专利名称：用于制备放射性免疫缀合物的方法
用于制备放射性免疫缀合物的方法本专利公开包含受到版权保护的材料。版权所有人不反对美国专利及商标局的专利文件或记录中出现的对专利文件或专利公开的传真复制，但除此之外任何情况下均保留任何及所有的版权。本文提及的所有公开、专利申请、专利和其他文献均以引用方式全文并入本文。本文所指出的专利和科学文献建立了本领域的技术人员可利用的知识。本文所引用的专利公开、申请和其他公开以引用方式并入本文，如同每ー份文献均以引用方式具体且单独地指出并入本文。在矛盾的情况下，以专利公开为准。
背景技术：
在诊断和治疗医学过程中可以使用放射性免疫缀合物。放射性药物可以携带至少一种与载体结合的放射性核，例如靶向部分。放射性核可以产生可通过放射学诊断设备检测的信号。由于放射性核发出的辐射对组织具有毒性作用，所以放射学免疫缀合物可以用于取得一种或多种治疗作用。当定位于肌体中的特定结构或位点处的放射性免疫缀合物用作治疗试剂吋，其可以用于将放射性免疫缀合物的作用集中在待治疗的结构或位点中，并且可以减少肌体中其他结构和位点处的有害作用。例如，放射性免疫缀合物可以用作杀死癌组织的化疗药品。需要用于制备放射性免疫缀合物的改善的方法。本发明解决了这种需要。发明ネ既述在ー个方面中，本文所述的方法涉及制备锕-225 (Ac-22。放射性缀合物的方法， 该方法包含以下步骤(a)在缀合反应混合物中，使螯合试剂与生物分子缀合，从而制备缀合的生物分子；(b)纯化所述的反应混合物从而除去未缀合的螯合试剂；以及(c)在螯合反应混合物中，使ー个或多个Ac-225放射性核与缀合的生物分子螯合，从而制备Ac-225放射性缀合物。在一个实施方案中，步骤(a)中的缀合包含在大约37°C下将缀合反应混合物温育 1.5小吋。在另ー个实施方案中，步骤(a)中的缀合包含在大约16°C至大约20°C下将缀合反应混合物温育大约M小吋。在另ー个实施方案中，纯化包含使缀合反应混合物通过过滤器过滤以便纯化缀合的生物分子。在一个实施方案中，缀合反应混合物包含碳酸氢盐缓冲剂。在另ー个实施方案中， 缀合反应混合物包含磷酸盐缓冲剂。在另ー个实施方案中，缀合反应混合物的pH为大约 8. 0至大约9. 2。在一个实施方案中，过滤是在HEPES缓冲剂中进行的。在另ー个实施方案中，过滤是在NaAc缓冲剂中进行的。在另ー个实施方案中，过滤包含阻隔的分子量为至少大约 10，OOODa、至少大约20，OOODa或者至少大约40，OOODa0在一个实施方案中，螯合反应混合物包含龙胆酸或抗坏血酸。在另ー个实施方案中，螯合反应混合物的pH为大约5. 5至大约7. 0。
在另ー个实施方案中，步骤(a)中的螯合包括在大约37°C下将ー个或多个Ac-225 放射性核与缀合的生物分子温育大约1. 5小吋。在另ー个实施方案中，所述的方法进ー步包括将终止螯合剂加入到螯合反应混合物中的步骤。在一个实施方案中，终止螯合剂为ニ乙烯三胺五乙酸(DTPA)。在另ー个实施方案中，所述的方法进ー步包括在加入终止螯合剂的步骤之后在大约37°C下将螯合反应混合物温育大约30分钟的步骤。在一个实施方案中，所述的生物分子包含蛋白质、肽、多核苷酸、它们的組合或者它们的衍生物。在一个实施方案中，所述的生物分子为抗体、其抗原结合片段、包含抗体的抗原结合多肽序列的单链蛋白质、単一结构域抗体、之前所述的任何一种物质的类似物或者之前所述的任何ー种物质的衍生物。在另ー个实施方案中，抗原结合片段为单克隆抗体的可变区。在另ー个实施方案中，所述的生物分子为包含抗体的抗原结合序列的蛋白质。在另ー 个实施方案中，所述的生物分子为天然、合成或重组产生的蛋白质，该蛋白质包含与細胞表面上的抗原结合的抗体的抗原结合序列。在另ー个实施方案中，靶向細胞的表面上的抗原为⑶-33。在另ー个实施方案中，所述的生物分子为HuM195。在一个实施方案中，所述的放射性缀合物为放射性免疫缀合物。在另ー个实施方案中，所述的螯合试剂为双功能螯合试剂。在一个实施方案中，所述的双功能螯合试剂为S-2-(4-异硫氰基苄基)-1，4，7，10四氮杂环十二烷四乙酸(p-SCN-Bn-DOTA)。在另ー个实施方案中，所述的螯合试剂选自ニ乙烯三胺五乙酸 (“DTPA“ ) ;1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N'，N" ,N'“-四乙酸(〃 DOTA“ ) ;p_ 异硫氰基苄基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(〃 pSCN-Bz-DOTA" ) ； 1，4，7， 10-四氮杂环十二烷-N，N'，N"-三乙酸(〃 DO 3A〃)； 1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4， 7，10-四(2-丙酸)(“DOTMA “ ) ;3，6，9-三氮杂-12-氧杂-3，6，9-三羧基亚甲基-10-羧基-13-苯基-十三-烷酸(〃 B-19036" ) ;1，4，7_三氮杂环壬烷-N，N'，N"-三乙酸 (“ΝΟΤΑ" ) ；1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N'，N"，N'“-四乙酸(〃 TETA“ ) ’三乙烯四胺六乙酸(〃 TTHA “)；反式-1，2_己ニ胺四乙酸(〃 CYDTA “ ) ;1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-(2-羟基丙基)4，7，10_三乙酸(〃 HP-DO 3A")；反式-环己烷-ニ胺四乙酸 (“CDTA“)；反式-(1，2)_环己烷ニ乙烯三胺五乙酸(〃 CDTPA“ ) ；1_氧杂_4，7，10-三氮杂环十二烷-N，N'，N"-三乙酸(〃 OTTA“ ) ;1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四 {3-(4-羧基1)-丁酸} ；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四(乙酸-甲基胺)；1， 4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四(亚甲基膦酸)；2，2'，2〃 - (10バ2_ (2，5-ニ氧代吡咯烷-1-基氧基)-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸 (D0TA-NHS酷)；以及它们的衍生物、类似物和混合物。