专利名称：用于治疗炎性疾病的新方法
技术领域：
本发明提供用于防止、预防和治疗诸如类风湿性关节炎的炎性疾病的方法和药物组合物，所述药物组合物包含蛋白质胆盐激活脂肪酶(BSSL)的拮抗剂。本发明还涉及包含 BSSL拮抗剂的药物组合物以及它们在用于防止、预防和治疗诸如类风湿性关节炎的炎性疾病的方法中的用途。
背景技术：
炎件疾病-类风湿件关节炎炎症是人体对损伤或感染、过敏或化学刺激的反应，其可导致各种炎症性疾病或病症，例如与过敏相关的炎症、与氧化一氮的产生相关的炎症、与皮肤、腹部、外周或中枢神经系统、眼或泪腺、耳、鼻、口、肺、心脏、肝脏、胰腺、甲状腺、脂肪组织、肾脏、关节或血管相关的炎症或者与感染、外伤或自身免疫相关的炎症。类风湿性关节炎(RA)是慢性、炎性、全身性自身免疫疾病，其影响约的西方社会总人口(Gabriel 2001)。该疾病过程导致关节软骨和骨的进行性损伤。这一损伤由免疫应答和非抗原特异性固有炎性过程引起。该疾病的特征是单关节或多关节的关节发炎并且嗜中性粒细胞大量聚积在滑膜液和组织中。滑膜液中的嗜中性粒细胞通过释放蛋白酶和产生氧化剂引起软骨损伤，抑制嗜中性粒细胞浸润入发炎的关节是防止该疾病进展的方法正变得越来越明显(Hallett 2008)。目前对RA的治疗包括用于疼痛治疗的非甾体抗炎药 (NSAID)、缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)和靶向特异的促炎性细胞因子或各种细胞类型的细胞表面受体的生物制剂。但是仍然需要炎性疾病特别是慢性炎性疾病的替代药物治疗。因此需要鉴定出参与炎性信号转导和过程的新的独特的靶点，其可用作研发用于治疗、预防或防止炎性疾病的创新性治疗药物的基础。胆盐激活脂肪酶胆盐激活脂肪酶(BSSL)还被称作羧基酯脂肪酶(CEL)或胆盐依赖性脂肪酶 (BSDL)，在至今为止所研究的所有物种中其为在外分泌胰腺中表达并且被分泌进入肠腔的裂解脂肪的酶。在包括人类在内的一些物种中，BSSL还可由泌乳的乳腺表达并且与乳汁一起分泌。BSSL具有宽泛的底物特异性，其具有水解多种不同的底物的能力，例如胆固醇酯、三酰基、二酰基和单酰基甘油、脂溶性维生素酯、磷脂、半乳糖脂以及神经酰胺(Hui和 Howies 2002)。最初认为BSSL的生理学功能限于小肠中和水解食物中的脂肪(Hemell等人，1997)。胰液中高度富含BSSL(多达总蛋白含量的5% )和BSSL水解多种脂质的能力使研究人员提出了 BSSL在脂质消化和吸收中的多种功能。BSSL在胆固醇酯的吸收中具有关键作用O^ait等人，2002)，这一点在缺乏BSSL (CEL基因)的小鼠中得到验证(Howies等人，1996)。尽管认为这是其在成人中的主要功能，但是它很可能还有助于新生儿中甘油三酯的消化和吸收(Lindquist和Hernell 2010)。已发现BSSL以较低的但是明显的水平存在于健康个体的血清中(Blacliberg等人，198 并且目前的研究已表明BSSL参与脂蛋白代谢和动脉粥样硬化的调节(Hui和 Howies 2002)。BSSL的潜在功能以及甚至是循环BSSL水平升高是否是动脉粥样硬化的风险因素或可防止动脉粥样硬化这一问题仍不清楚。最初报道了测定为胆固醇酯酶活性的 BSSL与血清中的总脂蛋白和低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇水平之间的令人惊异的显著的正相关性(Hui和Howies 2002)。接着证明了 BSSL与动脉粥样硬化斑块内的平滑肌细胞 (SMC)相关并且在体外诱导血管SMS增殖(Auge等人2003)。一项使用转基因小鼠的研究表明BSSL的巨噬细胞表达具有促动脉粥样硬化性，有利于胆固醇酯积累和泡沫细胞形成 (Kodvawala等人，2005)。由这些研究判断，BSSL可能为动脉粥样硬化的风险因素。另一方面，BSSL降低氧化的LDL中的溶血磷脂胆碱的含量，由此减少氧化的LDL在巨噬细胞中的积累(Hui和Howies 2002)，并且已表明其通过与清道夫受体BI途径的直接或间接相互作用在高密度脂蛋白胆固醇酯的肝脏选择性摄取和代谢中起到生理学作用(Camarota等人， 2004)，这表明血清中的BSSL可防止动脉粥样硬化。BSSL 蛋白人BSSL蛋白(由CEL基因编码)是722个氨基酸的单链糖蛋白(Nilsson等人，1990)。该酶被合成为具有20个氨基酸的信号肽的742个氨基酸的前体。已推测出调节酶的活性的两个胆盐结合位点和蛋白酶抗性(Hui 1996)以及鞘脂结合结构域(SBD) (Aubert-Jousset 等人，2004)。通过示意图可将该酶分成两部分i)与乙酰胆碱酯酶和一些其它的酯酶具有显著同源性的N-端结构域。在该部分中存在已提出的催化三分子(Serl94(包含于GESAG基序中)、Asp320和His435)和N-糖基化位点Asnl87、肝素结合位点(推测位于1-100位)以及两个链内二硫键(Cys64-Cys80 和Cys 246-Cys257) 0已发现所述肝素结合能力位于由氨基酸1_445组成的分子部分中 (Spilburg等人，1995)并且所述肝素结合结构域事实上可能是由含不同序列组成的三维结构。BSSL的肝素结合性质被认为对于与细胞膜例如肠细胞膜的相互作用非常重要(Fait 2002)。ii)具有数量不同的包含相似的但是不相同的重复序列(11个氨基酸)的串联重复(VNTR)的C-端部分(由外显子11编码)。人类中最常见的形式包含16个重复序列， 但是个体和等位基因之间的重复数量存在差异(Lindquist等人，200 。重复序列之后为 11个氨基酸的额外的尾区(该尾区长于对应的大鼠和小鼠酶)。所述重复序列富含脯氨酸，每一个重复单位内存在天冬氨酸并且一些重复单位内存在谷氨酸，这些使得该区具有强酸性并且导致该蛋白质具有低等电点。据报道富含脯氨酸的重复序列的数量在物种之间变化很大，通常小鼠和牛中为3个，大鼠中为4个，人类中为16个，大猩猩中为39个(Hui 和Howies 2002 ；Madeyski等人1999)。这一重复单位的数量的多样性可解释所观察到的物种之间该蛋白质的大小差异；小鼠BSSL是74kDa蛋白质，而在重复区被广泛糖基化的人 BSSL具有120-140kDa的表观分子量；所述重复序列携带了该蛋白质的大部分的15-35%碳水化合物。重复序列的数量和糖基化的差异均可解释变化的表观分子量(Lindquist等人 2002)。已通过分析人乳汁BSSL的分离的C-端部分(氨基酸528-72 证明人乳汁BSSL 的16个重复序列中可能仅有10个是0-糖基化的(Wang等人，1995)。已表明所述重复序列在保护BSSL免受蛋白水解性降解方面具有功能性作用并且CN 102458464 A说明书3/25
它们的0-糖基化对于该酶的分泌是重要的(Brimeau等人，1997)。C_端区的寡糖包含Lewis χ和Lewis b以及较少的Lewis抗原结构。由于那些与血型相关的抗原决定簇，BSSL的C-端区可在细胞-细胞相互作用中具有粘附功能，如其抗菌作用所例证(Naarding等人，2006 ； Ruvoen-Clouet等人，2006)。另一方面，所述重复区对于催化活性、胆盐活化和肝素结合具有较低的重要性(Hui 1996)。还表明C-尾区通过结合肠内皮细胞表面的凝集素样受体(LOX-I)是重要的结构部分(Fayard等人，2003)。肝素结合位点形成了其它结合部分，并且这些结合位点对于 BSSL在不同的细胞环境和细胞阶段中的作用机制具有关键作用。血管BSSL通过比较BSSL VNTR基因型和血清脂质表型发现重复序列的数量和血清胆固醇水平之间具有相关性(Bengtsson-Ellmark等人，2004)。尽管所述重复序列多态性仅是脂质水平的遗传标记，但是它还可能在测定血浆脂质组成中具有功能性作用。BSSL存在于人类血浆和主动脉组织中表明了 BSSL在脂质代谢中的更宽泛的作用。人们已广泛研究了循环BSSL的来源。已证明人类巨噬细胞和内皮细胞可合成并且分泌该酶(Hui和Howies 2002)。相反，在另一项研究中，动脉粥样硬化损伤内的BSSL与平滑肌细胞(SMC)相关但是与活化的巨噬细胞或内皮细胞不相关(Auge等人，200 。在另一项研究中，认为注射入大鼠肠袢中的BSSL被肠细胞内化，转运通过细胞并且释放进入血液循环(Brimeau等人，200；3)。基于这些数据，已提出循环BSSL来源于胰腺。但是，还证明了进食乳汁后BSSL血清水平不会增加，并且尽管在新生儿中乳汁是BSSL的主要来源而配方奶粉中不含BSSL，但是BSSL血清水平在母乳喂养和配方奶粉喂养的人类婴儿之间无差异。