复合物和生产过程的制作方法

专利名称：复合物和生产过程的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗性蛋白复合物的制备过程，以及用于该过程的装置和试剂。
背景技术：
重组α-乳清蛋白的突变形式在本技术中是已知的，而且，虽然折叠和熔球形式的许多已找到的性质已显示是与天然蛋白类似，但一般认为该些突变形式的稳定性一般有所降低。部分展开态或熔球态的α-乳清蛋白本身之前一直被用以来形成生物活性复合物 (斯文森等人。美国国家科学院院刊0000)97(8)4221-42 )。然而，本申请人发现可使用某特定类型的重组蛋白来生产具有独特组成特征和结构的治疗性活性复合物，如被n. m. r所显示。尽管有这些差异，该些复合物仍保留有用的生物活性，而且可被高效地制备。

发明内容
因此，根据本发明提供了生产生物活性复合物的方法，所述方法包含使带有 α-乳清蛋白序列或其片段但缺少分子内二硫键或交联的重组蛋白在形成生物活性复合物的条件下与油酸接触，并隔离该复合物。通过保证该重组蛋白缺少分子内二硫交联，该分子会是三维非天然的，并在其原有的内源性生物活性方面是完全非活性的。虽然这可透过其他途径，例如通过添加硫醇化合物或改变该蛋白的PH值而达成，但是也可通过例如使天然α -乳清蛋白中的半胱氨酸残基被改变为其他残基，特别是丙氨酸残基而达成。优选地，所有半胱氨酸残基被改变为其他残基，例如丙氨酸残基。本文所使用的词语“生物活性”是指该复合物能够诱导肿瘤细胞死亡，特别是通过肿瘤细胞的凋亡，和/或具有在天然单体α -乳清蛋白形式时看不到的杀菌效果。术语“其片段”是指会形成具有与包括完整的α -乳清蛋白氨基酸序列的复合物类似的活性复合物的该给定氨基酸序列的任何部分。片段可包含来自全长蛋白之内的不止一个部分，其连在一起。部分可适当地包含至少5个，更优选的是至少10个来自该基本序列的连续氨基酸。合适的片段会包含长度为至少20个氨基酸，更优选的是至少100个氨基酸的缺失突变体。其包括来自该蛋白的小区域或这些区域的组合。合适的片段会包括形成α和β结构域之间相交的区域，该区域在人α-乳清蛋白中由结构中的氨基酸34-38和82-86限定。因此，合适的片段会包括这些区域，更优选的包括该天然蛋白的氨基酸34-86的整个区域。然而，其他活性片段也可被找到。特别是该重组蛋白为基于人α-乳清蛋白的序列，但也可使用其他来源的α-乳清蛋白，包括牛或羊α-乳清蛋白来导出该重组蛋白。可用来使重组蛋白和油酸转化为生物活性复合物的方法与例如在第W099/26979 号和第W02008/138348号专利中所述的方法类似，其内容以引用的方式并入本文中。然而，按照本发明的方法，明显的生物活性产物可更容易地获得好的产量。特别是在使用本发明的方法时，可方便地得到高产量的生物活性复合物，特别是由从柱洗脱出来的单一组分得到而无需特别长的折叠过程。以上所界定的该重组蛋白在允许离子交换的条件下，特别是当其发生在离子交换柱上，尤其是阴离子交换柱，例如DEAE-Trisacryl M柱(可购自Biokpra，，维勒纳夫，法国)，与油酸适当地接触。在将该重组蛋白应用于该柱之前，用油酸将该柱适当地“预先老化(pre-conditioned) ”。这可通过首先用油酸洗脱或老化该柱而达成。适当地，该油酸在经过含有新的未被使用的离子交换材料例如DEAE Trisacryl的柱时被洗脱。合适的洗脱缓冲液包括PH值为8. 5的Tris-HCl。以这种方式应用于该柱的油酸组合物的量可以是少的，视乎柱的尺寸和需要被转化为生物活性复合物的重组蛋白的体积等因素而定。例如，已发现能使用仅IOmg的油酸来老化14cm χ 1. 6cm的柱。在将该重组蛋白应用于该柱(例如在合适的缓冲剂的溶液中)之后，接着用线性盐梯度将其洗脱，并隔离在高盐(1M NaCl或相等物)下洗脱的组分。使用本发明的方法， 大体上所有的产物都能从这一个峰获得，但先前总是需要隔离两个峰。由于无需使表达的蛋白折叠成天然态并且无需获得并汇集多个组分，所以这大大提高了生产效率和产物的纯度。因此，在某特定实施例中，本发明提供了生产生物活性复合物的方法，所述方法包含使带有α-乳清蛋白序列或其片段但缺少分子内二硫键(交联)的重组蛋白在阴离子交换柱形成生物活性复合物的条件下与油酸接触，用盐梯度对该柱进行洗脱，并使该复合物从在高盐浓度下洗脱的单一组分隔离出来。词语“高盐浓度”是指带有阳离子的盐，例如卤化物和特别是氯化物，的浓度超过 0. 5Μ，例如超过0. 75Μ，特别是约1Μ。所需的浓度可视乎所用的盐而不同，但在某个特定实施例中，该盐为NaCl，并适当地为IM NaCl。