在另ー个方面中，本文所述的方法涉及用于制备[Ac-225]-p-SCN-Bn-DOTA/ HuM195放射性免疫缀合物的方法，该方法包含以下步骤(a)在大约37°C下，在包含碳酸氢盐缓冲剂和PH为大约8. 0至大约9. 2的缀合反应混合物中，使p-SCN-Bn-DOTA与HuM195 抗体缀合大约1. 5小吋，从而制备p-SCN-Bn-D0TA/HuM195免疫缀合物；(b)使缀合反应混合物通过过滤器过滤，该过滤器阻隔的分子量为至少大约10，OOODa、至少大约20，OOODa或者至少大约40，OOODa,以便纯化p-SCN-Bn-D0TA/HuM195免疫缀合物，其中所述的过滤是使用HEPES缓冲剂或NaAc缓冲剂进行的；(c)在大约37°C下，在包含龙胆酸和pH为大约5. 5 至大约7. 0的螯合反应混合物中，使ー个或多个锕-225放射性核与p-SCN-Bn-D0TA/HuM195 免疫缀合物螯合，从而制备[Ac-225]-p-SCN-Bn-D0TA/HuM195放射性免疫缀合物；(d)将 DTPA加入到螯合反应混合物中；以及(e)在大约37°C下，将螯合反应混合物温育大约30分钟。在某些实施方案中，本文所述的方法进ー步包含在步骤(b)的过滤之后通过体积排阻树脂进行的体积排阻色谱的步骤。在一个实施方案中，体积排阻树脂的体积排阻极限为大约5000Da。在某些实施方案中，本文所述的方法进ー步包含使用体积排阻树脂通过体积排阻色谱纯化放射性缀合物或[Ac-225]-p-SCN-Bn-D0TA/HuM195放射性免疫缀合物。在ー个实施方案中，体积排阻树脂的体积排出极限为大约6000Da。在另ー个实施方案中，体积排阻树脂的体积排阻极限为大约5000Da。在另ー个方面中，本发明涉及通过本文所述的方法制备的放射性免疫缀合物。附图简述图IA粉色的为天然Hum-195的UV光谱，蓝色的为Hum_195/D0TA的UV光谱。两种溶液的溶液的浓度均为大约100μ g/mL ；使用Icm的光路的小玻璃管測量吸光率。图 IB HSA (0. 1 %,绿色)、天然 Hum-195 (100 μ g/mL，粉色)以及 DTPA/ NaAc (100 μ g/mL)的 UV 光谱。图 2 天然 Huml95 的 SE-HPLC/UV 色谱。图3使用用于定量HuM-195的UV检测器校准HPLC。图4所述缀合物的SE-HPLC/UV色谱。图5在HuM-195的定量中用于校准UV分光光度计的典型校准曲线，波长=280nmo图6使用Ac-225标记的缀合物(在纯化之后的主要蛋白质级份)的SE-HPLC/rad 色谱。图7包含游离的或DTPA结合的Ac-225的SE-HPLC/rad色谱。图8在P-IO柱和反应器小瓶+QC中纯化之后在液体级份中Ac-225的典型活力分布(总的活力为1. 2mCi Ac-225)。图9在高分辨率Ge检测器上Ac_225和继承元素的典型Y光谱。
图10使用CHCA作为基质溶液的天然Huml95的典型MALDI光谱。图11使用CHCA作为基质溶液的缀合物的典型MALDI光谱。图12 —步及两步制备物的PAGE Gel电泳，其显示出了用于计数分析的阻隔的凝胶部分。图13在各个阻隔的凝胶部分中的活力。结果符合结合有HuM-195的Ac_225的大量百分率。对于一歩配制物和两步配制物而言，结果是一致的。图14PAGE Gel电泳用于分析对照和使用一歩方法得到的制备物。以与ー步过程相同的方式制备对照，但是所述的抗体在与Ac-225螯合之前并未与DOTA双功能螯合试剂缀合。与一步制备物相反，对照制备物显示出极少量的Ac-225与HuM-195结合。发明详述本发明提供了用于制备放射性免疫缀合物的方法。在ー个方面中，本发明涉及用于标记单克隆抗体(mAb) (IgG)的改善的方法。在一个实施方案中，所述的方法为“后标记或一歩方法”。在ー个方面中，本文所述的方法涉及用于制造放射性免疫缀合物的一步缀合后螯合的方法。在一个实施方案中，所述的放射性免疫缀合物为[Ac-225]-p-SCN-Bn-DOTA/ IgG(HuM195)构建体。本文所述的放射性免疫缀合物可以通过首先形成缀合的靶向部分、然后使放射性核与缀合的靶向部分螯合从而形成放射性免疫缀合物来制备。所述的缀合的靶向部分可以在与靶向部分缀合后的任何时间进行放射性标记。在一个实施方案中，mAb首先与DOTA双功能螯合试剂缀合，然后经纯化的缀合物使用Ac-225标记。根据本文所述的ー些实施方案，仅需要単一的ー步涉及225Ac来标记生物分子。本文所述的方法优于两步或重标记方法的益处包括但不限于符合较高的标记产率、 简单以及较短的标记时间。此外，与两步或重标记方法相比，本文所述的方法的升级可以更容易地进行。此外，本文所述的方法可以用于制备试剂盒配制物，其中可以在临床位点处形成最终的放射性标记。在一个实施方案中，HuM-195/p-SCN-Bn-DOTA缀合物可以通过使HuM_195的浓缩溶液与p-SCN-Bn-DOTA在pH为大约8至大约9下在碳酸氢盐或磷酸盐缓冲剂中反应、并在大约37°C或室温下温育来制备。在另ー个实施方案中，生物缀合物可以由过量的生物功能螯合剂通过重复过滤或离心、并通过比重体积排阻色谱(SEC)来纯化。在纯化方法过程中， 所述的碳酸氢盐或磷酸盐缓冲剂被改变为N-2-羟基乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES ；游离酸)或醋酸盐介质。