已报道了 BSSL与人血浆中的含载脂蛋白B的脂蛋白的相关性(Brimeau等人， 2003)，这与BSSL存在于人类主动脉并且具有修饰低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白 (HDL)的组成以及通过降低它们的溶血磷脂胆碱(IysoPC)含量降低氧化的LDL(oxLDL)的致动脉粥样化作用的能力这些观察结果一起表明了 BSSL在动脉粥样硬化形成中充当保护性因子的潜在的新作用。LysoPC是oxLDL中的主要磷脂组分并且通过如下过程生成与PC 分子的sn-2位点酯化的多不饱和脂肪酸氧化和片段化，然后由LDL-相关磷脂酶A2 (PLA2) 和BSSL水解变短的脂肪酰残基。尽管IysoPC仅组成非-oxLDL中总PC的，但是LDL 的氧化修饰可将这一比例提高至40-50%。LysoPC可充当单核细胞的化学引诱物，诱导单核细胞粘附至血管内皮细胞并且促进巨噬细胞增殖，这最终导致泡沫细胞形成。由于BSSL 对IysoPC的作用，已证明BSSL可与胆固醇和氧化的脂蛋白相互作用从而调节动脉粥样硬化的进展(Hui 和 Howies 2002)。但是，BSSL存在于并积累于动脉粥样硬化损伤内这一事实以及单核细胞和巨噬细胞(或具有巨噬细胞表型的SMC)表达并分泌BSSL这一事实表明这些细胞可能是积累的BSSL的来源。已表明巨噬细胞中BSSL的病理生理学作用的机制是BSSL作为神经酰胺酶降低神经酰胺和溶血磷脂胆碱水平的功能(Hui和Howies 2002)，这导致响应于致动脉粥样硬化脂蛋白的胆固醇酯积累增加从而在体内引起动脉粥样硬化损伤大小增加。这与 Kodvawala等人Q005)的研究一致，他们通过使用体内模型证明了在apoE缺陷小鼠中巨噬细胞中的BSSL表达促进响应经修饰的LDL的胆固醇酯合成和积累并且增加动脉粥样硬化损伤。
动脉粥样硬化的滞留-应答假说包括内皮损伤、脂蛋白氧化以及巨噬细胞和VSMC(血管平滑肌细胞)增殖在内的与动脉粥样硬化形成早期相关的许多过程不足以单独导致损伤形成。滞留-应答假说指明致动脉粥样硬化脂蛋白的内皮下滞留是所有这些事实上是对脂质积累的正常生理反应的过程的诱发因素。尽管LDL早期滞留的主要决定因素可能是内皮下间隙内的蛋白聚糖组成，但是一旦损伤开始形成BSSL可通过充当内皮下蛋白聚糖和脂蛋白之间的分子桥辅助并且增强滞留(W0 2005/095986)。与胞外基质组分结合的BSSL可充当LDL滞留中的桥连分子，如脂蛋白脂肪酶(LPL)所表明(Pentikainen等人，2002)。血小板中的BSSL最近发现BSSL保存于血小板中并且在血小板活化后释放(Panicot-Dubois等人， 2007)。而且，已证明BSSL可诱导血小板中的钙动员(mobilization)并且增强凝血酶介导的血小板聚集和扩散。在小鼠血栓病模型(激光诱导的损伤)中，BSSL在体内积累于血管壁损伤位点的动脉血栓中。当CXC趋化因子受体4(CXCR4)被拮抗时，BSSL的积累受到抑制并且减小了血栓大小。与野生型小鼠相比，BSSL敲除小鼠(BSSL-KO)的尾静脉出血次数增加。这些数据表明BSSL通过与血小板上的CXCR4相互作用调节血栓形成。CXCR4属于G蛋白偶联受体(GPCR)基因家族，CXCR4活化后通过数种不同的途径诱导下游信号转导；例如CXCR4与趋化因子配体SDF-I的结合活化G蛋白介导的信号转导并且诱导细胞趋化反应(Clemetson等人，2000)。还已知CXCR4与HIV-I相互作用并且充当病毒进入细胞的辅助受体。HIV-I与CXCR4的结合是由存在于HIV-I gpl20上的被称作 V3环的结构域介导的。BSSL蛋白质包含与gpl20的V3环结构相关的区域。已提出这一被称作V3样环结构域(氨基酸361-393)的区域(Aubert-Jousset等人，2004)介导BSSL与血小板上的CXCR4的结合。总而言之，对于血浆和主动脉组织中的BSSL的来源和功能存在令人困惑的和相
互矛盾的结果。EP 1840573报导了胰岛素自身抗体阳性或阴性的NOD(非肥胖型糖尿病)小鼠之间基因表达模式的差异。鉴定出125个差异表达的基因，其中之一是编码BSSL的CEL基因。鉴定出这些差异表达的基因可用于自身免疫疾病例如I型糖尿病的前炎症状态的早期诊断。还表明所述差异表达的基因是治疗具有前炎症阶段的自身免疫疾病的靶点。本领域公知特定疾病的形成导致多种基因表达发生改变，如EP1840573所证明。但是，并不认为所有此类差异表达的基因是所述疾病形成的原因。相反，对致病基因(如果存在的话)的鉴定需要更复杂的研究。尽管EP 1840573鉴定出BSSL是炎性疾病的潜在标记，但是其未能鉴定出BSSL是炎性疾病形成的原因。
发明内容
本发明基于如下令人惊讶的发现BSSL在炎性过程中具有作用以及抑制或消除 BSSL在动物模型中防止慢性关节炎的形成。
本发明基于BSSL缺陷小鼠免于诸如胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的炎性疾病这一实证。因此人BSSL的拮抗剂对于炎性疾病的防止、预防和/或治疗具有潜在用途。适合的BSSL拮抗剂是降低BSSL的活性、量和/或表达的物质。可根据本发明使用的优选的 BSSL拮抗剂是特异结合人BSSL的抗体和抗体片段，以及包含与编码人BSSL的多聚核苷酸序列互补的序列的RNAi和反义多聚核苷酸。根据本发明使用的最优选的BSSL拮抗剂是单克隆BSSL抗体。因此，本发明的一方面提供防止、预防和/或治疗炎性疾病的方法，其包括向需要此类治疗的个体给药药学有效量的特异结合人BSSL的抗体或抗体片段。本发明的另一方面提供用于防止、预防和/或治疗炎性疾病的药物组合物，其包含特异结合人BSSL的抗体或抗体片段以及药学可接受的载体或赋形剂。本发明的另一方面提供特异结合人BSSL的抗体或抗体片段在制备用于防止、预防和/或治疗炎性疾病的药物组合物中的用途。本发明的另一方面提供防止、预防和/或治疗炎性疾病的方法，其包括向需要此类治疗的个体给药药学有效量的包含与编码人BSSL的多聚核苷酸序列或与其互补的序列的一部分互补的序列的RNAi分子或反义多聚核苷酸。本发明的另一方面提供用于防止、预防和/或治疗炎性疾病的药物组合物，其包括包含与编码人BSSL的多聚核苷酸序列或与其互补的序列的一部分互补的序列的RNAi分子或反义多聚核苷酸和药学可接受的载体或赋形剂。本发明的另一方面提供包含与编码人BSSL的多聚核苷酸序列或与其互补的序列的一部分互补的序列的RNAi分子或反义多聚核苷酸在制备用于防止、预防和/或治疗炎性疾病的药物组合物中的用途。
图1检测人类肝脏中的BSSL mRNA用BSSL特异性寡聚核苷酸引物将一式两份分离自四名个体的肝切片(biopsies) 的总RNA逆转录并且扩增。用1.8%琼脂糖凝胶电泳分离(resolve)PCR产物并且用溴化乙锭染色。从所有样品中扩增预期大小(327nt)的PCR产物；患者1(泳道1和2)；患者2(泳道3和4)；患者3(泳道5和6)；患者4(泳道7和8)。将从分离自人类乳汁的RNA合成的 cDNA 用作阳性对照(泳道 9)。将 0' GeneRuler 50-bp DNA 梯度(Fermentas，Ontario, Canada)用作分子量标记(泳道10)。图2.蛋白质印迹法用SDS-PAGE(10% )分离来自两份人类肝脏样品(患者3和患者4)的亲和纯化的蛋白质提取物，转移至PVDF膜并且用多克隆抗-人BSSL抗体检测。患者3，泳道1 ；患者 4，泳道2 ；来自人类乳汁(泳道幻和人类胰腺(泳道4)的蛋白质提取物；以及纯化自人类乳汁的BSSL(泳道5)用作阳性对照。图3.组织学、油红0染饩以及人类肝脏切片中的BSSL定位用苏木精和伊红仏，0)、油红0 ，幻对获自两名患者[患者I(A-C)；患者4(D_F)] 的肝组织切片(8-μ m冷冻切片)进行染色，并且用多克隆抗-BSSL抗体(C，F)进行免疫组织化学研究。
