专利名称：苹果酸舒尼替尼脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及苹果酸舒尼替尼脂质体及其制备方法，具体涉及脂质体制备过程中乙醇含量的控制，确保制备过程中残留的乙醇对脂质体性质无显著性影响。
背景技术：
舒尼替尼及其苹果酸盐(Sunitinib malate, Sutent, SU11248, SU)为新型的多靶点酪酸激酶受体抑制剂，它对多种受体的酪氨酸激酶(TKIs)具有抑制作用，主要包括血小板衍生生长因子受体β (PDGFRii )、血管内皮生长因子受体1，2，3 (VEGFRl, 2，3)和干细胞因子受体(c-Kit)。此药对多种实体瘤有明显的抗肿瘤活性，在对多种类型肿瘤(如晚期肾细胞癌、胃肠道间质瘤、神经内分泌瘤)进行的
II和(或)ΙΠ期临床试验中均取得很好的疗效。2006年经FDA批准上市的Pfizer公司
的产品Sutent用于治疗晚期肾细胞癌和伊马替尼耐受的胃肠道间质瘤。Sutent的主要毒性反应包括全身反应(乏力、虚弱)、胃肠道反应(恶心、消化不良、腹泻、口腔黏膜炎)、血液学反应(中性粒细胞减少、血小板减少)以及皮肤反应(皮炎、毛发褪色)，临床采用停药手段以减少副反应，但由此引发的患者病情可能恶化的情况也令人担忧，因此考虑将其制备成脂质体以期解决上述问题。一般而言，磷脂分散于水相时，分子的疏水尾部聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成了具有双分子层结构的封闭囊泡，即脂质体。胆固醇的加入以及磷脂分子间存在较弱的相互作用力(如疏水相互作用、范德华力、氢键等)，碳氢链高度有序、磷脂分子排列紧密，使得脂质体以双分子层的结构相对稳定存在。但是由于温度、PH值和含水量等因素能够引发脂质体结构改变，可能引发被包封药物的泄露，所以在脂质体研发过程中脂质体的稳定性更会引起科研工作者的广泛重视。制备脂质体的经典方法中常常以氯仿、二氯甲烷等溶媒溶解膜材料，这存在有毒溶剂残留的问题。基于乙醇溶解膜材而建立起来的改良乙醇注入法，具有操作简单，所制得的脂质体粒子小且均勻，适于产业化生产。但当制剂中含有较高浓度乙醇时，脂质体间可能会产生聚集、融合，导致被包封药物的泄露，从而影响其稳定性。研究人员对其机理进行了深入的考察，归纳机理如下当脂质体间存在一定距离，脂质体膜间具有较弱的范德华力和静电排斥力；而当两表面接触很近(l-3nm)时，产生的水合力将引起强烈的排斥作用。水合力是由水分子与磷脂亲水基团的相互作用引起的，它能够阻止脂质体膜间的聚集，对脂质体的稳定起着相当大的作用。Hiroaki等以大单室脂质体(直径大约170 nm)为模型， 发现高浓度乙醇存在时，乙醇会干扰脂质体的水合层，减小脂质体间的水合力，引起交错相 (Interdigitated membranes)形成，由于交错相的膜较正常双层的膜薄，交错相的每个磷脂分子有较大的表面积，水合力较小，从而引发膜聚集，随后水分子被进一步排挤，头基在小范围内连接，且连接区域不断延伸至形成连接区，导致脂质体融合。即在制备过程中所加入的乙醇会对脂质体膜结构产生影响，过多的乙醇易造成脂质体的聚集、双分子层融合以及药物的渗漏，从而影响脂质体的包封率，粒径及稳定性等。因此已有的阿霉素脂质体
3(D0XIL，凯莱)商品中乙醇残留量要求小于0.01%。
发明内容
至今，尚无针对载药脂质体中乙醇含量允许上限的研究。我们考虑到乙醇毒性低、对脂质体膜材有良好溶解能力的特点，采用改良乙醇注入法制备空白脂质体，以离子梯度装载技术制备舒尼替尼脂质体。鉴于此工艺中不可避免地会残留乙醇的考虑，我们研究了不同乙醇含量对空白脂质体、梯度脂质体及载药脂质体包封率、粒径及抗肿瘤效率的影响，惊喜地发现最终脂质体制剂的乙醇残留量可以控制在10% (ν/ν)以内，极大地缩短简化工业生产中的乙醇含量控制提供参考。由此建立改良乙醇注入法制备SU脂质体的制备工艺，具体方法如下配制水化介质于45 75 ！保温待用；以制剂产品终体积百分比小于10%的乙醇，包括无水乙醇，于45 75 °C溶解脂质相；将脂质相按照一定速度加入至水化介质中，搅拌分散，降低粒径，得空白脂质体按照梯度载药法即可。