缀合物可以通过体积排阻高效液相色谱(SE-HPLC)来表征。为了进行标记，在少量游离的自由基清除剂存在下，将HuM-195和225kc溶液在醋酸盐缓冲剂中形成的PH为大约5. 5至大约7. 0的混合物中温育大约80至大约90分钟。 在反应并使用DTPA攻击后，可以通过瞬时薄层色谱(ITLC)測定标记产率。然后可以通过比重体积排阻色谱(SEC)来纯化样品混合物。在纯化的蛋白质级份中，可以分别通过无损高分辨率Y光谱测定法以及UV分光光度法来測量^5Ac和蛋白质的量。通过ITLC和/或 SE-HPLC测量纯化级份中的放射化学纯度。在ー个方面中，本发明包含具有CD33靶向部分的放射性免疫缀合物。根据本发明，靶向部分可以为合成或天然的蛋白质、或其一部分或其变体(包括物种、等位基因及突变体变体)。在一些实施方案中，靶向部分包含抗体部分。使用本文所述的方法制备的放射性免疫缀合物可以用于诊断或治疗医学过程中。 例如，所述的放射性药物可以用作成像造影剤以便产生PET或其他X光线照相术的图像。备选地，所述的放射性药物可以用作将一定剂量的射线传递至肌体中的生理学活性的特定结构或位点处的治疗试剂。本领域的技术人员将理解所述的放射性药品的其他药物用途。在另ー个方面中，本发明提供了用于治疗受试对象中的癌症的方法，该方法包含向所述的受试对象给药药物有效量的放射性免疫缀合物。在另ー个方面中，本发明提供了用于治疗受试对象中的癌症的方法，该方法包含向所述的受试对象给药药物有效量的药物组合物，其中所述的组合物包含与細胞表面上的 CD33分子特异性地结合的放射性免疫缀合物。定义
除非另作说明，如本文以及所附的权利要求书中所用，単数形式“a”、“an”和 “the”包括多个所指的事物。术语“大约”在本文中用于指近似地，在大体上或附近的范围内。当术语“大约”与数字范围结合使用吋，其通过向上及向下延伸所列数值的边界来修改所述的范围。术语“大约”在本文中用于指将所述的值向上及向下改变20%来修改数值。如本文所用，术语“纯度”是指在混合物中基本存在単一的化学实体或者缺乏大量的污染物。使用标准的分析方法，例如高效液相色谱(HPLC)或过滤器纯化，来測量通过所公开的方法制备的缀合分子的纯度。当通过测定缀合的靶向部分或放射性免疫缀合物的量来测量纯度吋，该纯度可以高于大约70%、高于大约80%，高于大约90%，高于大约95%，高于大约96 %，高于大约97 %，高于大约98 %或者高于大约99 %。当通过测定污染物的量来测量纯度时，诸如未缀合的螯合试剂之类的污染物可以少于大约20%、少于大约10%或者少于大约1%。如本文所用，术语“生物分子”是指含碳分子(包含高分子)，并且包含在生物学系统中发现的任何已知的分子，包含氨基酸、抗体、蛋白质、肽、核酸(包含DNA和RNA)、糖类、 多糖等。生物分子包含天然形成的以及此类分子的衍生物、类似物和修饰物的那些。此外， 所述的术语是指含碳分子，例如药物、抗生素以及在医学中使用的那些等。不能在自然界中找到的包含修饰的碱基的核酸类似物被包含在生物分子的范围内。简言之，在自然界中发现的分子的任何类似物或者此类分子的任何化学修饰物也都包含在生物分子的定义内。生物分子可以由自然界来源分离得到或者在试验室中合成，例如合成的蛋白质、合成的肽或寡核苷酸。如本文所用，术语“靶向部分”是指起到识别特定的生物学靶向位点的任何蛋白质、抗体、抗体片段、激素、肽、生长因子、抗原、半抗原或任何其他载体。抗体及抗体片段是指任何多克隆、单克隆、嵌合、人、哺乳动物、单链、ニ聚以及四聚抗体或抗体片段。当此类生物学载体与官能化的络合物连接吋，其起到将所连接的放射性核携帯至特定的靶向组织中的作用。术语“抗体”是指任何多克隆、单克隆、嵌合抗体或异种抗体。在本发明的放射性核缀合物中使用的抗体为对所需的癌細胞具有高特异性的单克隆抗体。在本发明中使用的抗体可以定向针对(例如)癌、肿瘤、白血病、自身免疫紊乱，这些紊乱与免疫系统的細胞、 需要被消融的正常細胞(例如骨髄和前列腺组织)、病毒感染的細胞(包括HIV、支原体、分化及其他細胞膜抗原、病原体表面抗原以及任何生物学活性分子)有关。适用于本文所述的方法的抗体的一些实例包括但不限于HuM195(抗-⑶33)， CC-11, CC-46, CC-49, CC-49F(ab‘ )2，CC-83，CC-83F(ab‘ )2·Β72. 3。抗体片段包括Fab 片段、F(ab' )2片段以及对所需的ー个或多个抗原决定部位具有特定性的抗体的任何部分。 可以在本发明的放射性核缀合物中使用的抗体可以通过本领域公知的技术来制备。高特异性单克隆抗体可以通过本领域公知的杂交技术来制备，例如參见Kohler and Milstein, Nature，256，495-497(1975)和 Eur. J. Immunol.，511-519(1976)。如本文所用，术语“放射性缀合物”是指使用放射性核标记的生物分子缀合物(例如其中蛋白质缀合物的螯合试剂部分形成了具有放射性核的络合物的ー类)。
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如本文所用，术语“放射性免疫缀合物”是指使用放射性核标记的靶向部分缀合物 (例如其中蛋白质缀合物的螯合试剂部分形成了具有放射性核的络合物的ー类)。当形成本文所述的放射性免疫缀合物吋，有利的是螯合和缀合度较高。 如本文所用，术语“缀合度”和“缀合产率”可交換使用，并且被定义为与靶向部分成功缀合的螯合剂除以在缀合反应中使用的全部螯合剂的百分率。当形成所述反应的缀合靶向部分吋，缀合百分率高于50%、高于70%、高于90%、高于95%、高于大约96%、高于大约97 %、高于大约98 %、或者高于大约99 %。如本文所用，术语“螯合度”和“螯合产率”可交換使用，并且被定义为与缀合的靶向部分功能螯合的放射性核除以在螯合反应中使用的全部放射性核的百分率。当形成所述反应的放射性免疫缀合物吋，缀合百分率高于50%、高于70%、高于90%、高于95 %、高于大约96%、高于大约97%、高于大约98%、或者高于大约99%。