S 4.对BSSL和免,疮细胞j示iff讲行双重免,疮荧光染卢,在人类肝脏中，BSSL与表达⑶15的细胞而非表达⑶68的细胞共定位。使用兔多克隆抗-BSSL抗体和小鼠单克隆抗⑶-68或抗-⑶15抗体对获自两名患者[患者1 (分图 4A)和患者4(分图4B)]的肝切片进行双重免疫荧光染色。当一起使用抗-BSSL和抗-⑶15 抗体时两个分图中的融合(merge，合并)照片中均出现了被视为这些黑色和白色图像中的亮染色的黄色，表明存在共定位图5. BSSL定位于循环CD15-阳件粒件白细胞从健康志愿者的血液收获人类白细胞，进行透性化处理并且用兔多克隆抗-BSSL(A)抗体和小鼠单克隆抗_CD15(B)抗体进行双重免疫荧光染色。用DAPI (C)对细胞核进行复染。融合图片(D)中出现被视为该黑色和白色图片中的亮染色的黄色，表明存在共定位。图6.循环粒件白细胞中的BSSL的亚细胞定位从健康志愿者的血液收获人类白细胞并且用兔多克隆抗-BSSL抗体和小鼠单克隆抗-CD15抗体进行双重免疫荧光染色。为了区分胞外和胞内定位，在加入抗体之前对细胞进行(上分图)或不进行(下分图)透性化处理。上分图中的融合图片(picture，照片) 中出现了被视为这些黑色和白色图片中的亮染色的黄色，表明存在共定位。图7.蛋白质印迹分析用通过SDS-PAGE (10% )分离来自人类单核血细胞(泳道1和2)或多核粒性白细胞 (泳道3- 的亲和纯化的蛋白质提取物，转移至PVDF膜并且用多克隆抗-人BSSL抗体检测。将来自人类乳汁(泳道6)和人类胰腺(泳道7)的蛋白质提取物用作阳性对照。图8.检测人血细胞中的BSSL mRNA用BSSL-特异性寡聚核苷酸引物将分离自两名健康个体的单核血细胞和多核粒性白细胞的总RNA逆转录并且扩增。用1.8%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并且用溴化乙锭染色。从所有样品中扩增预期大小(327nt)的PCR产物；单核血细胞(泳道1和2)；多核粒性白细胞(泳道3和4)。阴性对照(省去来自cDNA合成反应的RT)显示于泳道5_8。 将0' GeneRuler 50-bp DNA梯度(Fermentas)用作分子量标记(泳道9)。图9.人动脉粥样硬化斑块中的BSSL的免疫定位在福尔马林固定的、石蜡包埋的获自动脉粥样硬化颈动脉的组织切片上进行免疫组织化学研究，使用兔多克隆BSSL-肽(氨基酸328-341)抗体(A)和(C)或兔免疫前血清 (B)和(D)作为阴性对照。用Mayer苏木精进行复染。该图显示了两名患者的数据(A、B是来自患者1的切片；C、D是来自患者2的切片)。图10. CIA小鼠模型中的平均关节炎评分通过每周评分2-3次跟踪观察关节炎57天。与野生型(wt)对照相比BSSL缺陷小鼠具有显著较低的疾病评分。性别之间的疾病易感性存在很大差异。仅有很少的雌性小鼠患关节炎并且那些患病小鼠的评分很低。㈧所有小鼠；(B)雄性；(C)雌性。图11. CIA小鼠模型中的发病率和严重度BSSL缺陷小鼠与它们的wt同胞(littermate，同窝出生者)相比患关节炎的发病率下降并且严重度还更低。发病率表示为所有小鼠(A)的百分数，严重度表示为仅患病小鼠(B)的平均关节炎评分。
a 12. CIA小鼠It型中杭-CII杭体的血清浓度第30天(分图A)和第57天(分图B)采集的血清中的抗胶原蛋白II (抗-CII 抗体)浓度的分析表明BSSL缺陷(黑柱)小鼠和BSSL wt小鼠(白柱)之间的应答就IgG 同种型(由图中的总IgG表示)和IgM而言均无差异。图13. CIA小鼠樽型中的软骨降解第57天通过ELISA测量血清中作为软骨降解标记的软骨寡聚基质蛋白(COMP)的浓度。BSSL缺陷小鼠(黑柱)中的COMP水平显著低于wt雄性对照(白柱)。在雌性中无差异。S 14. CIA小鼠的平均关节炎i平分、关节炎严重度和发病率通过每周评分2-3次跟踪观察关节炎48天。与BSSL wt小鼠(A)和(C)相比，BSSL 缺陷小鼠表现出显著更低的疾病评分，这还反映于更低的关节炎发病率(B)。与BSSL wt小鼠相比，BSSL杂合子(杂合的)小鼠的发病倾向更低，但是不如纯合子(纯合的)BSSL缺陷小鼠有抗性。(A)和(B)所有小鼠；(C)仅患病小鼠。*表示ρ < 0. 05，**表示ρ < 0. 01。图15. CIA小鼠樽型中的软骨降解第48天通过ELISA测量血清中作为软骨降解标记的COMP的浓度。BSSL缺陷小鼠(黑柱)中的COMP水平显著低于BSSL wt对照(白柱)。相对于BSSL缺陷小鼠和BSSL wt小鼠中的浓度，BSSL杂合子小鼠(阴影线柱)中的COMP血清浓度在它们中间。*表示ρ < 0. 05。
_9] 图16.血浆中的抗-II型胶原蛋白应答(IgG)将第33天和第48天的抗-CII抗体水平的分析表示为相对于合并血清的标准品的相对值。任何BSSL基因型之间的IgG应答无显著差异。图17.与对照相比抗-BSSL沣射后的关节炎严重度注射了 lmg/kg或5mg/kg抗-BSSL的大鼠表现出显著降低的疾病严重度。*表示口<0.05，#表示？<0.01。所有组的发病率为100%。
具体实施例方式本发明基于以下发现BSSL在炎性疾病中具有作用并且抑制或消除BSSL可在动物模型中防止慢性关节炎的形成。已证明BSSL蛋白存在于炎性细胞和发炎的组织中。与野生型对照相比BSSL缺陷小鼠(BSSL-KO)患胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的疾病严重度显著降低并且发病率更低。注射抗-BSSL抗体显著降低了大鼠中姥鲛烷(pristane，降植烷)诱导的关节炎的疾病严重度。本发明提供用于防止和/或治疗炎性疾病的BSSL拮抗剂。优选地，所述BSSL拮抗剂可为特异结合人类BSSL的抗体或抗体片段，或者是包含与编码人BSSL的多聚核苷酸序列的一部分互补的序列的RNAi分子或反义多聚核苷酸。炎性疾病可根据本发明预防和/或治疗的炎性疾病选自但不限于呼吸道的炎性疾病，包括哮喘，包括间歇性和持续性以及所有严重度的支气管哮喘、过敏性哮喘、内源性哮喘、外源性哮喘、运动诱导的哮喘、药物诱导的(包括阿司匹林和NSAID诱导的)哮喘和尘螨诱导的哮喘，以及气道高反应性的其它诱因引起的哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；支气管炎，包括传染性和嗜酸粒细胞性支气管炎；肺气肿；支气管扩张；囊性纤维化；结节病；农民肺和相关疾病；过敏性肺炎；肺纤维化，包括隐原性纤维化肺泡炎、特发性间质性肺炎、在抗肿瘤治疗中并发的纤维化以及慢性感染，包括肺结核和曲霉病以及其它真菌感染；肺移植的并发症；肺脉管系统的脉管炎和血栓形成性疾病以及肺高压；镇咳活性包括治疗与气道的炎性和分泌性病症相关的慢性咳嗽以及医源性咳嗽；急性和慢性鼻炎，包括药物性鼻炎和血管舒缩性鼻炎；常年性和季节性变应性鼻炎，包括神经性鼻炎(枯草热)；鼻息肉病；急性病毒感染，包括普通感冒以及由呼吸道合胞病毒、流感病毒、冠状病毒(包括SARQ和腺病毒引起的感染；骨和关节的炎性疾病，包括原发性和继发性的骨关节炎/骨关节病，例如先天性髋关节发育不良、颈部和腰部脊椎炎以及腰背部和颈部疼痛；类风湿性关节炎和斯蒂尔 (Still)病；血清阴性脊柱关节病，包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎、反应性关节炎和未分化脊柱关节病；脓毒性关节炎和其它感染相关的关节病以及骨疾病例如肺结核，包括波特氏(Potts)病和Poncet综合症；急性和慢性结晶性滑膜炎，包括尿酸盐痛风、磷酸钙贮积病和磷灰石相关的腱、粘液囊和滑膜炎症；白赛(Behcet)病；原发性和继发性干燥关节炎 (Sjogren)综合症；全身性硬化症和局限性硬皮病；系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病以及未分化结缔组织病；炎性肌病，包括皮肌炎和多肌炎；风湿性多肌痛；幼年型关节炎，包括任何关节分布的特发性炎性关节炎和相关综合症，风湿热及其全身并发症；脉管炎，包括巨细胞动脉炎、多发性大动脉炎(Takayasu动脉炎)、Churg-MrauSS综合症、结节性多动脉炎、微小多动脉炎以及与病毒感染、过敏反应、冷球蛋白和副蛋白相关的脉管炎；腰背部疼痛；家族性地中海热、穆-韦二氏(Muckle-We 11 s)综合症以及家族爱尔兰发烧(Familial Hibernian Fever)、菊池氏(Kikuchi)病、药物诱导的关节痛、肌腱炎以及肌病；与结缔组织重构或由损伤(例如运动损伤)引起的肌肉骨骼疾病或包括如下疾病在内的疾病相关的炎性疾病关节炎(例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或结晶性关节病)、其它关节病(例如椎间盘退变或颞下颂关节退变)、骨重建病(例如骨质疏松、 Paget病或骨坏死)、多软骨炎、硬皮病、混合性结缔组织病、脊椎关节病或牙周病(例如牙周炎)；炎性心血管疾病，包括累及冠状血管和外周血液循环的动脉粥样硬化；心囊炎； 心肌炎、炎性和自身免疫性心肌病，包括心肌结节病；缺血性再灌注损伤；心内膜炎；心瓣炎和主动脉炎，包括传染性主动脉炎(例如梅毒性主动脉炎)；血管炎；近端和外周静脉疾病，包括静脉炎和包括深静脉血栓病和静脉曲张并发症在内的血栓病；皮肤的炎性疾病，包括银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎或其它湿疹性皮肤病，以及延迟型过敏反应；植物性和光照性皮炎；脂溢性皮炎、疱疹样皮炎、扁平苔癣、硬化萎缩性苔癣、坏疽性脓皮症、皮肤结节病、盘状红斑狼疮、天疱疮、类天疱疮、大疱性表皮松解症、 