专利名称：Lcat治疗贫血和红细胞功能障碍的用途的制作方法
LCAT治疗贫血和红细胞功能障碍的用途相关申请的交叉引用本申请要求2009年6月12日提交的美国临时申请序号61/186，668和2010年9月9日提交的美国临时申请序号61/241，223的优先权。美国临时申请序号61/186，668和美国临时申请序号61/241，223的全部内容在此通过引用并入。 发明领域本发明大体上涉及医学领域，特别是治疗特征为贫血和/或在变形性、氧合作用、聚集、一氧化氮代谢或寿命方面具有异常功能的红细胞的疾病。
背景技术：
血流中红细胞(RBC)的质量和数量经常在生理应激增加期间下降，导致贫血和增加的发病和死亡风险。已经与贫血发生相关联的生理应激包括自身免疫病、大手术、创伤、感染性疾病、癌症、病危、糖尿病、肝病、肾病、心衰竭和寄生虫病。循环中升高水平的炎性细胞因子的存在证明，全身性炎症是所有这些情况共同的特征。即使在因为血红蛋白病而易患贫血例如镰形细胞贫血病或地中海贫血的人中，炎性细胞因子水平频繁升高并且可以加重疾病症状，特别是在病危期间。升高的炎性细胞因子水平的一个结果是酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的肝生成减少。正常而言，LCAT从肝释放入血浆以促进血浆脂质周转并维持血液中与血液灌注组织中胆固醇和磷脂的平衡。过量胆固醇从组织例如动脉去除，并递送至肝以通过称为反向胆固醇运输(RCT)的过程在胆汁中分泌。在PCT的第一步中，胆固醇从组织细胞穿越至循环中的高密度脂蛋白(HDL)。在第二步中，酶LCAT通过催化脂肪酸从磷脂酰胆碱(PC)(还称为卵磷脂)转酯为胆固醇以形成胆固醇酯(CE)，增强了 HDL携带胆固醇的能力。CE产物在HDL内部累积，直至它在肝中以HDL-受体被去除。通过HDL递送至肝的CE被转化成胆固醇和胆汁酸，其在胆汁中分泌。降低的血浆LCAT活性的健康后果在具有家族性LCAT缺陷(FLD)的人中最明显，家族性LCAT缺陷(FLD)是其中缺乏血浆LCAT活性的罕见遗传病。LCAT活性的缺乏导致血浆CE水平的极大降低，反映为降低的HDL和低密度脂蛋白，以及过量LCAT底物在血浆中积累。FLD的主要健康后果是角膜中脂质的扩散累积导致的视力下降、最终肾脂质累积(肾小球硬化)导致的肾衰竭和溶血性贫血。脂质代谢疾患(例如低LCAT活性导致的那些)导致的血浆脂蛋白脂质组成的畸变伴随RBC脂质含量的改变。响应于血浆脂质改变的RBC脂质改变可以改变RBC性能和存活，因为这些性质依赖于细胞脂质含量。可能发生的RBC脂质改变的类型在FLD受试者中是明显的，其中RBC富含胆固醇和PC并且神经鞘磷脂(SM)含量降低。这些RBC脂质异常取决于LCAT缺陷导致的血浆脂蛋白脂质紊乱的证据获自实验，其中在正常血浆输注入FLD受试者之后发生RBC胆固醇含量的临时正常化(Muryama等人Am J Hematol 16 129-117，1984)。RBC脂质的这种临时正常化可能由于LCAT、HDL、载脂蛋白A-I或具有FLD患者中缺乏或极大减少的其他血浆因子的补充。在减少的血浆LCAT活性的较不严重病例中发现贫血和LCAT活性之间没有关联。例如，具有较温和形式的LCAT缺陷的鱼眼病患者表现出小于10%的正常血浆LCAT活性，但是具有正常的血红蛋白和血细胞比容(Rousset等人.Curr Opin Endocrinol DiabetesObes 16 :163-171,2009)。类似地，对肝病受试者的研究发现，较低的LCAT活性与贫血之间没有关联(Lff Powell 等人(1975) Aust N Z J Med 5 101 107)，或者 LCAT 活性与 RBC 脂质异常之间没有关联(RA Cooper 等人(1972) J Clin Invest 51 3182-3192)。尽管生理应激下的人RBC中存在类似于FLD患者中检测的那些有害脂质改变的证据，但是LCAT和RBC水平或脂质之间没有明显关系。异常的RBC脂质组成的实例包括具有肝病的人和脂蛋白脂酶缺陷或Tangier疾病导致的血脂障碍的人RBC中增加的PC/SM比例的报道。我们(图I)和其他人也已经发现不处于病危中的镰形细胞贫血病患者的RBC中PC/SM比例增力卩。而且，报道了糖尿病、心脏病(包括急性冠状动脉综合征)、高胆固醇血症、镰形细胞贫血病患者以及太空飞行后的人中RBC中胆固醇富集。