如本文所述，产生的缀合度和螯合度可以取决于放射性免疫缀合物制备方法的一个或多个參数。根据本文所述的方法，靶向部分可以溶解于包含螯合剂的缓冲溶液中。可以选择 PH以便优化在缀合反应混合物中用于使螯合剂与靶向部分缀合的条件。在一个实施方案中，缀合反应混合物可以包含碳酸氢盐缓冲剂。在另ー个实施方案中，缀合反应混合物可以包含磷酸盐缓冲剂。在另ー个实施方案中，缀合反应混合物的PH可以为大约8. 0至大约 9. 2。例如，缀合反应混合物的pH可以为大约8. 0、大约8. 1、大约8. 3、大约8. 4、大约8. 5、 大约8. 6、大约8. 7、大约8. 8、大约8. 9、大约9.0、大约9. 1或者大约9. 2。此外，还可以调节缀合反应混合物的温度，以便促进螯合剂与靶向部分的缀合。在一个实施方案中，可以在大约37°C的温度下温育缀合反应混合物。在另ー个实施方案中，可以将缀合反应混合物温育大约1.5小吋。在另ー个实施方案中，缀合的靶向部分可以溶解于包含放射性核的缓冲溶液中。 可以选择PH以便优化在螯合反应混合物中用于使放射性核与缀合的靶向部分螯合的条件。在一个实施方案中，螯合反应混合物可以包含龙胆酸。在另ー个实施方案中，螯合反应混合物的PH可以为大约5. 5至大约7. 0。例如，螯合反应混合物的pH可以为大约5. 5、大约5. 6、大约5. 7、大约5. 8、大约5. 9、大约6. 0、大约6. 1、大约6. 2、大约6. 3、大约6. 4、大约 6. 5、大约6. 6、大约6. 7、大约6. 8、大约6. 9或者大约7. 0。此外，还可以调节螯合反应混合物的温度，以便促进放射性核与缀合的靶向部分的螯合。在一个实施方案中，可以在大约37°C的温度下温育螯合反应混合物。在另ー个实施方案中，可以将螯合反应混合物温育大约1. 5小吋。在一段时间后，可以通过加入淬火螯合物(例如ニ乙烯三胺五乙酸(DTPA))使所述的溶液淬火，并可以纯化反应混合物。在一个实施方案中，在加入淬火螯合物之后，可以进一歩温育螯合反应混合物。在一个实施方案中，在加入淬火螯合物之后，可以将螯合反应混合物进ー步温育大约30分钟。在另ー个实施方案中，在加入淬火螯合物之后，可以将螯合反应混合物在大约37°C下进ー步温育。螯合剂双功能螯合剂为具有双重功能的化合物，所述的功能为螯合金属离子，以及与具有肿瘤細胞抗原决定部位或抗原的特异性的生物学载体共价结合的能力。当此类化合物与(例如)放射活性金属粒子络合并且与特定的抗体共价链接吋，可用于治疗和诊断应用中。这些类型的络合物可以用于将放射活性金属携帯至肿瘤细胞处，该肿瘤細胞被所述的连接抗体的特异性所靶向[例如參见Mears et al.，Anal. Biochem. 142，68-74 (1984)； Krejcarek et 已丄· ，Biochem. And Biophys. Res. Comm. 77，581—585、丄977)]。大量的螯合剂是本领域已知的。例如參见Pitt et al.，“ The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload," In,INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE ；Martel1, Ed. ；American Chemical Society, Washington, D. C.， 1980,pp. 279-312 ;Lindoy，THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES ；Cambridge University Press, Cambridge, 1989 ；Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY ；Springer-Verlag, New ^rk，1989，并且这些文献包含在本文中。适用于制备本文所述的放射性免疫缀合物的示例性螯合剂包括但不限于以下螯合剤，例如S-2-(4-异硫氰基苄基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸(p-SCN-&i-D0TA)； ニ乙烯三胺五乙酸(DTPA)；乙烯ニ胺四乙酸(EDTA) ；1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N，N'， N" ,N'“-四乙酸(DOTA) ;p-异硫氰基苄基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA) ； 1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N'，N"-三乙酸(DO 3A) ； 1，4，7， 10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四(2-丙酸)(DOTMA) ；3，6，9-三氮杂-12-氧杂-3，6，9-三羧基亚甲基-10-羧基-13-苯基-十三烷酸(〃 B-19036" ) ； 1，4，7-三氮杂环壬烷-N， N'，N"-三乙酸(NOTA) ;1，4，8，11-四氮杂环十四烷-队が，N" ,N'“-四乙酸(TETA)； 三乙烯四胺六乙酸(TTHA)；反式-1，2-己ニ胺四乙酸(CYDTA) ； 1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-(2-羟基丙基)4，7，10-三乙酸(HP-DO 3A)；反式-环己烷-ニ胺四乙酸(⑶TA)；反式-(1，2)-环己烷ニ乙烯三胺五乙酸(⑶TPA) ； 1-氧杂_4，7，10-三氮杂环十二烷-N，N'， N"-三乙酸(OTTA) ;1，4，7，10-四氮杂环十ニ烷-1，4，7，10-四{3-(4-羧基1)-丁酸} ；1， 4，7，10-四氮杂环十ニ烷-1，4，7，10-四(乙酸-甲基胺)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1， 4，7，10_四(亚甲基膦酸)；以及它们的衍生物。