBS 配制)封片，荧光显微镜下观察，得图2。2不同分化状态神经干细胞的准备
分化培养基H-DMEM+0. 1-1% FCS ；或撤去bFGF的完全培养基 将原代NSCs接种于预先包被好Matrigel含有完全生长培养基的培养皿中，待第3 6 d，细胞融合度达到50-90%左右时，吸掉培养皿中的培养液，使用预热至37°C的PBS缓冲 液清洗培养皿2次，然后更换为分化培养基，置于37°C培养箱中。从更换分化培养基开始， 每12 h为一个分化时间段，不同分化时段的神经干细胞处于不同的分化状态。持续48 h， 就可以得到4批处于不同分化状态的神经干细胞群体，观察其形态得图3 ；
按照上述步骤，不同的是分化培养基为C6 conditioned medium+1% FCS分化培养基， 同样制备不同分化状态的干细胞，从更换分化培养基开始，每12 h为一个分化时间段，不同 分化时段的神经干细胞处于不同的分化状态。持续48 h，就可以得到4批处于不同分化状 态的神经干细胞群体，观察其形态得图4。3不同分化状态神经干细胞迁移效率的分析
运用Durm chamber分析不同分化状态的神经干细胞的趋化性迁移能力。Durm chamber反映个体细胞的趋向性迁移速率与效率。在Dunn chamber (参见图5)的外槽中加入趋化因子，在内槽中加入含1% FCS的 H-DMEM进行诱导分化。将长有神经干细胞的盖片细胞面朝下盖在桥的正上方，并使盖玻片 的一端盖住桥而不盖住外槽，用工业凡士林封住盖片的三面。用吸水纸吸出外槽的液体后 加入趋化因子，工业凡士林封口。用Leica AF6000活细胞工作站(Germany)对桥上细胞的 迁移行为进行跟踪观察，每5 min拍摄一次，4 h为一个拍摄周期。使用Image J软件分析NSCs迁移的具体轨迹(参见图6，B)，计算从细胞迁移起始 点到终点的最短距离与细胞迁移总距离的比值，即为细胞的迁移效率，如图7 A，它反映细 胞迁移持续性的高低，数值越大表明迁移的持续性越高。实验数据和统计量化图由SYSTAT SigmaPlot和SYSTAT SigmaStat计算并绘制， 计量资料以均数士标准误(mean士SE)表示，P<0. 05认为有显著性差异。4不同迁移能力神经干细胞的制备
根据Durm chamber的分析结果，确定针对某一种细胞因子在某一浓度时具有最高迁移 效率的神经干细胞的分化状态。按前述方法制备该分化状态的神经干细胞，即可得到针对 该因子在该浓度时具有最高迁移效率的神经干细胞群体。由此，可为临床移植提供特定状 态具有最高迁移效率的神经干细胞种子。
实施例二，不同分化状态的神经干细胞对大鼠C6神经胶质瘤细胞条件培养基的 趋向性迁移效率
神经胶质瘤细胞可以释放多种炎症趋化因子和生长因子，如基质细胞衍生因子 SDF-I α (stromal cell-derived factor-1α),干细胞生长因子 SCF-I(stem cell factor-1)，单核细胞趋化蛋白 MCP-I (monocyte chemoattractant protein-1)。这些因子 可以诱导神经干细胞定向迁移至肿瘤细胞所在区域。本实施例分析了不同分化状态的神经 干细胞对C6胶质瘤细胞系制备的条件培养基及趋化因子SDF-I α趋化性迁移效率。1.研究方法
1. 1不同分化状态神经干细胞的制备见实施例一。1. 2 C6条件培养基的收集采用大鼠的C6胶质瘤细胞系，用含10%小牛血清的 H-DMEM培养基培养。当C6细胞融合度达到约60%左右时(图8)，吸掉培养瓶里的培养基， 使用PBS洗2 3次，随后加入H-DMEM，铺满培养瓶底部即可，置于37°C培养箱。培养24 h 后(图8 C)，吸出培液，300 r/min,3 min离心，将上清全部转移至新离心管中即可。为了保 证所收集的C6条件培养基中所含因子的活力，每次实验之前收集新鲜的条件培养基。1.3 Dunn chamber 分析不同分化状态的单个神经干细胞对C6条件培养基的趋 化性迁移行为。取生长第圹5 d的NSCs，吸去完全培养液，PBS洗两遍，更换为含1% FCS的 预先收集好的C6条件培养基，以H-DMEM+1% FCS分化诱导液和NSCs完全培养液为对照组。 Dunn chamber的使用方法和实验结果的统计同实施例一。2.研究结果