风疹、血管性水肿、血管炎、中毒性红斑、皮肤嗜酸性白细胞增多症、斑秃、男性-模型斑秃、 Sweet综合症、Weber-Christian综合症、多形性红斑；传染性和非传染性的蜂窝织炎；脂膜炎；皮肤淋巴细胞瘤、非黑素瘤皮肤癌以及其它增生异常性损伤；药物诱导的疾病，包括固定型药疹；眼睛的炎性疾病，包括眼睑炎；结膜炎，包括常年性和春季过敏性结膜炎；虹彩炎；前葡萄膜炎和后葡萄膜炎；脉络膜炎；自身免疫；累及视网膜的退行性或炎性疾病；目艮炎，包括交感性眼炎；结节病；感染，包括病毒、真菌和细菌感染；胃肠道的炎性疾病，包括舌炎、齿肉炎、牙周炎；食道炎，包括胃食管返流病；嗜酸细胞性胃肠炎、肥大细胞增生病、腹部疾病、克罗恩(Crohn)病、结肠炎、溃疡性结肠炎、直肠炎、肛门搔痒、肠易激症、肠易激综合征，腹部炎性疾病，包括肝炎，包括自身免疫性、酒精性和病毒性肝炎；肝脏纤维化和硬化；胆囊炎；急性和慢性胰腺炎；生殖泌尿道炎性疾病，包括肾炎，包括间质性肾炎和肾小球肾炎；肾病综合征；膀胱炎，包括急性和慢性(间质性)膀胱炎以及洪纳(Hurmer)溃疡；急性和慢性尿道炎、前列腺炎、附睾炎、卵巢炎和输卵管炎；外阴阴道炎；佩洛尼氏(Peyronie)病；勃起机能障碍 (男性和女性)；在例如肾脏、心脏、肝脏、肺、骨髓、皮肤或角膜移植后或输血后的急性和慢性异体移植物排斥；或慢性移植物抗宿主病；炎性中枢神经系统疾病，包括阿兹海默氏病和其它痴呆症，包括克-雅二氏 (Creutzfeldt-Jakob)病和新类型库贾氏病(New varaintCreutzfeldt-Jakob病)；淀粉样变性；多发性硬化症和其它脱髓鞘综合症；脑动脉硬化和脉管炎；颞动脉炎；重症肌无力； 急性和慢性疼痛(急性、间歇性或持续性，不论是中枢神经还是外周神经起源)，包括内脏痛、头痛、偏头疼、三叉神经痛、非典型面痛、关节和骨疼痛、癌症或肿瘤侵袭引起的疼痛、神经性疼痛综合症，包括糖尿病性、疱疹后以及HIV相关的神经病；神经系统结节病；恶性、传染性或自身免疫过程的中枢和外周神经系统并发症；以及其它自身免疫和过敏性疾病，包括桥本甲状腺炎(Hashimoto甲状腺炎)、格雷夫斯(Graves)病、阿狄森(Addison)病、糖尿病、特发性血小板减少性紫癜、嗜酸细胞性筋膜炎、高免疫球蛋白E综合症、抗磷脂综合症；具有炎性或免疫学组分的其它病症；包括获得性免疫缺陷综合症(AIDQ、麻疯病、塞扎里(Sezary)综合症以及瘤外综合征。优选地，可根据本发明进行预防和/或治疗的炎性疾病是类风湿性关节炎。^^本文中提及的术语“抗体或抗体片段”包括完整的抗体和被称作其“抗原结合部分”或单链的任何抗原结合片段。“抗体”指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白或其抗原结合部分。每一条重链由重链可变区(本文中缩写和重链恒定区组成。重链的恒定区由三个结构域^^丄^和口组成。每一条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VD 和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域Q组成。Vh和\区可进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高度可变区和其间散布的被称作框架区(FR)的更保守的区域。各乂11 和\由三个⑶R和四个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列FRl、OTRl、FR2、raR2、 FR3、⑶R3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。本文使用的术语“抗原结合部分”指保留了特异结合抗原Gf^BBSSL)的能力的一个或多个抗体片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段实现。属于术语抗体的“抗原结合部分”范围内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和ChI结构域组成的一价片段；(ii)F(ab' )2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab'片段，其基本是具有一部分铰链区的Fab ； (iv)由V1^P ChI结构域组成的Fd片段；(ν)由抗体单臂的\和Vh结构域组成的Fv片段，(vi)由Vh结构域组成的dAb 片段(Ward等人，1989) ； (vii)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体，其为包含一个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。另外，尽管Fv片段的两个结构域\和Vh 是由不同的基因编码，但是可使用重组技术通过合成接头将它们连接，所述接头能够将它们制备成其中的\和配对形成一价分子的单一蛋白质链(称作单链Fv(SCFV)；参见， Bird等人，(1988))。此类单链抗体也预期包含于术语抗体的“抗原结合部分”内。可使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以筛选完整抗体的相同的方式筛选所述片段。本文使用的“分离的抗体”旨在表示基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异结合BSSL的分离的抗体基本不含特异结合BSSL之外的抗原的抗体)。但是特异结合BSSL的分离的抗体对其它抗原例如来自其它物种的BSSL分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体基本不含其它细胞物质和/或化学物质。本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。本文使用的术语“人抗体”预期包括可变区内的、框架区和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列的抗体。另外，如果所述抗体包含恒定区，则所述恒定区也来自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸序列(例如，通过体外随机突变或定点突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”预期不包括其中来自另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列被移植到人框架序列上的抗体。术语“人单克隆抗体”指表现出单一结合特异性的抗体，其具有其中的框架区和 ⑶R区均来自人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一实施方案中，通过包含与永生化细胞融合的获自转基因非人类动物例如转基因小鼠的B细胞的杂交瘤制备所述人单克隆抗体，所述转基因非人类动物具有包含与人重链转基因和轻链转基因的基因组。本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)分离自具有人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤(下文进一步描述)的抗体，(b)分离自经转化以表达人抗体的宿主细胞例如转染瘤的抗体，(c)分离自重组、组合人抗体文库的抗体，以及(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有其中的框架和⑶R区来自人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方案中，可对此类重组人抗体进行体外突变(或者，当使用具有人Ig序列的转基因动物时在体内进行体细胞突变)并且因此所述重组抗体的Vh和\区的氨基酸序列尽管来自人种系Vh和\序列并且与之相关，却不是天然存在于体内的人抗体种系库的序列。如本文所使用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或 IgGl)。短语“抗体识别抗原”和“特异于抗原的抗体”在本文中可与术语“特异结合抗原的抗体”替换使用。术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一物质或抗体的结合物。术语“人源化抗体”旨在表示其中来自另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR 序列被移植到人框架序列上的抗体。