按照本发明，该“带有α-乳清蛋白序列的重组蛋白”包含带有天然成熟的α-乳清蛋白序列的蛋白，但在成熟的人^1-乳清蛋白的全长序列中的位置6、28、61、73、77、91、 111和120找到的所有半胱氨酸被突变成为其他氨基酸，例如丙氨酸，其不产生二硫桥。因此，可利用于按照本发明的蛋白特别的包含蛋白SEQ ID NO 1。KQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWAKSSQVPQS RNIADISADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYffLAHKALATEKLEQffLAEKL(SEQ ID NO 1)在这里粗体显示天然人α -乳清蛋白中的半胱氨酸的突变位置。本申请人发现有一些氨基酸残基，例如多达20个氨基酸，可附在该蛋白质的末端，如需要的话，例如用于表达(expression)。因此，特别在本发明的方法中使用如SEQ IDNO 1所示但在N端带有另外的蛋氨酸(以下所示的SEQ ID NO 2)的重组蛋白。使用这个序列而获得的复合物被称为Cys5670A。该复合物在用n. m. r检测时显示了独特的性质， 从而形成了本发明的一特定方面。使用传统的重组表达方法，本方法中所使用的重组蛋白以纯的形态合适地产生。 特别的是，编码了该所需要的重组α -乳清蛋白的DNA可被插入于合适的表达载体，例如质粒，然后可使用传统方法利用该表达载体，来转化宿主细胞，例如原核细胞如大肠杆菌或真核细胞，如特定的昆虫细胞。
通过使用上述的重组蛋白，就无需透过预处理步骤，例如通过用钙鳌合剂，如 EDTA(乙二胺四乙酸)处理，使该物质经受低pH值或高温，以去除钙和增加所存在的熔球似的物质的量。在使用天然人α-乳清蛋白或修饰形式时，这种步骤通常是优选的，在该修改形式中，为产生生物活性复合物而剩下一些半胱氨酸残基。适当的是，虽然人乳的含酪蛋白组分能提供该物质的便利来源，并可被用于先前展示的过程，但是用于该过程中的油酸是纯的。预处理后的柱能够被重复地使用，以使带有α -乳清蛋白的序列或其片段的重组蛋白的众多组分转化为上述的生物活性复合物。该柱一旦耗尽或转化率降至不可接受的水平，重复该预处理步骤就能恢复复合物生产活动。使用本发明的过程所获得的产物是新颖的，并从而形成本发明的另一方面。因此，本发明进一步提供了如上所述的带有α-乳清蛋白的序列或其片段的重组蛋白的生物活性复合物，和油酸。特别的是，本发明提供了包含SEQ ID NO 2的重组蛋白和油酸的生物活性复合物，其被称为Cys5670A。MKQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWAKSSQVPQ SRNIADISADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYffLAHKALATEKLEQffLAEKL (SEQ ID NO 2)该复合物已被找到是具有生物活性的其具有诱发肿瘤细胞死亡的活性，例如透过凋亡和/或具有至少等同于用其他生物活性复合物例如HAMLET所得到的杀菌效果。因此，可通过用传统的方式，把其与药学上可接受的载体结合来配制成有用的药物组合物。这种组合物形成本发明的另一方面。按照本发明的这个方面的组合物是适于外用的形式的合适药用组合物，例如为乳膏、软膏、凝胶或者水性或油性溶液或悬浮液。这些可包括通常已知的载体、填充剂和/或赋形剂(expedients)，其为药学上可接受的。外用溶液或乳膏适当地含有将蛋白复合物与稀释剂或乳膏基质在一起的乳化剂。该复合物的每日剂量各异，取决于按照正常的临床治疗实践，患者和疾病的性质等等。一般规则是每次给药使用2至200mg/剂的该生物活性复合物。本发明的另一方面提供了用于治疗癌症的方法，其包含给予需要的患者如上所述的生物活性复合物。特别的是，该复合物可被用于治疗癌症，如人的皮肤乳头状瘤、人的膀胱癌和成胶质细胞瘤。在后者的情况下，可通过本技术已知的注射来给药。本发明进一步提供了用于疗法的以上所限定的生物活性复合物，特别是用于治疗癌症。半胱氨酸残基的消除会导致生物活性复合物的产量提高，这是未料到的。因此，本发明的又一方面提供了用于提高生物活性复合物的产量的方法，该生物活性复合物可通过包含在离子交换条件下使α-乳清蛋白或其片段与油酸接触的过程而得，所述方法在所述过程中包含使用带有α-乳清蛋白的序列或其片段但缺少至少一些在该天然蛋白中找到的分子内二硫交联的组合蛋白。如前所述，该些二硫交联通过使半胱氨酸残基改变为其他氨基酸而被适当地消除。特别的是，所有二硫交联例如通过使所有半胱氨酸残基改变为不同的氨基酸，例如丙氨酸来将其消除。