脂质体药物制剂可通过常规技术测定药物在脂质体中的包封率。脂质体包封率测定的方法有超滤法、透析法、柱层析法、微柱离心法等，这些方法均存在一定问题。我们采用离子交换树脂(纤维)进行包封率测定，具有耗时短、操作简单、价格低廉、可重复使用、不需要昂贵的仪器设备等优点。本发明的有益技术效果如下1、采用硫酸铵梯度、蔗糖八硫酸酯铵梯度、EDTA铵梯度、柠檬酸梯度与金属离子梯度制备舒尼替尼脂质体的包封率大于90% ；2、首次明确采用改良乙醇注入法制备舒尼替尼脂质体时，乙醇无需全部除去，合理控制制备过程中残留的乙醇量，脂质体理化性质与疗效无显著性变化。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。这些实施例只是举例说明，它们不应当构成对本发明的限制。实施例1空白脂质体制备的一般方案 1一般方案1
空白脂质体处方氢化大豆磷脂(HSPC) 3g 胆固醇(CH)Ig
mPEG2000-DSPE0. 75g
称取处方中各脂质化合物，用适量无水乙醇于65°C水浴搅拌溶解，挥除乙醇，加入一定浓度硫酸铵((NH4)2SO4)溶液，65°C水浴搅拌20 min，得空白脂质体初品。将初品探头超声 8 min (200 wX2 min,400 wX6 min)后，依次通过 0. 8、0. 45、0. 22 μ m 的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液，最终磷脂质量浓度为50 mg · mL—1。2 一般方案2 空白脂质体处方氢化大豆磷脂(HSPC) 3g 胆固醇(CH)Ig mPEG2000-DSPE 0. 75g
称取处方中各脂质化合物，用适量无水乙醇于70°C水浴搅拌溶解，挥除乙醇，加入一定浓度乙二胺四乙酸铵(NH4EDTA)溶液，65°C水浴搅拌20 min，得空白脂质体初品。将初品探头超声 8 min (200 wX2 min、400 wX6 min)后，依次通过 0. 8、0. 45、0. 22 μ m 的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液，最终磷脂质量浓度为50 mg · mL—1。3 —般方案3 空白脂质体处方氢化大豆磷脂(HSPC) 3g 胆固醇(CH)Ig mPEG2000-DSPE 0. 75g
将HSPC、CH、mPE(i2_-DSPE以二氯甲烷溶解，按照薄膜法工艺除去二氯甲烷，得脂质薄膜。加入预热至65°C的硫酸铵((NH4)2SO4)溶液，65°C水浴搅拌20 min，得空白脂质体初品。 将初品探头超声 8 min(200 wX2 min,400 wX6 min)，再依次通过 0. 8 μ m、0. 45 μπι、0. 22 μ m微孔滤膜，得空白脂质体混悬液。
实施例2梯度脂质体的制备及载药
建立梯度的方法包括“透析法”、“超滤法”、“离子交换树脂法”、“分子筛分离法”等。下面以离子交换树脂法为例进行说明。取“实施例1”的空白脂质体混悬液0.3 mL，上样于经离心预处理的3 mL阴阳混合离子交换树脂柱(湿法装柱，阴离子树脂与阳离子树脂体积比为2: 1),2000 rpm离心4 min，得到具有(NH4)2SO4跨膜梯度的空白脂质体混悬液。取适量梯度脂质体与SU溶液(5. O mg · mL—1)混合，于一定温度下孵育一定时间， 即得SU-L。SU-L包封率的测定
采用阳离子交换树脂法测定SU-L包封率，具体操作如下精密移取0.1 mL SU-L 于10. O mL容量瓶中，加入1.6 mL蒸馏水，以体积分数为90%的异丙醇溶液(含0.75 mol · IZ1HCl)破乳并定容，摇勻，430 nm波长下测定吸光度Atl (药物总吸收度)。另精密移取0.1 mL SU-L，置于阳离子交换树脂柱顶端表面中央，2000 r · mirT1离心4 min，再于柱顶端加入400 μ 蒸馏水，2000 r ^irT1离心4 min,重复4次，合并洗脱液。洗脱液转移至 10.0 mL量瓶中，用体积分数为90%的异丙醇溶液(含0. 75 mol .L-1HCl)破乳并定容，摇勻， 测定吸光度A1 (包封药物吸收度)，计算包封率。1 SU-L的制备工艺优化一般方案1