如图7B所示，使用含1% FCS的C6胶质瘤细胞条件培养基分化的NSCs与使用含1% FCS 的H-DMEM分化培养基相比，在分化的(Γ36 h内迁移效率无显著性差异O°>0. 05)，但在分化 的36、4 h内则存在显著性差异(/X0.05)，表明分化36、4 h的神经干细胞对C6胶质瘤细 胞条件培养基的趋向性迁移效率最高。实施例三不同分化状态的神经干细胞对SDF-I α的趋化性迁移效率
基质细胞衍生因子SDF-I α (stromal cell-derived factor)是由骨髓基质细胞产生 的CXC型趋化因子。在缺血的脑组织、心肌组织、肢体肌肉组织中，趋化因子SDF-I α明显 升高，促使成体干细胞定向迁移至病灶内，加速受损组织的修复再生。1.研究方法
1. 1不同分化状态神经干细胞的制备见实施例一。1. 2 Dunn chamber 分析不同分化状态的单个神经干细胞对SDF-I α的趋化性迁 移行为。取生长第圹5 d的NSCs，吸去完全培养液，PBS洗两遍，更换为含1% FCS的H-DMEM 分化诱导液，每次分别加入5 ng/ml、20 ng/ml和80 ng/ml的SDF-1 α，以H-DMEM+1% FCS 分化诱导液和NSCs完全培养液为对照组。Durm chamber的使用方法和实验结果的统计同 实施例一。2.研究结果
如图9所示，不同分化状态的神经干细胞对SDF-I α表现出显著的趋向性迁移，迁移效 率随分化状态及SDF-I α的浓度不同而有显著差异。对于5 ng/ml的SDF-I α，分化16 20 h NSCs的迁移效率达到最高。对于20 ng/ml的SDF-I α，分化0 4 h NSCs的迁移效率达 到最高。对于80 ng/ml的SDF-1 α，分化28 32 h NSCs的迁移效率达到最高。
实施例四不同分化状态神经干细胞对SCF-I的趋化性迁移效率
干细胞生长因子SCF-I (stem cell factor-1)是胶质瘤细胞系和脑损伤区域的神经元 中过表达的一种细胞因子，能够诱导神经干细胞产生趋化性迁移。1.研究方法
1.1不同分化状态神经干细胞的制备方法见实施例一。1. 2 Dunn chamber 分析不同分化状态的单个神经干细胞对SCF-I的趋化性迁移 行为。取生长第圹5 d的NSCs，吸去完全培养液，PBS洗两遍，更换为含1% FCS的H-DMEM 分化诱导液，每次分别加入5 ng/ml、25 ng/ml的SCF-1，以H-DMEM+1% FCS分化诱导液和 NSCs完全培养液为对照组。Durm chamber的使用方法和实验结果的统计同实施例一。2.研究结果
如图10所示，在分化的(Γ36 h内NSCs对5 ng/ml,25 ng/ml的SCF的趋向性迁移效 率均显著高于对照组(P<0.05)。在分化的36-48 h内，神经干细胞对5 ng/ml SCF的迁移 效率下降且与对照组没有显著差异，而对25 ng/ml SCF的趋向性迁移效率则达到0. 5，显著 高于5 ng/ml浓度组和对照组(P<0. 05)。可见，对于5 ng/ml SCF，分化28-32 h的神经干 细胞的迁移效率最高；对于25 ng/ml SCF，分化44-48 h的神经干细胞的迁移效率最高。实施例五不同分化状态的神经干细胞系C17. 2对VEGF的趋化性迁移效率 VEGF(vascular endothelial growth factor)，即血管内皮生长因子，具有调节神经干
细胞迁移的作用。本实施例考察了不同分化状态的神经干细胞系C17. 2对VEGF的趋向性 迁移效率。1.研究方法
1.1不同分化状态C17. 2的制备