此外，本发明提供了在生物活性复合物的制备中，使用带有α-乳清蛋白序列或其片段但缺少分子内二硫键或交联的重组蛋白。特别是该重组蛋白带有人α-乳清蛋白的序列或其片段，其中半胱氨酸残基特别是所有半胱氨酸残基被改变为不同的氨基酸。
用于本发明的这些方面的重组蛋白可含有如上所述的额外的氨基酸。


现参照所附的简图通过例子对本发明进行特别地描述，在附图中图1涉及α-乳清蛋白的结构，以及如上所述的重组蛋白和天然α-乳清蛋白在已被油酸老化的介质转化为生物活性复合物。(A)显示了含有8个半胱氨酸的α-乳清蛋白的结构，该8个半胱氨酸形成四个贯穿该蛋白的二硫键。该些二硫键以黑色显示，相关的半胱氨酸的残基数亦被标明。钙离子以黑色显示。带状结构从PDB登陆号IHML(IO)得到， 并以MOLMOL修改(安德森等人，生物化学199736(39) 11648-11654。(B)这是显示在低盐 (组分1)和高盐(组分2)下随时间洗脱复合物的图。为形成该复合物，将SEQ ID NO 2的重组蛋白应用于已被油酸老化的离子交换柱，并用NaCl梯度(电导率追迹线为淡灰色)洗脱该复合物。以带有EDTA或不带EDTA的人α-乳清蛋白作为对照。(C)这是显示转化产量的列表，而这些产量被测定为(B)中0-110分钟(组分1)和110-140分钟(组分2)的曲线以下的面积。图2显示了 α-乳清蛋白和不同复合物的圆二色光谱的结果。㈧用近-UV⑶ 光谱检测重组蛋白(黑色实线)和从其获得的生物活性复合物(称为Cys5670A)(黑色虚线)的三级结构，该重组蛋白带有α-乳清蛋白的序列，该序列中的所有半胱氨酸都被转化为丙氨酸。该光谱在5mM Tris, pH 8. 5中被记录在70 μ M，以天然α-乳清蛋白(灰色实线)、阿朴(apo) α -乳清蛋白(灰色十字)和HAMLET(灰色虚线)作为对照。先前已对人α-乳清蛋白、α-乳清蛋白A11_Ala和HAMLET的光谱进行过描述。(B)用远-UV⑶光谱检测HAMLET (灰色虚线)和Cys5670A (黑色虚线)的二级结构。该些对照、α-乳清蛋白 (灰色实线)和α -乳清蛋白A11_Ala(黑色实线)录得的光谱与先前的报告一致。该光谱在 5mMTris, pH 8. 5 中被记录在 28 μ Μ。图3对比了 HAMLET和本发明的生物复合物在杀死肿瘤细胞上的效果。把(A) L1210、(B) Jurkat, (C)HeLa 禾Π (D)Α549 细胞暴露于 HAMLET 或 Cys5670A 6 小时。用 7、14 禾口 21 μ M的HAMLET处理淋巴瘤细胞(L1210和Jurkat)，以及用14J8和42 μ M处理癌细胞 (Α549和HeLa)。左面板显示利用台盼蓝排除法以未处理的细胞的百分比测定细胞死亡。右面板显示HAMLET (黑色三角形)和Cys5670A (黑色圆形)所造成的以培养基对照(medium control)的百分比的ATP含量的减少。显示两至五个实验的平均值，以标准差为误差棒。以 α-乳清蛋白(灰色三角形)和α-乳清蛋白An_Ala (灰色圆形)蛋白作为对照。Cys5670A 与HAMLET显示出具有同样的生物活性，尤其在HeLa和A549细胞系中活性更大。图4说明了以Alexa标记的复合物的细胞内化。用共轭焦显微镜使用以 Alexa-fluor标记的复合物来检测A549细胞对本发明的生物复合物(Cys5670A)的内化。 以α-乳清蛋白、带有所有半胱氨酸被丙氨酸取代的α-乳清蛋白的序列的重组蛋白和 HAMLET作为对照。以35 μ M用15分钟和3小时处理细胞。(A)HAMLET 15分钟后被肿瘤细胞迅速地内化，3小时后发生进一步内化。(B)Cys5670A的内化要比HAMLET慢，但3小时后类似的量都存在于该些细胞中。(C) α-乳清蛋白或⑶α-乳清蛋白A11‘不被该些细胞内化。图5显示了用包括本发明的复合物的生物活性复合物处理过的人的肺癌细胞的 TUNEL染色的结果。利用TUNEL染色来检测暴露于HAMLET和Cys5670A后，(A)L1210、(B) Jurkat, (C)HeLa和(D)A549细胞中的DNA损伤的证据。HAMLET和Cys5670A(淋巴瘤细胞中14μΜ，癌细胞中^μΜ)导致四个细胞系的核DNA损伤，其由阳性的TUNEL染色所指示。 α-乳清蛋白和α-乳清蛋白A11_Ala(淋巴瘤细胞中21μΜ，癌细胞中42μΜ)没有导致DNA 损伤。图6和7显示了人α-乳清蛋白(HLA)、如下所述的重组人α -乳清蛋白 (rHLAall_Ala)和蛋白油酸复合物的NMR谱的结果。