可在所述人框架序列内进行另外的框架区修饰。术语“嵌合抗体”旨在表示其中的可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一物种的抗体，例如其中的可变区序列来自小鼠抗体并且恒定区序列来自人抗体的抗体。如本文所使用，“特异结合人BSSL”的抗体旨在表示以Ix 1(ΓΜ或更小，更优选切 10、或更小，更优选3x 10- 或更小、更优选Ix 10、或更小、甚至更优选切IOl或更小的Kd结合人BSSL的抗体。本文使用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞表示不结合或者不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即以Ix IO-fiM或更大、更优选Ix ΙΟ—Μ或更大、更优选 Ix 10_4 M或更大、更优选Ix IO3M或更大、甚至更优选Ix 10_%或更大的Kd结合蛋白质或细胞。本文使用的术语〃 Kass。。““或〃 Ka"旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文使用的术语"Kdis“或"Kd"旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。本文使用的术语"K/旨在表示解离常数，其获自&与1的比(即Kd/Ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可使用本领域中已确立的方法测定抗体的Kd值。测定抗体Kd的优选方法是使用表面等离子共振，优选使用诸如Biaeore 系统的生物传感系统本文使用的术语对IgG抗体的“高亲和力”指对目标抗原具有Ix IO-7M或更小、更优选切或更小、甚至更优选Ix 10、或更小，甚至更优选切IOl或更小并且甚至更优选Ix 10- 或更小的Kd的抗体。但是对其它抗体同种型的“高亲和力”结合可不同。例如，对IgM同种型的“高亲和力”结合指具有KTfiM或更小、更优选10_7M或更小、甚至更优选 10_8M或更小的Kd的抗体。如本文所使用，术语“个体”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物或非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、 两栖动物、爬行动物等。抗-BSSL抗体可根据本发明使用的抗体的特征是所述抗体的特定的功能特征或性质。例如，所述抗体特异结合人BSSL。优选地，所述抗体结合包含存在于人BSSL序列(SEQ ID NO 2)中的氨基酸序列的表位。最优选所述抗体结合存在于对应于SEQ ID NO 2的氨基酸1-722的氨基酸序列中的表位，甚至更优选所述抗体结合存在于BSSL的N端部分的表位，即存在于对应于SEQ ID NO 2的氨基酸1-500的氨基酸序列中的表位。优选的，所述抗体以高亲和力例如1x10_7M或更小的Kd结合人BSSL。根据本发明使用的抗-BSSL抗体优选表现出一种或多种以下特征⑴以Ix IO-7M或更小的Kd结合人BSSL ；(ii)阻断BSSL与表达CXCR4的细胞的结合；(iii)阻断BSSL增强的血小板聚集；(iv)阻断BSSL与复合物CXCR4/SDF-1的结合；
(ν)阻断SDF-I诱导的白细胞迁移。优选地，所述抗体以切10- 或更小的Kd结合人BSSL，&h 10. 或更小的Kd结合人BSSL，Wh 10- 或更小的Kd结合人BSSL，以虹1()- 或更小的Kd结合人BSSL，以3x 10_9或更小的Kd结合人BSSL,以2x 10_9或更小的Kd结合人BSSL,或者以Ix 1(Γ9Μ或更小的Kd结合人BSSL。所述抗体优选结合存在于人BSSL但是不存在于其它蛋白质中的表位。所述抗体通常结合人BSSL但是不与其它蛋白质结合，或者以低亲和力例如以Ix KTfiM的Kd或者更优选以Ix 10_5M或更大的KD，更优选以Ix 10_4 M或更大，更优选Ix IO3M或更大，甚至更优选Ix 10- 或更大的Kd与其它蛋白质结合。评价所述抗体对人BSSL的结合能力的标准测定法为本领域已知，包括例如 ELISA，蛋白质印迹法、RIA和流式细胞计数分析。还可通过本领域已知的标准测定法例如通过Biacore 系统分析测定抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)。制备单克降抗体可通过包括常规的单克隆抗体方法例如Kohler和Milstein (1975)的标准体细胞杂交技术在内的各种技术制备根据本发明使用的单克隆抗体(HlAb)。尽管优选体细胞杂交操作，但是在理论上可应用其它制备单克隆抗体的技术，例如病毒转染或癌基因转染B淋巴细胞。制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。在小鼠中制备杂交瘤是被广泛确立的操作。免疫方案以及用于融合的被免疫的脾细胞的分离技术为本领域公知。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合操作是已知的。可基于如上所述制备的非人单克隆抗体的序列制备根据本发明使用的嵌合或人源化抗体。可从感兴趣的非人杂交瘤获得编码重链和轻链的DNA并且使用标准的分子生物学技术进行工程化使其包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了生成嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠的可变区与人的恒定区连接(参见，例如US 4，816，567)。为了生成人源化抗体，可使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人的框架中(参见，例如US 5，225，539)。在优选的实施方案中，所述抗体是人单克隆抗体。可使用携带部分人免疫系统而非鼠免疫系统的转基因或转染色体小鼠生成此类抗BSSL的人单克隆抗体。这些转基因或转染色体小鼠包括在本文中分别被称作HuMAb小鼠@和KM小鼠 的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。HuMAb小鼠 (Medarex ,lnC·)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ 轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微卫星基因座，还具有使内源性μ和K基因座失活的靶向突变(参见，例如，Lonberg等人1994)。因此，所述小鼠表现出鼠IgM或κ的表达减少，并且在免疫后，所引入的人重链和轻链转基因发生类别转换和体细胞突变从而生成高亲和力的人IgGK单克隆抗体(Lonberg和Huszar 1995)。还可参见US 5, 545,806, US5, 770，429、US 5，545，807、WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884、WO 99/45962 和 WO 01/14424。在另一实施方案中，可使用在转基因或转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠制备根据本发明使用的人抗体。该小鼠在本文中被称作“KM小鼠 ”，如WO 02/43478中详述。另外，在本领域中可获得表达人免疫球蛋白基因的替代的转基因动物系统并且可用于制备根据本发明使用的抗-BSSL抗体。例如，可使用被称作XenomouSe(AbgeniX，Inc.) 的替代转基因系统；此类小鼠记载于例如US 5,939, 598, US 6,075, 181、US 6, 114, 598, US 6，150584和US 6，162,963。另外，在本领域中可获得表达人免疫球蛋白基因的替代的转染色体动物系统并且可用于制备抗-BSSL抗体。例如，可使用被称作“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；此类小鼠记载于Tomizuka等人Q000)。另外，本领域已记载了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等人2002)并且可用于制备抗-BSSL 抗体。还可使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示法制备根据本发明使用的人单克隆抗体。