在预实验的基础上，以(NH4)2SO4浓度(A)、药脂质量比(B)、载药温度(C)、载药时间(D) 为主要考察因素，每个因素取3个水平(表1)，选用(34)正交设计表(表2)进行实验， 按上述方法制备脂质体，测定包封率，以相应包封率(EE)为指标对结果进行分析。表1 4因素3水平表
mm
水乎-------
^(mmol'L"1)BC(O)D(miii)
1100Ti50Γθ
21501:85515
3_200_ 1:166020表2正交试验Z9 (34)表
权利要求
1.苹果酸舒尼替尼脂质体，其特征在于，其处方组成主要为药物与构建脂质体双分子膜的脂质类物质。
2.如权利要求1所述的苹果酸舒尼替尼脂质体，其特征在于，其中脂质体制剂的膜材是磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷月旨、心磷脂等天然或合成的磷脂或其衍生物、及上述物质通过常用方法氢化的物质；作为主要膜材可以只含一种磷脂，也可以含有多种磷脂；处方中尚可以加入其他成分，包括糖脂质、胆固醇、谷固醇类中任意一种或多种。
3.如权利要求2所述的苹果酸舒尼替尼脂质体，其特征在于，其中所述的脂质体制剂的膜材中磷脂优选HSPC、HEPC、DSPC，更优选HSPC ；“其他成分”优选胆固醇。
4.如权利要求1所述的苹果酸舒尼替尼脂质体，其特征在于，还含有亲水性高分子脂质衍生物，包括聚乙二醇与磷脂或胆固醇的脂质连接所得PEG脂质衍生物。
5.如权利要求4所述的苹果酸舒尼替尼脂质体，其特征在于，所述的亲水性高分子脂质衍生物为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺衍生物。
6.如权利要求4所述的苹果酸舒尼替尼脂质体，其特征在于，聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中PEG的分子量通常为200-20000道尔顿，优选1000-7000道尔顿，更优选 2000-5000道尔顿；其用量相对于膜脂质的比率通常为0. 0-20md%，优选0. 5_10%。
7.—种如权利要求1所述的苹果酸舒尼替尼脂质体的制备方法，其特征在于，通过改良乙醇注入法制备，其具体工艺如下配制水化介质于45 75 ！保温待用；以制剂产品终体积百分比小于10%的乙醇，包括无水乙醇，于45 75 °C溶解脂质相；将水化介质加入至脂质相中，搅拌分散，降低粒径，得空白脂质体；按照梯度载药法即可。
8.如权利要求1所述的苹果酸舒尼替尼脂质体的制备方法，其特征在于，所述的梯度载药法采用硫酸铵梯度、蔗糖八硫酸酯铵梯度、EDTA铵梯度、柠檬酸梯度、金属离子梯度将药物装载进入脂质体，控制乙醇含量为0-15% (V/V)0
9.如权利要求8所述的苹果酸舒尼替尼脂质体的制备方法，其特征在于，控制乙醇含量小于10% (V/V)。
10.如权利要求7所述的苹果酸舒尼替尼脂质体的制备方法，其特征在于，以硫酸铵梯度载药条件为=(NH4)2SO4浓度15(T200mM，药脂比1:6 1:8，载药温度55 60°C，载药时间15 20min ；以EDTA铵梯度载药条件为=NH4EDTA浓度200 300mmol · L—1，药脂比1:8 1:6 (w/w)，60 65°C 载药 10 15 min。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了苹果酸舒尼替尼脂质体及其制备方法，本发明的苹果酸舒尼替尼脂质体的处方为药物与构建脂质体双分子膜的脂质类物质，通过改良乙醇注入法制备。本发明还考察了所制备处方中乙醇含量对其包封率、粒径分布、稳定性及抗肿瘤效果的影响。结果表明，梯度法载药制备的脂质体包封率大于90%，当控制乙醇含量不大于10%时，脂质体相关参数几乎没有变化，为舒尼替尼脂质体制备及工业生产中的乙醇含量控制提供参考。
文档编号A61P35/00GK102485212SQ20101056823
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者张艳晶, 邓意辉 申请人:沈阳药科大学