具体实施例方式例 1蛋白表达和纯化野生型α-乳清蛋白在位置6、观、61、73、77、91、111和120含有八个半胱氨酸， 形成四个二硫键，其稳定了天然状态(图1Α)。有两个二硫键存在于α-结构域[6-120， 28-111]中，一个存在于β-结构域W1-77]中，一个存在于两个结构域[73-91]之间的相交处中。该蛋白同样由钙离子稳定，若除去该钙离子，则使α-乳清蛋白失去其明显的三级结构并采用熔球态。使用将带有其中所有半胱氨酸被改变为丙氨酸的人α-乳清蛋白的序列的重组蛋白编码的载体PALAALA，该载体通过将点突变并进野生型载体pALA而获得，该α _乳清蛋白基因被克隆到以Τ7-聚合酶为基础的表达载体pAED4中(哈夫Μ.Ε.结构生物学新观点 (200313(6),674-682).该载体被转化为大肠杆菌BL-21*，该重组蛋白被如先前所述般表达和纯化(Peng Ζ. Y.等人，生物化学(1995) 34 (104)，3241-3252 ；舒尔曼B.等人，分子生物学期刊253,651-657)但带有一些修改。将包涵体溶解在尿素缓冲液(IOmM Tris、8M尿素、5mM已还原谷胱甘肽，pH 8. 0)中并且载到用20mM Tris, pH 8. 0进行平衡的DEAE-纤维素(Whatman，布伦特福德，英国)柱。用25mM TrisUOmM已还原谷胱甘肽、0. 25M NaCl, WpH 8. 0冲洗该柱，并用25mM Tris、7M尿素、0. 5MKC1，以pH 8.0洗脱该蛋白。将组分汇集并将其以静止的自来水透析M小时，并以流动的自来水透析至少48小时(Spectra/ Pore，拉格那希尔，加利福尼亚州，截留分子重量为3. 5kDa)。如果在透析过程中发生沉淀， 则将沉淀物溶在5M尿素中，然后将其以流动的自来水透析并冻干。将透析后的样本载到用 25mM Tris、0. 2mM CaCl2，以 pH 7. 8 进行平衡的 DEAE-葡聚糖纤维素(S印hacel) (Amersham Biosciences，乌普萨拉，瑞典)柱，然后用线性的盐梯度05mM Tris、0. 2mM CaCl2,0-0. 4M NaCl,pH 7.8)洗脱。将组分汇集，在pH 7以蒸馏水(截留分子重量为3. 5kDa)透析，并冻干。纯化后的突变蛋白是SEQ ID No 2，其为人α-乳清蛋白的序列但含有附加的N-末端蛋氨酸残基，该残基未被除去。该重组蛋白相对高产量(100mg/L的培养物)的被表达在大肠杆菌BL21*中并被纯化至均一程度。由于该重组蛋白将所有半胱氨酸取代为丙氨酸，所以其不含有二硫键。然而，已知道天然样的拓扑要被保存。该突变体采用了熔球样的构象，如近-UV CD光谱和NMR所示，以及保留下来的二级结构，如远-UV⑶光谱所示。这种蛋白被称为rHLAall_Ala。例 2用油酸通过离子交换层析法形成复合物如前所述，用IOml的DEAE-Trisacryl M(BioSepra,维勒纳夫，法国)填塞柱 (14cmx 1.6cm)，并用油酸(C18:l:9cis) (Larodan，马尔默，瑞典)将其老化(斯文森等人。 美国国家科学院院刊0000)97 (8) 4221-42 和彼得森J.等人，生物化学与生物物理研究通讯0006)345(1060-270)。基本上，用超声处理将十毫克油酸溶在500 μ 1的99. 5 %的乙醇中。在加入IOmM Tris-HCl ph 8. 5 (IOml)之后，将该溶液应用于该柱。将五毫克蛋白 (如例1中所述而得的重组蛋白rHLAall_Ala)，或者包含天然α -乳清蛋白或用过量EDTA预培养的天然α-乳清蛋白的对照溶在缓冲液(50mM Tris/HCl pH 8.5,0. IM NaCl)中，并个别地将其加至该柱。在应用NaCl梯度之后收集组分。用NaCl梯度洗脱该柱，(用包含IOmM Tris HCL (pH 8. 5)的缓冲液A，接着是缓冲液B，其为含有IM NaCl的缓冲液A)，并检测高盐之前洗脱的组分(组分1，t = 0-110分钟)或高盐之后洗脱的组分(组分2，t = 110-130分钟)(图1B)。将使用例1的重组蛋白rHLAa11‘所得的复合物(Cys5670A)洗脱为与HAMLET相同的位置的尖峰。相反，野生型 α -乳清蛋白不生成任何在应用高盐后洗脱的重要复合物(图IB和C)。事实上，例1的重组蛋白rHLAa11‘被找到比以EDTA处理的α -乳清蛋白更高效地转化为生物活性复合物， 而已被应用的蛋白的回收率分别为99% (范围87-99%，SD 4. 