改变的RBC脂质组成的结果还不完全了解，但是在升高的RBC胆固醇情况下存在膜蛋白活性变得异常的证据。来自肝病患者的胆固醇富集RBC表现出降低的Mg++-ATP酶和乙酰胆碱酯酶活性。胆固醇富集与磷脂酰丝氨酸从内部到细胞外膜表面增强的转移有关，这是网状内皮系统对RBC清除增强的信号。增加的RBC胆固醇可以减少RBC变形性并诱导异常的RBC形态，两者都可以影响经由毛细血管的RBC运输。跨膜气体交换是基本的RBC功能，也受到胆固醇升高的影响。目前证据表明，异常的RBC脂质组合物可能对红细胞功能具有有害作用，因此需要正常化RBC脂质组成的方法和治疗红细胞功能障碍的方法。发明概述文献中关于HDL-C和内源性LCAT活性之间的相关性没有一致意见。我们做出惊人的发现通过注射重组人LCAT增加血浆LCAT水平快速导致胆固醇从组织去除。此外，HDL-C快速增加。考虑到HDL与RBC之间存在平衡，这些惊人结果指示LCAT的输注也可用于快速校正血细胞脂质异常并改善血细胞功能。经常报道血浆HDL-C水平在生理应激情况下减少并且鉴于RBC和脂蛋白之间直接的脂质交换而可能是RBC脂质含量畸变的重要因素，所述生理应激例如自身免疫病、大手术、创伤、感染性疾病、癌症、病危、糖尿病、肝病、肾病、心衰竭和寄生虫病。贫血在其中HDL减少的情况下是非常流行的。本公开内容涉及通过施用治疗有效剂量的LCAT而增加LCAT浓度和/或活性高于正常人LCAT浓度和/或活性来调节红细胞膜脂质含量的方法。本公开内容的一个实施方案是治疗患有特征为红细胞功能障碍的病症的患者的方法，该方法包括给受试者施用治疗有效量的LCAT。另一实施方案是治疗患有特征为贫血或红细胞降低的变形能力、降低的氧合作用、降低的一氧化氮功能、增加的粘连和/或聚集或降低的寿命或其任意组合的病症的患者的方法，该方法包括给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT。在另一实施方案中，治疗患有特征为贫血或红细胞降低的变形能力、降低的氧合作用、降低的一氧化氮功能、增加的粘连和/或聚集或降低的寿命或其任意组合的病症的患者的方法包括测定基线的RBC变形性或RBC氧合作用或RBC聚集或粘连或RBC寿命；给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT ;和测定LCAT施用之后的变化，其中RBC变形性或RBC氧合作用的增加或减少的RBC聚集或粘连或增加的RBC寿命指示病症改善。在一些实施方案中，被治疗的病症是镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤。另一实施方案是治疗患有特征为RBC膜中高水平FC的病症的患者的方法，包括给有相应需要的受试者施用治疗有效量的LCAT。另一实施方案是治疗患有特征为RBC膜中高水平FC的病症的患者的方法，包括测定FC与PL的基线比例，给有相应需要的受试者施用治疗有效量的LCAT，并在施用LCAT之后测定FC与PL的比例，其中FC与PL的比例的降低指示病症的改善。另一实施方案是减少患者中血细胞的FC含量的方法，包括给患者施用治疗有效量的LCAT。另一实施方案是治疗患有特征为RBC膜中增加的PC/SM比例的病症的患者的方 法，该方法包括给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT。另一实施方案是治疗患有特征为RBC膜中增加的PC/SM比例的病症的患者的方法，包括测定PC与SM的基线比例，给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT，并测定施用LCAT之后的PC与SM比例，其中PC与SM比例的降低指示病症改善。另一实施方案是减少患者中血细胞的POSM比例的方法，包括给患者施用治疗有效量的LCAT。附图