用于分离人抗体的此类噬菌体展示法是本领域确立的。参见例如US 5，223，409、US 5，403，484、US 5，571，698、US5, 427，908、US 5，580，717、US 5，969，108、US 6，172，197, US 5, 885, 793, US 6, 521, 404, US 6, 544, 731, US 6, 555, 313, US 6，582，915 和 US 6，593，081。还可使用SCID小鼠制备人单克隆抗体，所述SCID小鼠中重建了人免疫细胞从而在免疫后产生人抗体应答。此类小鼠记载于例如US5，476，996和US 5，698，767。RNAi可根据本发明使用的RNAi分子包含与选自以下的多聚核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列a)序列 SEQ ID NO :1，b)与SEQ ID NO 1具有至少80%、优选至少90%例如至少95%的序列一致性的 SEQ ID NO 1变异体，和/或c)与序列a)和b)互补的序列。此类RNAi分子是潜在的BSSL拮抗剂。MX可根据本发明使用的反义多聚核苷酸序列包含与选自以下的多聚核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列a)序列 SEQ ID NO :1，b)与SEQ ID NO 1具有至少80%、优选至少90%例如至少95%的序列一致性的 SEQ ID NO 1变异体，和/或c)与序列a)和b)互补的序列。此类反义多聚核苷酸序列分子是潜在的BSSL拮抗剂。 两个核酸序列之间的序列一致性百分数是所述序列中核苷酸相同的位点的数量， 将需要引入以用于两条序列的最佳比对的空位的数量和每一个空位的长度考虑在内。
如下测定两条多聚核苷酸序列之间的一致性百分数。首先，使用包含BLASTN版本 2. 0. 14 和 BLASTP 版本 2. 0. 14 的独立版本 BLASTZ 的 BLAST 2 Sequences (B12seq)程序比较多聚核苷酸序列和例如EQ IDNO 1。该独立版本的BLASTZ可获自U. S. Government ‘ s National Centerfor Biotechnology Information, N tit http://www. ncbi. nlm. nih. gov。可在BLASTZ附加的帮助文件中找到解释如何使用Blkeq程序的说明。Blkeq使用BLASTN算法进行两条多聚核苷酸序列之间的比较。为了比较两条多聚核苷酸序列，将 B12seq的选项设置如下将_i设置成包含预比较的第一条多聚核苷酸序列的文件(例如， C:\seql.txt)；将_j设置为包含预比较的第二条多聚核苷酸序列的文件(例如，C:\seq2. txt)；将-ρ设置为blastn;将-ο设置为任何期望的文件名(例如C: \output. txt)；所有其它选项均保留默认设置。例如，可使用以下指令生成包含两条多聚核苷酸序列之间的比较的输出文件C: \B12seq_i c:\seql.txt_j c:\seq2.txt_p blastn-oc \output. txt。如果所比较的两个序列具有序列相似性，则所命名的输出文件将显示出为比对序列的那些相似区域。如果所比较的两个序列不具有序列相似性，则所命名的输出文件不会显示出比对序列。一旦开始比对，则会通过对两条序列中存在相同核苷酸残的位置的数量进行计数来测定匹配数量。通过用匹配数量除以已鉴定的序列中列出的序列长度然后用所述数值乘以100 来测定一致性百分数。例如，如果比较长度为120个核苷酸的多聚核苷酸序列和SEQ ID NO 1中列出的序列，如上文所述比对后所述序列共有匹配数为114的序列，则该序列与SEQ ID NO 1中列出的序列具有95% (即114+120*100 = 95)的一致性百分数。BSSL简而言之，BSSL可分离自适合的组织例如乳汁。或者可使用标准的方法通过分离编码BSSL的DNA制备重组BSSL。可使用常规的分子生物学技术例如文库筛选和/或聚合酶链式反应(PCR)方便地从可商购的RNA、cDNA文库、基因组DNA或基因组DNA文库分离编码BSSL的DNA。这些技术详细记载于Molecular Cloning-ALaboratory Manual,第2版，Sambrook,Fritsch&Maniatis, Cold SpringHarbor Press。能够以登录号Ρ198!35 (CEL HUMAN) (SEQ ID NO :2)从SwissProt 数据库获得人BSSL的氨基酸序列，以及例如以登录号)(54457 (SEQ ID NO 1)从EMBL数据库获得cDNA序列。然后将所得到的编码BSSL的cDNA克隆入可商购的哺乳动物表达载体，例如 pcDNA3 (Invitrogen)、pMClneo (Stratagene)、pXTl (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、 EB0-pSV2-neo(ATCC 37593)、pBPV-1 (8-2) (ATCC37110)、pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pRSVneo(ATCC 37198)、pSV2_dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC 37460)、1ZD35(ATCC 37565)、pLXIN、pSIR (Clontech)禾口 PlRES-EGFP(Clontech)。使用标准转染技术将所得表达载体引入容易获得的培养的哺乳动物细胞系中，例如L细胞L-M (TK-) (ATCC CCL 1. 3)、L细胞L-M (ATCC CCL1. 2)、 THP-I(ATCC TIB 202)、HEK 293(ATCC CRL 1573)、Raji(ATCC CCL86)、CV-1(ATCC CCL 70)、 C0S-1(ATCC CRL 1650)、C0S_7 (ATCC CRL1651)、CH0_K1 (ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、 NIH/3T3(ATCC CRL1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS_C_1(ATCC CCL26) 禾口 MRC-5(ATCC CCL 171)。分离表达CEL的CH0、HEK293、HeLa以及克隆衍生物。将这些转染的细胞系用于制备重组CEL。或者，将编码BSSL的cDNA克隆入适用于在微生物中表达的容易获得的表达载体，例如细菌表达载体例如 pET(Invitrogen)、pDEST(Invitrogen)、pLEX(Invitrogen)、 pCAL (Stratagene)；用于在酵母中表达的酵母表表达载体pYES Qnvitrogen)、 pESC (Stratagene)以及用于在毕赤酵母中表达的pPICZ Gnvitrogen)。使用标准转染技术将所得表达载体引入容易获得的微生物株系中，例如大肠杆菌菌株JMlOl (Stratagene)和 JMl 10 (Stratagene)。从不同的组织和转染的细胞系纯化BSSL的方法是本领域公知的(Lombardo等人， 1978 ；Blackberg 和 Hernell 1981 ；Wang 和 Johnson 1983 ；Hansson 等人，1993)。制剂和给药可以标准方式例如通过口服、局部、肠胃外、含服、鼻腔或直肠给药或通过吸入给药为预治疗的病症给药根据本发明使用的抗体和抗体片段、RNAi分子和反义多聚核苷酸。 为实现这些目的，可通过本领域已知的方法将抗体和抗体片段、RNAi分子和反义多聚核苷酸配制成如下形式片剂、胶囊剂、水性或油性溶液剂、悬浮剂、乳剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、 鼻喷雾剂、栓剂、用于吸入的微细的散剂或气雾剂以及用于肠胃外使用(包括静脉内、肌肉内或输注)的无菌的水性或油性溶液剂或悬浮剂或无菌乳剂。还可在组合治疗中即与其它药物组合给药本发明的药物组合物。例如，所述组合治疗可包括与至少一种其它抗炎剂或免疫抑制剂组合的抗-BSSL抗体。如本文所使用，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。优选地，所述载体适合用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。本发明的药物组合物可包含一种或多种药学可接受的盐。