5，η = 6)相比71 % (范围 67-94%, SD 11. 3,η = 5)(图1C)。这可反映出该突变蛋白的构象的结构均一程度较大，在这里较大部分的例1的重组蛋白rHLAall_Ala更容易在层析转化为脂肪酸结合的复合物的条件下采用熔球态。通过以蒸馏水(Spectra/Pore，膜截留3. 5kDa)透析接着冻干来将盐除去。例 3α-乳清蛋白变体的圆二色光谱在25°C下对α -乳清蛋白、例1的重组蛋白rHLAall_Ala、HAMLET和使用例1的该重组蛋白rHLAall_Ala得到的Cys5670A收集远-和近-UV⑶光谱。冻干后的物质为近-和远-UV ⑶光谱被分别溶在5mM Tris, pH 8. 5中至70和28 μ M。近-UV光谱在240和320nm之间获得，而远-UV光谱则在190和250nm之间获得。波长间距是lnm，反应时间是8秒，扫描率是IOnm/分钟。将六次扫描的平均值展示出来，当中平均残基椭圆率θ m如先前所述计算出来，单位为deg .cm2 .dmorH斯文森M.等人。生物化学杂志(1999) 274 (10)，6388-6396)。近-UV⑶光谱检测到例1的重组蛋白rHLAall_Ala中的三级相互作用的大幅弱化 (图2A)，这与α-乳清蛋白的熔球情况相符。事实上，在室温下，阿朴-α-乳清蛋白并非呈完全熔球(图2Α)，反而找到蛋白分子总体明显地分开成天然和熔球态，平衡的共存，并且使光谱平均。因此，在相同的条件下，较大部分的例1的重组蛋白rHLAall_Ala的分子处于真正的熔球态，可有助于所观察到的如上所述的例1的重组蛋白rHLAall_Ala与油酸被提高的的转化产量。在转化为生物活性复合物之后，该复合物的近-UV光谱与该唯突变蛋白光谱几乎相同，显示了油酸的结合并未增加可检测的三级结构的量(图2A)。关于二级结构，例1的该重组蛋白rHLAall_Ala和从其获得的生物活性复合物(Cys5670A)都保留了在远-UV⑶光谱所显示的野生型蛋白在定性上类似的二级结构(图 2B)，又一次与先前的研究密切相关。例 4细胞死亡检定使用老鼠的淋巴瘤细胞(L1210、ATCC、CCL_219)、人的淋巴瘤细胞(Jurkat、ATCC、 TIB-152)、人的肺癌细胞(AM9、ATCC、CCL-185)和人的子宫颈癌细胞(HeLa、ATCC、CCL-2) 来检测Cys5670A的抗肿瘤的作用。获取、清洗这些细胞并使其再次悬浮在缺乏胎牛血清的 RPMI 1640培养基(PAA Laboratories GmbH，柏斯澄，奥地利)中。对于粘附细胞，使用维尔烯(140mM NaCl,2. 4mM KCl、8mM Na2HPO4U. 6mM ΚΗ2Ρ04、0· 5mM EDTA，pH 7. 2)进行分离。 可将这些细胞以IxlO6细胞/孔(TPP，特拉萨丁根，瑞士)接种到M个孔板中。将冻干后的物质以0.7mM(MW 14, 200g/mol)溶在磷酸盐缓冲盐水(PBQ中，并将其加至孔中，使其最后浓度为7和42 μ M之间。所述的HAMLET和Cys5670A的浓度指蛋白质构造的摩尔浓度。将细胞置于在5% CO2的大气中在37°C下培养，1小时后将胎牛血清加至各孔中至最后浓度为 5 %。6小时后利用台盼蓝排除法以干涉差显微术来测定细胞活力。使用ATP Lite (荧光ATP 检测检定系统，PerkinElmer，波士顿，马萨诸塞州)检测ATP含量并使用光度计(LUMIstar， BMG Labtech，奥芬堡，德国)检测荧光。6小时后的失活定量会被量化为ATP含量的减少和台盼蓝染色的增加(图3)。已显示出，Cys5670A以剂量依赖方式杀死肿瘤细胞。在暴露于已测试的最高浓度(淋巴瘤细胞为21 μ M，癌细胞为42 μ M) 6小时之后，所有细胞中超过80%被杀死。用HAMLET得到类似的结果在暴露于最高浓度6小时之后，超过60%的细胞被杀死。在抗肿瘤的作用上，该两个复合物之间无统计上的显著差异(P >0.05，单因素方差分析(one way ANOVA))。该结果显示了 Cys5670A与HAMLET —样活跃。此外，与天然的唯蛋白对照类似，仅例1的重组蛋白rHLAall_Ala没有减少细胞活性 (图3)。观察到用如上所述得到的复合物和例1的无脂肪酸的重组蛋白rHLAall_Ala处理的细胞活性无统计上显著差异(P < 0.005，单因素方差分析)。很多研究表明蛋白的部分展开，及接着的低聚反应和聚集产生了带有细胞毒性的淀粉样结构。在α-乳清蛋白的酸性熔球形式(“Α-形态”)的情况下，已确实知道淀粉样原纤维会在高盐浓度存在时形成。