简述图I显示正常受试者和镰形细胞贫血病受试者的RBC的磷脂组成。图2是描绘注射LCAT之后人ApoA-I转基因小鼠中血浆HDL-C的增加的图。图3描绘LCAT-敲除/载脂蛋白A-I转基因小鼠在注射重组人LCAT之后组织的胆固醇含量。发明详述本文使用的术语"治疗有效量"表示当根据期望的治疗方案施用时引发期望的治疗作用或响应的LCAT的量。优选的治疗有效量是增加血浆LCAT水平至高于正常水平的LCAT的量。本文使用的"LCAT水平"指LCAT的血浆浓度。如本文使用的，LCAT的"正常水平"表示目前没有接受可能改变LCAT水平的任何药物治疗的普通健康未治疗受试者中存在的LCAT血浆浓度。"正常水平"和"内源性水平"在本文可互换使用。为了避免怀疑,本文对"治疗(treatment)"或"治疗(treating)"的提及包括治愈性、缓解性和预防性的治疗。"受试者"和"患者"可互换使用。本文提及有效量或单位剂量时使用的之间是包含性的，例如"Img和5000mg之间"包括Img和5000mg。本文提及有效量或单位剂量时使用的"从"是包含性的，例如"从Img至5000mg"包括 Img 和 5000mg。" FC"是游离胆固醇的缩写并在如本文使用的表示非酯化的胆固醇。
"一氧化氮功能"表示依赖于一氧化氮的RBC介导的过程，包括一氧化氮生成、一氧化氮递送至微血管、抑制血小板和白细胞粘连、血管舒张、RBC变形性和RBC存活。" PC"是磷脂酰胆碱的缩写。" SM"是鞘磷脂的缩写。" RBC变形性"表示细胞改变其形状以适应动态变化的流动条件以最小化其流动阻力并使它们能够穿过小血管的能力。减少的变形性等同于增加的刚性。"基因治疗载体"是用于在薄壁组织细胞染色体中加入和主动表达感兴趣基因的物质。例如，被改造为携带人LCAT基因的腺病毒。"渗透脆性"表示细胞由于周围渗透压改变而破裂的敏感性。" RBC聚集性"表示在血浆蛋白或其他大分子存在下形成正常为钱串形的多细 胞聚集物的能力。" LCAT'与"卵磷脂-胆固醇酰基转移酶"可互换使用。" LCAT"或"LCAT多肽"在本文使用时包括天生序列LCAT、LCAT变体、修饰的LCAT和嵌合LCAT。在指定LCAT序列中氨基酸位置时，参考SEQ ID NO I人LCAT SEQ ID NO I (Genbank 访问号 AAB34898)FffLLNVLFPP HTTPKAELSN HTRPVILVPG CLGNQLEAKLDKPDVVNWMC YRKTEDFFTI WLDLNMFLCL GVDCffIDNTRVVYNRSSGLV SNAPGVQIRV PGFGKTYSVE YLDSSKLAGYLHTLVQNLVN NGYVRDETVR AAPYDffRLEP GQQEEYYRKLAGLVEEMHAA YGKPVFLIGH SLGCLHLLYF LLRQPQAffKDRFIDGFISLG APffGGSIKPM LVLAS⑶NQG IP頂SSIKLKEEQRITTTSP WMFPSRMAffP EDHVFISTPS FNYTGRDFQRFFADLHFEEG WYMWLQSRDL LAGLPAPGVE VYCLYGVGLPTPRTYIYDEG FPYTDPVGVL YED⑶DTVAT RSTELCGLffQGRQPQPVHLL PLHGIQHLNM VFSNLTLEHI NAILLGAYRQGPPASPTASP EFPPPE天生人LCAT蛋白序列的具体氨基酸序列使用单字母氨基酸名称加上在蛋白序列中的位置来描述，例如W2指位置2是色氨酸。为了表示特定位置的取代，取代的氨基酸在所述位置之后，例如W2Y指在位置2的色氨酸被酪氨酸替代。"天生序列LCAT"包括与天然产生的LCAT具有相同氨基酸序列的多肽。因此，叹声序列LCAT特别包括LCAT的天然存在的截短形式以及LCAT的天然存在的等位基因变体、天然存在的变体形式(例如，可选剪接形式)。优选的天生序列LCAT是成熟的天然序列LCAT。"修饰的LCAT"表示其中天生LCAT多肽中一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代、或者一个或多个氨基酸被添加至天生多肽的包括但不限于N末端或C末端氨基酸部分的多肽。例如而非限制，修饰的LCAT可以是美国专利申请号12/179,815中描述的修饰的LCAT蛋白。在其他实施方案中，一个或多个氨基酸被保守取代所取代。非限制性的示例性保守取代提供于表2。在其他实施方案中，一个或多个氨基酸被非天然存在的氨基酸所取代。此外，修饰的LCAT多肽包括LCAT或修饰的LCAT的衍生物。这些衍生物可以例如提高多肽的溶解度、吸收、生物半衰期。多肽衍生物是本领域公知的。本领域技术人员知道如何衍生多肽以改善其药理学性质。表 权利要求