“药学可接受的盐”指保留了母体化合物的期望生物学活性并且不会产生任何不利的毒理学作用的盐(参见，例如 Berge等人1977)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒的无机酸的那些，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等，以及衍生自无毒的有机酸的那些，例如脂肪族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等。碱加成盐包括衍生自碱土金属的那些，例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等，以及衍生自无毒的有机胺的那些，例如N，N' -二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙胺、乙二胺、普鲁卡因等。本发明的药物组合物还包含药学可接受的抗氧化剂。药学可接受的抗氧剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；( 油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酯、丁羟基茴香醚(BHA)、丁羟基甲苯 (BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。可用于本发明药物组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及它们的适合的混合物、植物油例如橄榄油以及注射用有机酯例如油酸乙酯。例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，通过在分散体的情况中维持所要求的粒径以及通过使用表面活性剂可维持适当的流动性。这些组合物还可包含辅剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操作和通过加入各种抗菌剂和抗真菌剂例如尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等可确保防止微生物的存在。还可能需要将等渗剂例如糖、氯化钠等加入所述组合物中。另外，通过加入延迟吸收的物质例如单硬脂酸铅和明胶可形成吸收延长的可注射的药物形式。药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射用溶液剂或分散体的无菌粉末。此类介质和试剂对于药学活性物质的用途是本领域公知的。
调节剂量以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可给药单次推注、可在一段时间内给药数个分次剂量或者可如治疗情况的紧迫性所示成比例地减少或增加剂量。 将肠胃外组合物配制成单位剂量形式以便于给药和实现剂量均一性是特别有利的。本文使用的剂量单位形式指适合用作用于预治疗个体的单一剂量的物理分离单位；每一个单位包含与所需的药物载体联合的经计算可产生期望治疗作用的预定量的活性化合物。本发明单位计量形式的规格取决于并依赖于以下因素(a)活性化合物的特性和预实现的具体疗效，和(b)配制此类化合物用于治疗个体中的过敏的技术中的固有局限性。对于抗体给药，以宿主体重计，剂量范围为约0.0001-100mg/kg并且更通常为 0. 01-5mg/kgo例如，齐[J量可为0. 3mg/kg体重、lmg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或 10mg/kg体重或者在l-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次、每四周、每月给药一次、每三个月给药一次或者每三个月-六个月给药一次。本发明抗-BSSL抗体的优选的剂量方案包括经静脉内或皮下给药的lmg/kg体重或:3mg/kg体重，或者使用以下给药方案之一给予抗体(i)每四周六个剂量，然后每三个月六个剂量；(ii)每三周给药一次；(iii):3mg/kg体重给药一次，然后每三周lmg/kg体重。实施例^MM 1. BSSL出现在肝_中并H龙肝脂肪夺+牛的状与粒件白细胞共定位检验肝脏是循环BSSL的来源这一假说个体和样品获取在癌症的选择性腹部手术中从四名患者获得人肝脏切片。从距离肿瘤位点大于一厘米的肝脏组织取切片。患者1是接受结肠癌肝转移手术的62岁男性；患者2是接受直肠癌肝转移手术的73岁女性；患者3是接受结肠癌肝转移的60岁女性，患者4是接受胆管细胞癌手术的63岁女性。所有患者均接受全身麻醉。根据生产商的使用指南使用Polymorphpi^pTM(Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway)从来自健康志愿者的全血样品分离多形核粒性白细胞和单核细胞。试验方案得到瑞典^iea大学医学会伦理委员会(Ethics Committee ofthe Medical Faculty of Umea University, Sweden)的批准。获得了所有参与者的知情同意书。RNA分离、cDNA合成、RT-PCR扩增和测序将所收集的用于RNA分离的新鲜肝脏标本立即浸入TRIzoI试剂(Invitrogen， Carlsbad, CA, USA)中并且根据使用说明分离总RNA。将分离的人血细胞(多形核粒性白细胞和单核细胞)重悬于RNAlater溶液(Ambion，Austin, TX, USA)并且于8°C温育过夜。使细胞沉淀，重悬于TRIzol，并且根据使用说明分离总RNA。使用NanoDrop NDlOO (NanoDropTechnologies, Wilmington, DE, USA)用分光光度法定量 RNA 产率，通过溴化乙锭染色在1 %琼脂糖凝胶上分离的核糖体RNA条带评价RNA的完整性。将RNA样品保存于-70°C直至使用。使用随机六聚体和iTaqMan逆转录试剂在100 μ 1的体积(AppliedBiosystems， Foster City, CA, USA)中从 IygS RNA 生成 cDNA。根据生产商的建议使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(AppliedBiosystems)进行 PCR。在20 μ 1的总体积内扩增一微升的cDNA。引物序列如下正向引物(BSSL10) 5' -TCCCGGGACCTGCCCGTTAT-5‘ (SEQ IDNO :3)；反向引物(BSSL 11)5' -CTGCAGAGAGACGCTGGCAC -3' (SEQ IDNO :4)。PCR 条件如下:95°C 5min，然后 94°C 45s, 60°C lmin，72°C lmin，共 40 个循环，最后72°C延伸8min。如果存在目标序列，预期PCR反应可产生包含BSSL外显子4 和5的327-bp产物。根据生产商的建议使用 Big Dye Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)对PCR片段进行直接测序。将BSSL 10或BSSL 11(如上所述) 用作引物。用ABI 373 OXL DNA分析仪(Applied Biosystems)分析所述反应。蛋白质提取和蛋白质印迹分析将获自患者2、3和4的肝组织碎片(约100-200mg)或血细胞(获自IOml全血的多核粒性白细胞或单核细胞)在包含蛋白酶抑制剂W.047 % NH3、0.4% Triton Χ-100、0· 08%十二烧基硫酸钠(SDQ、lMini CompleteTablet/50ml (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)]的缓冲液中勻浆。将所述勻浆于14，OOOrpm离心lOmin，收集上清并上样至偶联了抗-人BSSL多克隆抗体的HiTrap NHS-活化柱(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 在兔中制备所述BSSL抗体并且如前人所述进行纯化(Hansson等人，1993)。用添加了 0.02%叠氮化钠(妝队)和0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤后，用包含0. IM甘氨酸(pH 2. 5)、0· 02% NaN3和0. 01% EDTA的缓冲液洗脱结合的物质。于4°C进行所有步骤以将蛋白质裂解风险最小化。