然而，这种溶液条件在这里不与例1的重组蛋白rHLAall_Ala—并使用，从而显示出仅部分展开至该熔球形式不会使该蛋白有细胞毒性。利用单因素方差分析(ANOVA)，接着利用Bonferroni多重比较检验测试来比较对细胞活性的效果的差异。使用GraphPad InStat3for Macintosh version 3. Ob进行分析。例 5肿瘤细胞中Cys5670A的摄取利用以 AlexaFluor 568 标记的蛋白(Molecular Probes, hvitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)研究该重组蛋白和从其获得的Cys5670A的细胞摄取。将人的肺癌细胞 (A549)接种到8孔腔室玻片(Nunc，罗切斯特，纽约州)上至密度为50，000个细胞/孔，并置于5% CO2中在37°C下培养一夜。将以ALEXA标记的和未标记的蛋白混合至1 10的比例，并在缺乏胎牛血清的情况下应用于该些细胞至最后浓度为35 μ M。在37°C下，5% CO2 中培养细胞，15分钟后将其固定在3. 7%的甲醛中。当在培养3小时间，在一小时后加入胎牛血清至最后浓度为5%。用共轭焦显微镜(LSM510META confocal system，卡尔蔡司，耶拿，德国)分析细胞的摄取，结果如图4所示。使用以如例2中所述的天然α-乳清蛋白得到的HAMLET作为对照。一如所料，HAMLET被肿瘤细胞快速地内化(图4A)，如在暴露15分钟后所示。在3 小时后发生进一步提高。Cys5670A显示类似模式快速内化后易位至核心(图4B)。虽然摄取在15分钟后与HAMLET相对比是弱的，但在3小时后已摄取了 Cys5670A的细胞数量是差不多。摄取动力学上有微小差异的原因并不是立即显而易见的，然而人们认为Cys5670A 复合物内重组蛋白相对较大的灵活性可能在延迟初始摄取方面有些关系。不带有油酸的突变蛋白的内化亦与Cys5670A(35 μ M的Cys5670A或例1的重组蛋白rHLAall_Ala)进行对比(图4C和D)。该突变蛋白与细胞表面结合，但不被肿瘤细胞内化。 该重组蛋白的大聚集体形成，而其中一些保持粘附在细胞表面15分钟和3小时(图4D)。该结果显示了内化进入肿瘤细胞是HAMLET和Cys5670A的一般特征，表明需要脂肪酸辅因子来摄取入肿瘤细胞，以及用于抗肿瘤的作用。而且，没有证据表明该重组蛋白本身可被内化。例 6TUNEL 染色透过利用TUNEL检定已显示出，HAMLET会导致肿瘤细胞系和体内人的肿瘤的DNA 受损(莫斯伯格等人。国际肿瘤期刊0007) 121 (6) 1352-1359)。为检测对Cys5670A反应的DNA受损程度，把例4中使用的四个肿瘤细胞系暴露于该复合物6小时(淋巴瘤细胞为 14 μ Μ,癌细胞为观μ Μ)。以HAMLET、例1的重组蛋白rHLAa11‘和α -乳清蛋白作为对照。利用离心分离法获取细胞并将其固定在PBS稀释了的4%的多聚甲醛。将这些细胞离心分离到涂了 L-赖氨酸的显微镜玻片0 g，5分钟，Cytospin 3，Siandon,柴郡，英国)，并储存在_20°C下。用TUNEL检定法(Roche，巴塞尔，瑞士)识别带有核DNA损伤的细胞。简言之，将这些玻片放在室温下解冻，在PBS中冲洗两次，并用0. 1 %的柠檬酸钠，0. 1 % 的Triton X-100渗透。应用TUNEL反应混合物，并将该些玻片在37°C下在5%的(X)2中培养1小时。用PBS冲洗载玻片三次，用盖玻片和封片剂(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)将其封住并用共轭焦显微镜检测。Cys5670A导致的DNA损伤在所有细胞类型中以TUNEL染色检测到(图5)。TUNEL阳性细胞的频率与以HAMLET处理的细胞中的频率类似。相比之下，例1的重组蛋白rHLAall_Ala 和α-乳清蛋白并未影响TUNEL染色。该结果显示了油酸/熔球复合物的细胞毒性效应都包括核DNA的损伤。总之，例1中带有α-乳清蛋白的序列的重组蛋白rHLAall_Ala在油酸存在的情况下，容易被转化为生物活性复合物，该α-乳清蛋白的序列中所有八个半胱氨酸残基都被取代为丙氨酸，使得该蛋白在所有条件下为非天然的。事实上，该生产过程好得令人吃惊， 其在单峰中并产量亦被提高。这在生产中是特别有利的。此外，所获得的复合物展示了对淋巴瘤和癌细胞系的强大的抗肿瘤活动。通过共轭焦显微镜，显示了在肿瘤细胞的核内聚集，从而繁殖出具有相同抗肿瘤活动的HAMLET的细胞运输模式。因此，Cys5670A代表了特别优选的候选药物。例 7