放射性核与缀合的靶向部分络合的放射性核可以得自任何合适的金属放射性同位素，包括但不限于锕-225，砹-211，碘-120，碘-123，碘-124，碘-125，碘-126，碘-131，碘-133， 铋-212，砷-72，溴-75，溴-76，溴-77，铜-110，铜-111，铜-113m，镓-67，镓-68，锶-83， 锆-89，钌-95，钌-97，钌-103，钌-105，汞-107，汞-203，铼-186，铼-188，碲 _121m， 碲-122m,碲-125m,铥-165，铥-167，铥-168，锝-94m,锝-99m,氟-18，银-111，钼-197， 钯-109，铜-62，铜-64，铜-67，磷-32，磷-33，钇-86，钇-90，钪-47，钐-153，镥-177， 铑-105，镨-142，镨-143，铽-161，钬-166，金-199，钴-57，钴-58，铬-51，铁-59，硒-75， 铊-201和镱-169。获得225Ac放射性核的方法对于本发明而言不是重要的。例如，可以在回旋 カロ速器中制备 225Ac。可以由 D 印 artment of Energy (DOE)，U. S. Α.，禾ロ Institute for Transuranium Elements (ITU), Karlsruhe, Germany 得到纯的 225Ac。纯化在某些实施方案中，本文所述的方法包含将缀合的靶向部分或放射性免疫缀合物与反应混合物的其他组分分离的ー个或多个步骤。在一个实施方案中，可以将混合物转移至具有特定的分子量阻隔的过滤装置(例如Millipore离心装置)中，使得反应混合物过滤通过过滤装置可以将缀合的靶向部分或放射性免疫缀合物与反应混合物的其他组分分离。在一个实施方案中，过滤反应混合物可以用于得到纯度为至少大约60%、至少大约 65%、至少大约70%、至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%或者至少大约99. 5%的缀合的靶向部分或放射性免疫缀合物。在多个实施方案中，缀合的靶向部分或者放射性免疫缀合物的产率为至少大约 70%、至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少95%、至少96%、 至少97 %、至少98 %或者至少99 %的终产物。靶向部分本文所述的靶向部分可以包含由免疫球蛋白质基因或者免疫球蛋白质基因的片段大部分或部分编码的ー种或多种多肽。所识别的免疫球蛋白质基因包含κ、λ、α、Y、 δ、ε和μ恒定区基因，以及大量的免疫球蛋白可变区基因。轻链可分为κ和λ。重链可分为Y、μ、α、δ或ε，其相应地分别定义了免疫球蛋白的种类IgG，IgM, IgA, IgD和 IgE0基本的免疫球蛋白(抗体)结构单元已知包含四聚体。每个四聚体由两对一致的多肽链构成，每对都具有ー个“轻”链(大约25kD)和ー个“重”链(大约50-70kD)。各个链的N末端定义了主要负责抗原识别的大约100至110或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(Vl)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。抗体可以以完整的免疫球蛋白质形式或者以通过使用多种肽酶消化而产生的大量良好表征的片段形式存在。具体而言，胃蛋白酶消化了铰链区中二硫键以下的抗体，从而产生F(ab)' 2，其为Fab的ニ聚体，其本身为通过ニ硫键与VH-CHl连接的轻链。F(ab)' 2 可以在温和的条件下还原，从而使铰链区中的ニ硫键断裂，由此将F(ab) ’ 2 ニ聚体转化为 Fab'単体。Fab'単体基本上为具有部分铰链区的Fab (对于多个抗体片段的术语，例如參见 Fundamental Immunology,W. Ε. Paul, ed. ,Raven Press,N. Y. (1993))。尽管根据完整抗体的消化定义了 Fab'结构域，但是本领域的技术人员将会理解的是此类Fab'片段可以以化学方式重新合成或者通过使用重组DNA方法合成。Fab'区可以衍生自动物(特別是小鼠或大鼠)或人类起源的抗体，或者可以为嵌合的(Morrison et al. , Proc Natl. Acad. ki. USA81，6851-6855 (1984))或人源化的 (Jones et al.，Nature 321，522-525 (1986)，以及 UK 专利申请公开 No. 8707252)。如本文所述，抗体可以包含或者衍生自任何哺乳动物，例如但不限于人类、小鼠、 兔、大鼠、啮齿动物、灵长动物或它们的任意組合，并且包含分离的人类、灵长动物、啮齿动物、哺乳动物、嵌合的、人源化的和/或互补性决定区(CDR)-接枝或CDR经修改的抗体，免疫球蛋白，它们的裂解产物、其他部分和变体。用于本发明的实施方案中的抗体可以以本领域公知的多种方法衍生得到。在 ー个方面中，可以使用本领域公知的任何杂交瘤技术得到抗体，例如參见Ausubel，et al. , ed. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, Inc. , NY, N. Y. (1987-2001) ；Sambrook, et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Edition,Cold Spring Harbor,N. Y. (1989) ；Harlow and Lane,Antibodies,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ；Colligan, et al., eds. , Current Protocolsin Immunology, John Wiley&Sons，Inc.