C17. 2神经干细胞系的传代培养采用含有10% FCS和5% HS的H-DMEM/F12完全生长 培养基，在37°C、5% CO2培养箱中培养2 3 d，待细胞汇合度达到80%时可按照1 2 1 10的 比例进行传代，最大不超过1:10。传代时采用0. 05%的胰酶(Trypsin-EDTA solution)消 化，显微镜下观察细胞即将脱落时吸掉酶液，加入2 ml完全生长培养基终止消化并重悬细 胞，将细胞悬液分别转移至5个预先加有完全生长培养基的新培养瓶中，轻轻摇晃均勻，按 上述方法培养并传代。鉴定待细胞汇合度达到70%时，使用神经干细胞特异性抗体Nestin进行免疫荧 光染色，鉴定其是否对Nestin具备免疫阳性。诱导分化细胞接种24h后，待细胞汇合度达到70%时吸掉原有的完全生长培养 基，加入PBS洗2 3遍，更换为含1% N2的DMEM/F12分化培养基，置于37°C、5% CO2培养箱 中培养。取分化0 h、12 h、l d、3 d的细胞进行形态学和免疫荧光染色观察，及趋化性迁移实验。1. 2 Dunn chamber 分析不同分化状态的单个C17. 2神经干细胞系对VEGF的趋 化性迁移行为。取接种1 d的C17. 2细胞，吸去完全培养液，PBS洗两遍，更换为含1% N2 的DMEM/F12分化培养基，并加入50 ng/ml的VEGF，以不添加VEGF的分化培养基为对照。 Dunn chamber的使用方法和实验结果的统计同实施例一。2.研究结果
2.1不同分化状态C17. 2细胞的形态学观察
10如图11所示，未分化的C17. 2细胞呈圆形或成纤维细胞状，全部表达神经干细胞特 异性标志物nestin，但不表达早期神经元标志物β - III tubulin、神经胶质细胞标志物 A2B5、星形胶质细胞标志物GFAP及成熟神经元标志物NSE。诱导12 h，β-III tubulin和 A2B5阳性细胞开始出现。诱导1 d，GFAP阳性细胞开始出现，细胞形态呈扁平或有较长突 触的两极状态。随着分化时间的推移，Nestin阳性细胞数下降，而β-III tubulin、Α2Β5、 GFAP阳性细胞数增加。分化3 d，绝大多数细胞为β-III tubulin、Α2Β5、GFAP阳性，极少 数呈nestin阳性，没有细胞表达成熟神经元标志物NSE。结果表明，我们实验中所使用的 C17. 2神经干细胞系大多处于成神经分化的早期阶段，所以不表达成熟神经元标志物。2. 2不同分化状态C17. 2细胞对VEGF的趋向性迁移效率
如图12所示，分化0 d、12 h、l d的C17. 2细胞对50 ng/ml的VEGF表现出显著的趋 向性迁移，其趋向性迁移效率在分化1 d时达到最高，随着分化时间的推移，细胞的迁移效 率下降。可见，对于50 ng/ml的VEGF，分化1 d的C17. 2细胞的趋向性迁移效率最高。实施例六不同分化状态的神经干细胞系C17. 2对HGF的趋化性迁移效率
HGF(Hepatocyte growth factor)，即肝细胞生长因子，具有调节神经干细胞迁移的作 用。本实施例考察了不同分化状态的神经干细胞系C17. 2对HGF的趋向性迁移效率。1.研究方法
1. 1不同分化状态C17. 2的制备，同实施例五。1.2 Dunn chamber 分析不同分化状态的单个C17. 2神经干细胞系对HGF的趋化 性迁移行为。取接种1 d的C17. 2细胞，吸去完全培养液，PBS洗两遍，更换为含1% N2的 DMEM/F12分化培养基，并加入50 ng/ml的HGF，以不添加HGF的分化培养基为对照。Durm chamber的使用方法和实验结果的统计同发明实施例一。2.研究结果
如图13所示，分化0 d、12 h、l d的C17. 2细胞对50 ng/ml的HGF表现出显著的趋向 性迁移，其趋向性迁移效率在分化12 h时达到最高，随着分化时间的推移，细胞的迁移效率 显著下降。可见，对于50 ng/ml的HGF，分化12 h的C17. 2细胞的趋向性迁移效率最高。
权利要求