Cys5670A的结构研究(实验程序)1HNMR光谱法使用2. Oml kba离心式脱盐柱(Thermo Scientific)将例1中所述的重组人α -乳清蛋白rHLAall-Ala、HAMLET和Cys5670A溶剂交换为具pH 7. 0和带有2. OM 尿素的磷酸钠缓冲液。将人HLA，其含有结合Ca2+离子，在蒸馏水中溶剂交换为2. OM尿素， PH值被调整至7。在所有情况下，该溶剂含有10%的1)20。使用间接侦测微量探头(Bruker BioSpin)，在600MHz Ultrashield光谱仪上获得该四个样本的一维1H NMR光谱。使用变温单元来保持温度为20°C、30°C、4(rC、5(rC和55°C。除HLA之外，该rHLAall-Ala、HAMLET和Cys5670A的一维1H NMR光谱不被充分地解析， 而且宽度很大，如α-乳清蛋白的熔球种类中所见(图6A-D)。α-乳清蛋白中的天然或天然样三维结构的其中一个关键的光谱特征是与Ile95的δ CH3质子(在30°C下为-0. 7ppm) 和Val92的YCH3质子(在30°C下为-0. 5ppm)对应的往高磁场位移的强烈的甲基共振(图 6B和7A)。使用这一标准，尽管HAMLET的峰一般是宽而遍布光谱的，其仍含有相当多的天然样结构(图7A)，即使比折叠的HLA少得多。这与近-UV⑶光谱一致，在当中HAMLET的椭圆率幅度是阿朴-HLA和rHLAall_A17CyS5670A之间。作为进一步区别这些样本的方法，各蛋白或蛋白脂肪酸复合物在2. OM尿素存在的情况下经受逐渐升高的温度。添加尿素的原因是两面的首先是帮助该些蛋白尤其是rHLAall_Ala溶解，第二是微妙地增强分子的动态性质，以从较快的时间尺度(用展开的高度动态的分子所观察到的)区分微秒至毫秒的时间尺度(在熔球中观察到的)的构象涨落。已注意到的是添加2M尿素不会使油酸从蛋白剥离，其存在也不会对HAMLET和Cys5670A的细胞毒性活动有负面影响(用2M尿素和磷酸盐缓冲盐水培养30分钟，未显示数据)。对于HLA的情况，从因完全折叠的天然结构而致的广泛分散的化学位移和明显的峰开始(20°C和30°C)，该峰逐渐地变宽，同时，该化学位移的分散看起来在范围内变窄 (40°C至55°C )(图6B)。特有的往高磁场位移的甲基共振在高温下仍旧存在，然而，峰高随其变宽而变得为越来越低(图7A，B)，表明在55°C下而2. OM的尿素存在的情况下有大量的熔球分子。作为对比，α-乳清蛋白的传统高温熔球态的条件为大约90°C (pH 7，无化学变性剂)。相比之下，rHLAa11‘的光谱以差的化学分散的位移和宽峰开始(20°C和30°C)，但在较高温度下，即使该些化学位移进一步变窄，该些峰也逐渐变得尖锐(40°C至55°C )(图 6A)。这表示了该蛋白正在经历从该熔球态变为愈来愈松散的、展开状态的转型。一个重要的方面是在该变体中，在任何温度下都完全无往高磁场位移的甲基共振(图7A，B)，表明 rHLAa11‘在所有温度下都缺少强劲的残基间侧链相互作用，近-UV⑶光谱(未显示)中的特征同样表明这个情况。如以上所指出，HAMLET的光谱(20°C和30°C ；图7)显示了 Ile95的δ CH3质子(在 30°C下为-0. 7ppm)和Val92的Y CH3质子(在30°C下为-0. 5ppm)，标示天然样三维结构的存在，尽管其数量比HLA少。提高温度时，由于很多峰变得尖锐(图6D)，所以这些高磁场共振消失(图7B)，表明了虽然HAMLET在较低温度下为部分天然样，但其总体表现与天然HLA 的总体表现明显地不同。事实上，发现在下HAMLET的高磁场NMR谱与Cys5670A的高磁场NMR谱是相同的，当中无高磁场共振，除了在0. 05ppm处有非常小的峰。令人吃惊的是， 对于Cys5670A，当温度升高和峰如对熔球的预期一样变得尖锐(图6C)，在高磁场区中没有
11变化(图7A，B)。 在这系列的实验中，利用了温度可变化的IH NMR光谱来区分(i)在光谱上分散得很好及展现窄峰的天然状态，(ii)在光谱上分散得差和展现宽峰的熔球状态，以及(iii) rHLAall-Ala、HLA、HAMLET和Cys5670A在光谱上分散得差和展现窄峰的展开状态。在α-乳清蛋白和其各种的熔球态以及其他原型蛋白，例如脱辅基肌红蛋白，更详细地对主链动力学作了大量的工作。这些工作的主体显示了在不同的实验条件下，主链动力学关于不同的结构区域的错综复杂和细微之处。从该工作中得到的其中一个关键的结论首先是Cys5670A 与HAMLET在生理条件下结构明显不同。此外，虽然HAMLET含有天然样分子，Cys5670A却完全没有天然样侧链组装，但也展现了与HAMLET相等的细胞毒性活动。因此，与淀粉样原纤维的例子不同，特意设计的、非天然和部分展开的结构性总体可依据环境对该些细胞给与独立的有利效果。