，NY(1994-2001) ；Colligan et al.，Current Protocols in Protein Science, John Wiley&Sons，NY，N. Y. ， (1997—2001)。此外，所述的抗体还可以得自由此类结构域或成分的文库(例如噬菌体文库)的选择。可以通过插入随机寡核苷酸的文库或者包含所关注序列的多核苷酸的文库(例如得自免疫的动物或人类的B细胞(Smith, G. P. 1985. Science 228 :1315-1317))来创建噬菌体文库。抗体噬菌体文库在ー个噬菌体中包含重链(H)和轻链(L)可变区，从而可以表达单链 Fv 片段或 Fab 片段(Hoogenboom，et al. 2000, Immunol Today 21(8)371-8)。可以对噬菌粒文库的多祥性进行控制，从而增加和/或改变所述文库的单克隆抗体的免疫特异性，由此产生井随后确认额外的所需的人类单克隆抗体。例如，编码重链(H)和轻链(L) 免疫球蛋白分子的基因可以随机混合(shuffled)，从而在组装的免疫球蛋白分子中创建新的HL对。此外，在免疫球蛋白多肽的可变区的CDR中，编码H链和L链中的一者或二者的基因可以被诱变，井随后针对所需的亲和性和中和能力进行筛选。此外，还可以通过选择 ー个或多个人类框架序列并引入衍生自人类全套抗体的CDR盒的集合或者通过计划的改变来以合成方式创建抗体文库(Kretzschmar and von Ruden 2000，Current Opinion in Biotechnology, 13 :598-602)。多样性的位置不限于CDR，而且还可以包含可变区的框架节段或者可以包含不同于抗体可变区的那些，例如肽。可以包含不同于抗体可变区的其他靶向结合成分为核糖体展示、酵母菌展示和细菌展示。核糖体展示为将mRNA翻译成它们的同源蛋白质、同时保持所述蛋白质与RNA连接的方法。核酸编码序列通过 RT-PCR 回收(Mattheakis，L. C. et al. 1994. Proc Natl Acad Sci USA 91,9022) 0酵母菌展示是基于膜结合α -凝集素酵母粘附受体agal和aga2 (交配型系统的一部分)的融合蛋白质的构建(Broder，et al. 1997. Nature Biotechnology, 15 :553-7)。細菌展示是基于靶物与输出細菌蛋白质的融合，其中所述的输出細菌蛋白质与細胞膜或細胞壁结合(Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng，79 :496-503)。与杂交瘤技术相比，噬菌体及其他抗体展示方法提供了在体外针对抗原靶物的选择进行控制的机会，并且不会限制宿主对抗原的作用的可能性，反之亦然。抗体子序列的具体实例包含(例如)Fab，Fab ‘，(Fab ‘ )2,Fv,或单链抗体(SCA) 片段(例如scFv)。子序列保护眼保留了全长序列的至少一部分功能或活性的部分。例如， 抗体子序列可以保留于抗原选择性地结合的能力，即使与全长抗体的结合亲和性相比，子序列的结合亲和性可以更大或更小。Fv片段为包含以两条链表达的轻链VL可变区和重链VH可变区的片段。结合可以是非共价的或者可以是共价的，例如化学交联剂或分子内ニ硫键(Inbar et al.，(1972) Proc. Natl. Acad Sci. USA69 :2659 ；Sandhu (1992)Crit. Rev. Biotech. 12 :437)。单链抗体(“SCA〃)为经过基因工程改造或者经过酶消耗的抗体，其包含轻链VL 可变区和重链可变区，它们可任选地通过挠性连接体(例如多肽序列)以VL-连接体-VH 方向或者以VH-连接体-VL方向连接。备选地，单链Fv片段可以通过两个半胱氨酸残基之间的ニ硫键连接两个可变结构域来制备。用于制备scFv抗体的方法(例如)Whitlow et al. , (1991)在 Methods :A Companion to Methods in Enzymology 2 :97 中；美国专禾丨J No. 4，946，778 ；以及 Pack et al.，(1993) Bio/Technology 11 :1271 中所述。此外，还可以使用制备抗体子序列的其他方法，例如分离重链从而形成单价轻-重链片段，进ー步切割片段或者其他酶、化学或基因技木，前体条件是子序列与完整抗体所结合的抗原结合即可。在本发明中使用的抗体包括全长抗体、子序列(例如单链形式)、ニ聚体、三聚体、 四聚体、五聚体、六聚体或者保留至少一部分単体的抗原结合活性的任何其他较高级的寡聚体。多聚体可以包含本文所列以及本领域已知的经修饰或未经修饰的全长抗体、子序列的异源或同源組合。与単体相比，抗体多聚体可以用于増加抗原的亲和力，这是由于多聚体具有多个抗原结合位点。此外，抗体多聚体可以用于制备不同抗体的寡聚体(例如ニ聚体、 三聚体、四聚体等)的組合，因此产生多功能(例如双功能、三功能、四功能等)的抗体的组合物。抗体可以通过所选分子(其通过合成手段或者通过编码所述多肽的核酸进行表达来制备)的化学交联或者通过与多肽的体外或細胞表达以及随后的寡聚反应相结合的重组DNA技术来制备。可以通过重组技术以及制备具有不同抗原决定部位特异性的抗体的杂交瘤的表达、融合或者多种核酸(其在単一的細胞中编码了具有不同抗原决定部位特异性的抗体可变链)的表达来简单地制备抗体。抗体可以通过共价结合或非共价结合(例如通过多聚化结构域)直接或间接连接，从而制备多聚体。“多聚化结构域”调节了非共价蛋白质-蛋白质间的相互作用。具体实例包含卷曲螺旋(例如亮氨酸拉链结构)以及α-螺旋蛋白质序列。通过范德华力、氢键或电荷-电荷键调节蛋白质-蛋白质结合的序列也被考虑为多聚化结构域。其他的实例包含碱性螺旋-环-螺旋结构域以及调节核酸结合蛋白质(例如DNA结合转录因子，如TAF) 中异源或同源蛋白质-蛋白质间相互作用的其他蛋白质序列。