一种具有最高迁移效率的神经干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤分离培养神经干细胞，诱导分化，在分化的不同时段收集细胞，得到处于不同分化状态的神经干细胞；确定迁移区域趋化因子情况，所述趋化因子情况包括趋化因子的种类和浓度，分析计算步骤所得不同分化状态神经干细胞对该趋化因子情况作用下的迁移效率，找到迁移效率最高的神经干细胞的分化状态，由此即可制备得到对该迁移区域所需的具有最高迁移效率的神经干细胞。2010105424238100001dest_path_image001.jpg,761355dest_path_image002.jpg,840169dest_path_image001.jpg
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤 所述迁移效率，是指细胞迁移起 始点到终点的最短距离与细胞迁移总距离的比值，数值越大表明迁移的持续性越高，定向 迁移至病灶部位的能力越强。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括以下步骤确定迁移 区域趋化因子情况，所述趋化因子情况包括趋化因子的种类和浓度，在分化培养基中加入 与迁移区域相同种类、相同浓度的趋化因子，诱导细胞迁移；对细胞的定向迁移效率进行分 析，找到对迁移区域具有最高迁移效率的神经干细胞的分化状态，所述分化状态的神经干 细胞即为该迁移区域所需的具有最高迁移效率的神经干细胞。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤⑴中制备处于不同的分化状态的 神经干细胞的方法为在完全培养液中培养3-6 d的神经干细胞，细胞汇合度达到50-90% 左右时，吸掉完全培养液，更换为分化培养基，从更换分化培养基开始，不同时间段取样即 得到不同分化状态的神经干细胞。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述神经干细胞迁移效率的分析方法 为运用邓恩室，结合活细胞工作站对单个细胞的迁移行为进行追踪，分析神经干细胞迁移 的具体轨迹，计算干细胞的迁移效率，即从细胞迁移起始点到终点的最短距离与细胞迁移 总距离的比值。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述趋化因子为诱导神经干细胞趋向 性迁移的因子，包括所有能够引起不同分化状态的神经干细胞定向迁移的炎症趋化因子和 细胞生长因子。
7.一种治疗神经系统疾病、运动系统疾病、心血管系统疾病的药物，其特征在于，所述 药物包括采用权利要求1所述制备方法所得的神经干细胞。
8.根据权利要求7所述药物，其特征在于，还包括趋化因子。
9.一种治疗神经系统疾病、运动系统疾病、心血管系统疾病的药物载体，其特征在于， 所述药物载体包括采用权利要求1所述制备方法所得的神经干细胞。
10.根据权利要求9所述药物载体，其特征在于，还包括趋化因子。
全文摘要
本发明属于生物制品领域，公开了一种具有最高迁移效率的神经干细胞的制备方法，包括以下步骤(1)分离培养神经干细胞，诱导分化，在分化的不同时段收集细胞，得到处于不同分化状态的神经干细胞；(2)确定迁移区域趋化因子情况，所述趋化因子情况包括趋化因子的种类和浓度，分析计算步骤(1)所得不同分化状态神经干细胞对该趋化因子情况作用下的迁移效率，找到迁移效率最高的神经干细胞的分化状态，由此即可制备得到对该迁移区域所需的具有最高迁移效率的神经干细胞。本发明所述神经干细胞，可以针对不同情况的病灶区提供最佳迁移效率的神经干细胞，增加迁移到病灶区的神经干细胞，改善治疗效果，为干细胞移植治疗提供了最根本的保障。
文档编号A61P19/00GK101974487SQ20101054242
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者张焕相, 徐晓静, 贺丽虹 申请人:苏州大学