在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上分离洗脱的蛋白质并且转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad， Hercules, CA)。使用 ECL Advance Western Blotting Detection Kit 按照生产商的建议 (GE Healthcare)进行蛋白质印迹法。将多克隆抗-人BSSL抗体(Hansson等人1993)用作一抗，将过氧化物酶-共轭的驴-抗-兔IgG (DAK0，Glostrup，Denmark)用作二抗。将分离自人乳汁的BSSL(Blacliberg和Hernell 1981)和来自人胰腺的蛋白质提取物用作蛋白质印迹法中的阳性对照。组织学分析和油红0染代将用于组织学评价的标本在4%仲甲醛、0. IM磷酸缓冲液(pH 7.0)中固定过夜， 包埋在石蜡中、用显微镜用薄片切片机切片并且用苏木精和伊红染色。对于油红0染色， 于4°C将组织在4%仲甲醛、0. IM磷酸缓冲液(pH 7.0)中固定池并且通过于4°C在PBS中的30%蔗糖溶液中温育过夜进行冷冻保护。之后将标本包埋在Tissue Tek OCT化合物中 (Sakura FinetekEurope B. V. , Zoeterwoude, The Netherlands)，在干冰上冷冻并且 _70°C 保存直到进行切片。分析后，用恒冷箱切片机切割8-μ m厚的切片并且固定到SuperFrost Plus 玻片上(Menzel-Glaser，Braunschweig, Germany)。室温下用油红 0 染色液(60% 异丙醇中0. 3%油红0)将切片染色lOmin，然后用60%异丙醇洗涤。免疫组织化学和免疫荧光染代如上文对油红0染色所述将组织样品固定、包埋并且冷冻切片。将一滴10μ 1的分离的血细胞涂抹至SuperFrost Plus玻片上(Menzel-Glaser)并且在加湿室中于室温下放置lh。用3x PBS(2min)和Ix PBS (2x 2min)洗涤细胞并且于室温下在4%仲甲醛、0. IM 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中固定20min。对于单染-免疫组织化学研究，用Tris-缓冲盐水(TBS ；50mM Tris-HCl，pH 7. 5， 150mM NaCl)将晾干的切片洗涤3x 5min。通过在80%甲醇溶液中与0. 6%过氧化氢(H2O2)温育封闭内源性过氧化物酶活性。接着先后用TBS和TBS-Tn^WT 0. 1% Triton X-100 的TBS)洗涤后，在TBS-T中将切片与10%正常马血清(NHS)温育lh。加入第一抗体(兔抗-BSSL，1 1000稀释于TBS-T+10% NHS中)并且温育2h。在TBS-T (3x5min)中洗涤后， 加入生物素化二抗[羊抗-兔(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA，USA)，1 4000 稀释于TBS-T+10% NHS中]并且温育lh。在PBS(3x;3min)中洗涤切片并且与Vectastain Elite ABC 试剂(Vector Laboratories Inc.)温育 lh，再次在 PBS (3x min)中洗涤并且在二氨基联苯(DAB)溶液[将1片DAB(IOmg)溶解于15ml PBS+12y 1 H2O2中]中显色。最后， 用Mayer苏木精对切片进行复染、脱水并且固定在DPX显微镜封片剂(Merck Sharp&Dohme, Sweden)中。阴性对照包含与兔免疫前血清而非一抗温育的切片。对于免疫荧光染色，将如上文所述处理并固定于SuperFrost Plus玻片上的晾干的肝切片或分离的血细胞在PBS中洗涤lOmin。通过在H2A中温育IOmin封闭内源性过氧化物酶活性。在PBS(3x 3min)中洗涤后，在TBS-T中将切片或细胞与10% NHS温育lh。加入稀释于TBS-T+10% NHS中的一抗并温育2h。在TBS-T(3x 5min)中洗涤切片或细胞。加入二抗(1 1000稀释于TBS_T+10% NHS)并且将所述样品温育lh。将4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI ；分子探针)用于核复染。在TBS-T(3x5min)中洗涤切片或细胞并且固定于Vectashield荧光介质中。阴性对照由与兔免疫前血清而非一抗温育的切片或细胞组成。对于非透性化细胞的染色，在所有步骤中用TBS-T替换PBS。所有一抗(除了抗-BSSL)的主要反应性总结在表1中。表1.免疫细胞标记和BSSL在人肝脏中的共定位
权利要求
1.防止、预防和/或治疗炎性疾病的方法，包括向需要此类治疗的个体给药药学有效量的BSSL拮抗剂。
2.权利要求1所述的方法，其中所述BSSL拮抗剂是特异结合于人BSSL的抗体或抗体片段。
3.权利要求2所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.权利要求1所述的方法，其中所述BSSL拮抗剂是包含与编码人BSSL的多聚核苷酸序列或与其互补的序列的一部分互补的序列的RNAi分子或反义多聚核苷酸。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病选自与自身免疫疾病、过敏相关的炎症，与呼吸道、胃肠道疾病相关的炎症，与骨和关节相关的炎症，与结缔组织重建或肌骨骼病、心脏病或血管相关的炎症，与氧化一氮的产生相关的炎症，与皮肤、腹部、外周或中枢神经系统、眼或泪腺、耳、鼻、口、肺、心脏、肝脏、胰腺、甲状腺、肾脏、生殖泌尿道相关的炎症，或与感染或外伤相关的炎症。
6.权利要求5所述的方法，其中所述炎性疾病是类风湿性关节炎。
7.用于防止、预防和/或治疗炎性疾病的药物组合物，包含BSSL拮抗剂和药学可接受的载体或赋形剂。
8.权利要求7所述的药物组合物，其中所述BSSL拮抗剂是特异结合于人BSSL的抗体或抗体片段。
9.权利要求8所述的药物组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
10.权利要求7所述的药物组合物，其中所述BSSL拮抗剂是包含与编码人BSSL的多聚核苷酸序列或与其互补的序列的一部分互补的序列的RNAi分子或反义多聚核苷酸。
11.权利要求7-10中任一项所述的药物组合物，其中所述炎性疾病选自与自身免疫疾病、过敏相关的炎症，与呼吸道、胃肠道疾病相关的炎症，与骨和关节相关的炎症，与结缔组织重建或肌骨骼病、心脏病或血管相关的炎症，与氧化一氮的产生相关的炎症，与皮肤、腹部、外周或中枢神经系统、眼或泪腺、耳、鼻、口、肺、心脏、肝脏、胰腺、甲状腺、肾脏、生殖泌尿道相关的炎症，或与感染或外伤相关的炎症。
12.权利要求11所述的药物组合物，其中所述炎性疾病是类风湿性关节炎。
13.BSSL拮抗剂在制备用于防止、预防和/或治疗炎性疾病的药物组合物中的用途。
14.权利要求13所述的用途，其中所述BSSL拮抗剂是特异结合于人BSSL的抗体或抗体片段。
15.权利要求14所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
16.权利要求13所述的用途，其中所述BSSL拮抗剂是包含与编码人BSSL的多聚核苷酸序列或与其互补的序列的一部分互补的序列的RNAi分子或反义多聚核苷酸。
17.权利要求13至16中任一项所述的用于防止和/或治疗炎性疾病的用途，其中所述病症选自与自身免疫疾病、过敏相关的炎症，与呼吸道、胃肠道疾病相关的炎症，与骨和关节相关的炎症，与结缔组织重建或肌骨骼病、心脏病或血管相关的炎症，与氧化一氮的产生相关的炎症，与皮肤、腹部、外周或中枢神经系统、目艮或泪腺、耳、鼻、口、肺、心脏、肝脏、胰腺、甲状腺、肾脏、生殖泌尿道相关的炎症，或与感染或外伤相关的炎症。
18.权利要求17所述的用途，其中所述炎性疾病是类风湿关节炎。
全文摘要
本发明提供用于防止、预防和治疗诸如类风湿性关节炎的炎性疾病的方法和药物组合物，所述药物组合物包含蛋白质胆盐激活脂肪酶(BSSL)的拮抗剂。本发明还涉及包含BSSL拮抗剂的药物组合物以及它们在用于防止、预防和治疗诸如类风湿性关节炎的炎性疾病的方法中的用途。根据本发明使用的适合的BSSL拮抗剂是BSSL抗体。
文档编号A61K39/395GK102458464SQ201080025267
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月6日 优先权日2009年4月8日
发明者伦纳特·古斯塔夫·伦德贝格, 奥勒·赫奈尔, 苏珊·林德奎斯特 申请人:伦纳特·古斯塔夫·伦德贝格, 奥勒·赫奈尔, 苏珊·林德奎斯特