多聚化结构域的ー个具体的实例为Ρ53残基319至360，其调节了四聚体的形成。另ー个实例为人类血小板因子4，其自组装形成四聚体。而另ー个实例为细胞外蛋白质TSP4，其为凝血酶致敏蛋白家族中的一员，可以形成五聚体。其他具体的实例为jurufos和酵母蛋白质GCN4的亮氨酸拉链。抗体可以通过化学交联剂彼此直接连接，或者可以通过连接体序列(例如肽序列)连接，从而形成多聚体。在一个实施方案中，本文所述的方法涉及特异性地结合CD33并包含至少人源化V 区的至少一部分的靶向部分。例如，所述的抗体可以包含本文所定义的VL区以及具有至少一个人源化的片段的VH区。药物组合物在本发明的实施过程中，可以给药放射性免疫缀合物本身，或者作为可药用的配制物的成分给药。如本文所用，“可药用的盐”是指式I所示化合物的任何的盐，所述的化合物完全是无毒的从而可用于治疗哺乳动物。由有机和无机来源通过标准反应形成的那些盐的代表包含(例如)硫酸、盐酸、磷酸、醋酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、富马酸、棕榈酸、胆酸、 十六酸、粘酸、谷氨酸、d-樟脑酸、戊ニ酸、乙醇酸、邻苯ニ甲酸、酒石酸、蚁酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、安息香酸、肉桂酸以及其他合适的酸。式I所示化合物的盐优选的是其中所述的盐为钾、钠、铵或它们的混合物。如本文所用，术语“治疗有效量”是指对治疗的疾病产生治疗效果的放射性免疫缀合物的量。治疗有效量将根据哺乳动物、放射性免疫缀合物以及给药方法(例如ロ服或肠胃外)而改变。本领域的普通技术人员可以确定放射性免疫缀合物的治疗有效量。药物组合物包含“可药用的，，和“生理学可接受的，，载体、稀释剂或赋形剂。如本文所用，术语“可药用的，，和“生理学可接受的，，包含与药物给药相容的溶剂(水性或非水性)、溶液、乳液、分散介质、涂料、等渗及吸收的促进或延迟试剂。此类配制物可以包含在液体中；乳液、悬浮液、糖浆或酏剂、或者固体形式中 ’片(包衣或未包衣的)、胶囊(硬或软)、 粉末、颗粒、晶体或微珠中。此外，还可以将补充活性化合物(例如防腐剤、抗细菌试剂、抗病毒试剂和抗真菌试剂)引入到所述的组合物中。可以将药物組合物配制成与特定的局部给药或者系统途径的给药相客。因此，药物組合物包含适用于特定给药途径的载体、稀释剂或赋形剂。用于本发明組合物的给药途径的具体的非限定性实例为吸入或鼻内传递。其他途径包含ロ服、经鼻、肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、ロ服、经皮(局部)以及经肌肉给药。可以根据标准的技术制备包含本文所述的放射性免疫缀合物的药物组合物，并且该组合物进ー步包含可药用的载体。通常，生理盐水可以用作可药用的载体。其他合适的载体包含(例如)水、缓冲的水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸等(包含用于增加稳定性的糖蛋白，例如清蛋白、脂蛋白、球蛋白等)。这些组合物可以通过常规的公知的灭菌技术来灭菌。 所得的水性溶液可以包装使用，或者在无菌条件下过滤并冷冻，经冷冻的制备物可以在给药之前与灭菌的水性溶液结合。所述的组合物可以包含接近生理学条件所需的可药用辅助物质，例如PH调节和缓冲试剂、张カ调节试剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。在所述的药物配制物中本文所述的放射性免疫缀合物的浓度可以大幅改变，即， 大约0. 05重量％至大约1重量％，大约1重量％至大约2重量％，大约2重量％至大约5 重量％，大约5重量％至大约10重量％，大约10重量％至大约30重量％，大约30重量％ 至大约50重量％，大约50重量％至大约75重量％，大约75重量％至大约99重量％。可以根据药物组合物的物理特征来选择药物組合物，其特征包含但不限于流体的体积、粘性以及符合所选的具体给药模式的其他參数。例如，可以增高浓度以便降低与治疗有关的流体承载。给药的放射性免疫缀合物的量取决于所用的具体的靶向部分、待治疗的疾病状态、 待传递的治疗试剂以及临床医生的判断。通常，给药的放射性免疫缀合物的量足以传递治疗有效剂量的具体的药理学试剂。用于各种药理学试剂的治疗有效剂量对于本领域的技术人员而言是公知的，并且对于上文所述的大量药物而言，给出了代表性的范围。典型的放射性免疫缀合物的剂量可以为大约0. 001至大约50mg/千克体重，或者大约0. 1至大约IOmg/ kg体重。此外，还可以在医生的判断下确定治疗有效剂量。放射性免疫缀合物药物组合物可以以肠胃外的方式给药，即，关节内、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、ロ服或经鼻。适用于所述用途的具体的配制物可以在Remington' s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company, Philadeipnia，Pa.，17th ed. (1985)中找到。所述的配制物可以包含悬浮在可接受的载体或水性载体中的放射性免疫缀合物的溶液。可以使用多种水性载体，例如水、缓冲的水、0.9%等渗盐水等。这些组合物可以通过传统的公知的灭菌技术灭菌，或者可以进行灭菌过滤。所得的水性溶液可以包装使用，或者被冷冻，经冷冻的制备物可以在给药之前与灭菌的水性溶液结合。所述的组合物可以包含接近生理学条件所需的可药用辅助物质，例如PH调节和缓冲试剂、张カ调节试剂、润湿剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇单月桂酸酷、三乙醇胺油酸酯等。