1.一种治疗患有特征为贫血或红细胞功能障碍的病症的患者的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的增加LCAT活性、或增加LCAT血浆水平、或增加LCAT活性并增加LCAT血浆水平的物质。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述物质是LCAT。
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述物质是增加内源性LCAT的活性或水平的药物。
4.根据权利要求I所述的方法，其中所述物质是基因治疗载体。
5.权利要求2所述的方法，其中LCAT的量是增加LCAT浓度至高于正常LCAT水平或增加LCAT活性至高于正常LCAT活性的量。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述病症特征在于红细胞降低的变形能力、降低的氧合作用、增加的聚集和粘连、降低的一氧化氮功能、降低的寿命或其任意组合。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述病症是贫血。
8.权利要求5所述的方法，其中所述病症是镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤。
9.权利要求8所述的方法，其中所述炎性疾患是败血症、类风湿病、炎症贫血或术后炎症。
10.权利要求8所述的方法，其中所述微血管疾患是痴呆或视网膜病。
11.权利要求8所述的方法，其中所述病症是寄生虫病，并且所述寄生虫病是疟疾、昏睡病、丝虫病或利什曼原虫病。
12.权利要求8所述的方法，其中所述病症是阿尔茨海默氏相关痴呆。
13.权利要求8所述的方法，其中所述病症是镰形细胞贫血病。
14.权利要求8所述的方法，其中所述病症是地中海贫血病。
15.权利要求8所述的方法，其中所述LCAT是修饰的LCAT。
16.权利要求5所述的方法，其中所述修饰的LCAT包括在位置31处的氨基酸取代。
17.一种改善特征为以下一个或多个的病症的方法贫血、红细胞降低的变形能力、降低的氧合作用、增加的RBC聚集和粘连、降低的一氧化氮功能、降低的RBC寿命，所述方法包括 获得以下的一个或多于一个的基线测量血红蛋白水平、血细胞比容水平、RBC变形性、RBC氧合作用、RBC聚集和粘连或RBC寿命； a)给有相应需要的患者施用治疗有效量的增加LCAT活性、或增加LCAT血浆水平、或增加LCAT活性并增加LCAT血浆水平的物质； b)获得以下一个或多个的治疗后测量血红蛋白水平、血细胞比容水平、RBC变形性、RBC氧合作用、RBC聚集和粘连或RBC寿命； c)比较所述基线测量和所述治疗后测量，其中以下一个或多个的出现指示所述病症的改善血红蛋白水平、血细胞比容水平的增加、RBC变形性的增加、RBC氧合作用的增加、RBC聚集和粘连的降低或RBC寿命的增加。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述物质是增加内源性LCAT的活性或水平的药 物。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述物质是基因治疗载体。
20.根据权利要求17所述的方法，其中治疗有效量的物质是治疗有效量的LCAT。
21.权利要求20所述的方法，其中所述RBC变形性在施用LCAT之后增加。
22.权利要求20所述的方法，其中RBC氧合作用在施用LCAT之后增加。
23.权利要求20所述的方法，其中所述血细胞比容水平在施用LCAT之后增加。
24.权利要求20所述的方法，其中所述血红蛋白水平在施用LCAT之后增加。
25.权利要求20所述的方法，其中一氧化氮功能在施用LCAT之后增加。
26.权利要求20所述的方法，其中RBC寿命在施用LCAT之后增加。
27.权利要求20所述的方法，其中RBC聚集和粘连在施用LCAT之后减少。
28.根据权利要求1、2、5-16和20-27任一项所述的方法，其中LCAT的治疗有效量是提高LCAT浓度或LCAT活性至高于正常LCAT水平的量。
29.根据权利要求1、2、5-16和20-28任一项所述的方法，其中LCAT的施用是通过静脉内注射、皮下注射或肌肉内注射。
30.根据权利要求1、2、5-16和20-29任一项所述的方法，其中施用的LCAT的量是约IOmg 至约 5000mg。