权利要求
1.用于生产生物活性复合物的方法，所述方法包含使带有α-乳清蛋白的序列或其片段但缺少分子内二硫键的重组蛋白在形成生物活性复合物的条件下与油酸接触并隔离该复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该重组蛋白包含α-乳清蛋白，在该α-乳清蛋白中所有半胱氨酸残基被改变为其他氨基酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中该α-乳清蛋白中的半胱氨酸残基被改变为丙氨酸残基。
4.根据前述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其中该α-乳清蛋白是人α-乳清蛋白。
5.根据前述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其中带有在权利要求1中所限定的α-乳清蛋白序列或其片段的重组蛋白与油酸在离子交换柱特别是阴离子交换柱上接触。
6.根据权利要求5所述的方法，其中用线性盐梯度将该柱进行洗脱，并使生物活性复合物从在高盐浓度下洗脱的单一组分隔离出来。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该高盐浓度是IM的NaCl或对等物。
8.根据前述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其中该重组蛋白包含SEQIDN0. 1 KQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWAKSSQVPQSRNIADISADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYffLAHKALATEKLEQffLAEKL(SEQ ID NO 1)， 可选地有多达20个氨基酸附在该蛋白质的末端。
9.根据权利要求8所述的方法，其中该重组蛋白为SEQID No 2 MKQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWAKSSQVPQSRNIADISADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYffLAHKALATEKLEQffLAEKL (SEQ ID NO 2)。
10.生物活性复合物，包含带有α-乳清蛋白的序列但缺少分子内二硫键的重组蛋白， 或其片段，和油酸。
11.根据权利要求10所述的生物活性复合物，其中该重组蛋白是SEQID NO 1或SEQ ID NO 2。
12.药物组合物，包含根据权利要求10或权利要求11所述的复合物与药学上可接受的载体结合。
13.根据权利要求10或权利要求11所述的生物活性复合物，其用于治疗。
14.根据权利要求13所述的生物活性复合物，其用于治疗癌症。
15.提高生物活性复合物的产量的方法，该生物活性复合物可通过包含在离子交换条件下使α -乳清蛋白或其片段与油酸接触的过程而得，所述方法在所述过程中包含使用带有α-乳清蛋白的该序列或其片段但缺少至少一些分子内二硫键的重组蛋白。
16.根据权利要求16所述的方法，其中至少一些半胱氨酸残基被改变为不同的氨基酸。
17.带有α-乳清蛋白的该序列或其片段但缺少分子内二硫键的重组蛋白的使用，例如在该使用中，半胱氨酸残基特别是所有半胱氨酸残基在生物活性复合物的制备中被改变为不同的氨基酸。
全文摘要
本发明描述了用于制备生物活性复合物的方法和过程，并要求其权利，所述方法包含带有α-乳清蛋白，例如人α-乳清蛋白的序列或其片段但缺少分子内二硫键的重组蛋白，以及油酸。该重组蛋白适当地带有在天然蛋白中找到的半胱氨酸，其被改变为其他氨基酸例如丙氨酸。本发明还描述了生物活性复合物的重组表达、过程合理化和产量上的改进，以及获得的复合物，并要求其权利。
文档编号A61K38/38GK102348721SQ201080011265
公开日2012年2月8日 申请日期2010年1月8日 优先权日2009年1月9日
发明者凯塞纳·斯万保格, 安-克里斯汀·莫新伯格, 珍妮·彼得森-凯斯伯格, 肯尼思H·莫 申请人:哈姆雷特药品Ab