31.根据权利要求I、2、5-16和20-29任一项所述的方法，其中施用的LCAT的量是LCAT正常水平的I倍至1000倍。
32.—种治疗患有特征为RBC膜中高PC/SM比例的病症的患者的方法，所述方法包括给所述患者施用
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述病症是镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤。
34.根据权利要求33所述的方法，还包括测定PC与SM的基线比例和测定施用LCAT之后的PC与SM比例，其中PC与SM比例的降低指示所述病症的改善。
35.一种治疗患有特征为高FC含量的病症的患者的方法，该方法包括给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述病症是镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤。
37.权利要求36所述的方法，其中血细胞是红细胞、单核细胞、血小板、嗜中性粒细胞或白细胞。
38.权利要求37所述的方法，其中所述血细胞是红细胞。
39.一种改善特征为RBC膜中高水平FC的病症的方法，该方法包括 获得FC与PL比例的基线测量； a)给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT； b)获得FC与PL比例的治疗后测量； c)比较所述基线测量与所述治疗后测量，其中FC与PL比例的降低指示所述病症的改善。
40.根据权利要求32-39任一项所述的方法,其中所述LCAT通过静脉内注射、皮下注射或肌肉内注射来施用。
41.根据权利要求32-40任一项所述的方法，其中施用的LCAT的量是约IOmg至约5000mgo
42.根据权利要求32-40任一项所述的方法，其中施用的LCAT的量是LCAT正常水平的I倍至1000倍。
43.根据权利要求32-42任一项所述的方法，其中所述LCAT是修饰的LCAT。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述修饰的LCAT包括在位置31处的氨基酸取代。
45.一种治疗患有特征为贫血或红细胞功能障碍的病症的患者的方法，该方法包括给有相应需要的受试者施用治疗有效量的LCAT，其中所述受试者的血浆HDL-C水平在施用LCAT之后快速增加。
46.权利要求45所述的方法，其中所述病症是镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤。
47.权利要求46所述的方法，其中所述炎性疾患是败血症、类风湿病、炎症贫血或手术后炎症。
48.权利要求46所述的方法，其中所述微血管疾患是痴呆或视网膜病。
49.权利要求46所述的方法，其中所述病症是寄生虫病，并且所述寄生虫病是疟疾、昏睡病、丝虫病或利什曼原虫病。
50.权利要求46所述的方法，其中所述病症是阿尔茨海默氏相关痴呆。
51.权利要求46所述的方法，其中所述病症是镰形细胞贫血病。
52.权利要求46所述的方法，其中所述病症是地中海贫血病。
53.根据权利要求44-52任一项所述的方法，其中LCAT施用之后4小时所述受试者中的血浆HDL-C水平比LCAT施用之前的血浆HDL-C水平增加至少50%。
54.根据权利要求44-52所述的方法，其中LCAT施用之后24小时所述受试者中的血浆HDL-C水平比LCAT施用之前的血浆HDL-C水平增加至少100%。
全文摘要
公开了通过施用增加内源性LCAT或LCAT活性水平的物质来治疗特征为贫血或红细胞功能障碍的病症的方法。还公开了治疗其中红细胞具有降低的与变形性、氧合作用相关的功能、增加的粘连和聚集性、降低的一氧化氮功能、或减少的寿命、增加的游离胆固醇或异常磷脂含量的病症的方法。还公开了治疗特征为红细胞中游离胆固醇异常浓度的病症的方法，以及正常化红细胞的游离胆固醇含量的方法。
文档编号A61K38/45GK102802659SQ201080025155
公开日2012年11月28日 申请日期2010年6月14日 优先权日2009年6月12日
发明者B·奥尔巴赫, B·克劳泽, R·霍曼 申请人:阿尔法科制药有限责任公司