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包含灭菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙ニ醇、甘油、聚丙三醇或其他合成溶剤；抗细菌试剂，例如苄基醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或重亚硫酸钠；螯合试剂，例如乙烯ニ胺四乙酸；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张カ的试剂，例如氯化钠或右旋葡萄糖。可以使用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。对于经粘膜或经皮给药而言，在所述的配制物中可以使用适用于待滲透的屏障的滲透剂。此类渗透剂是本领域公知的，并且对于经粘膜给药而言，包含(例如)洗涤剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻喷雾剂、吸入装置(例如吸气器)或栓剂来完成。对于经皮给药而言，所述的活性化合物可以被配制成本领域公知的软膏、油膏、 凝胶或乳膏。在本发明的方法中，适用于给药组合物的其他药物配制物是本领域已知的(例如参见 Remington' s Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed.，Mack Publishing Co., Easton，Pa. ；The Merck Index(1996) 12th ed.，Merck Publishing Group，Whitehouse, N. J.；禾ロ Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster, Pa.，(1993)) 0所述的药物組合物可以以剂量単位形式包装以用于容易地给药以及剂量的一致。 如本文所用，“剂量单位形式”是指适合作为待治疗的受试对象使用的单ー剂量的物理分离単位；每个単位都包含预定量的活性化合物，经计算所述的量能够产生与药物载体或赋形剂有关的所需的治疗作用。试剂盒此外，本发明还提供了包含根据本文所述的方法制备的放射性免疫缀合物的试剂盒。在所述的试剂盒中放射性免疫缀合物的靶向部分在自然界中可以为单克隆的或多克隆的。所述试剂盒的靶向部分的一个或两个臂可以是嵌合的、人类的、人源化的或免疫原性去除的(deimmunized)。此外，通过本申请提供的试剂盒还可以包含由所述的组织中清除未结合的放射性免疫缀合物的清除組合物。一种合适的清除试剂为糖基化的杭-独特型Fab'片段，其靶向针对放射性免疫缀合物的靶向部分的疾病靶向臂。在该实施方案中，给予放射性免疫缀合物并使其在靶物中最大程度地共生。为了清除残留的放射性免疫缀合物，靶物Ab的杭-独特性Ab以糖基化的Fab'片段形式给予。清除试剂以单价方式与放射性免疫缀合物结合， 同时它所附着的羰基残基使完整的络合物定向于肝脏，在此进行快速的代谢。清除试剂在美国系列No. 09/314，135和09/337，756中有更详细地描述。以下实施例说明了本发明，并列出以帮助理解本发明，并且不应该以任何方式解释为限定了本发明的范围，本发明的范围如所附的权利要求书所定义。
实施例实施例1 系统命名法及定义P-SCN-Bn-DOTA :S-2-(4-异硫氰基苄基)1，4，7，10四氮杂环十二烷四乙酸(Macrocyciics, Dallas, ΓΧ)BFC:双功能螯合试剂DOTA-BFC =DOTA 双功能螯合试剂例如 NHS-DOTA ；p-SCN-Bn-DOTANa(NH4)Ac 醋酸铵钠mAb 单克隆抗体HuM-195HuM-195 用于治疗髓性白血病的抗-⑶33抗体。HuM_195为将鼠科M-195的CDR 区与人类框架/恒定区结合的重组IgGlmAb。SEC:体积排阻色谱HPLC 高效液相色谱SE-HPLC/UV 与 UV 检测器偶联的 SE-HPLCSE-HPLC/rad.与放射活性检测器偶联的SE-HPLCITLC 瞬时薄层色谱NH4CH3CO2 醋酸铵，NH4AcNaCH3CO2 醋酸钠，NaAcDf:稀释因子CHCA -氰基-4-羟基肉桂酸MALDI 基质辅助激光解吸/电离质谱HDPE 高密度聚乙烯HEPES :N_2-羟基乙基哌嗪-N-2-乙磺酸实施例2 :HuM195 与 p-SCN-Bn-DOTA 的缀合2. 3. 1材料和化学品。參见表2的说明。2. 3. 2化学品的制备以及用于缀合反应的条件。2. 3. 2. 1预先制备以下溶液天然HuM195，5mg/mL，储存在 4-8"C。p-SCN-Bn-DOTA,储存在 _20°C。NaCLOJ1^=-OjSg NaCl，并将其溶解于不含金属的水中，然后使体积达到 50mL。混合所述溶液并在均化后使其过滤通过0.45 μ m醋酸纤维素薄膜过滤器。将所述的溶液保持在50mL-HDPE容器中。0. 2M磷酸ニ氢钠(溶液A)称0. 48g NaH2PO4,并将其加入到20mL蒸馏H2O中。混合所述的溶液直到完全溶解。0. 2M磷酸ー氢钠(溶液B)称2. 83g NaHPO4,并将其加入到IOOmL蒸馏H2O中。0. IM磷酸盐缓冲剂，pH = 8 将5. 3mL溶液A与94. 7mL溶液B结合并混合。为了测试PH，使用pH试纸。通过加入等体积的蒸馏H2O(IOOmL)来稀释缓冲剂。使所述的溶液过滤通过0. 45 μ m醋酸纤维素薄膜过滤器。将所述的溶液保持在50mL-HDPE容器中。2M NaOH:取得大约5mL 30%的NaOH，并将其与不含金属的水混合，使溶液冷却， 然后使体积达到25mL。将所述的溶液保持在50mL-FEP容器中。4M NaOH 向50ml HDPE容器中加入50ml不含金属的水以及8. OgNaOH,并搅拌至
完全溶解。3M NH4Ac (或NaAc)称6. 15g NaAc，并将其溶解于不含金属的水中。在所述的盐溶解之后，使体积达到25mL。混合所述溶液并在均化后使其过滤通过0. 45 μ m醋酸纤维素薄膜过滤器。将所述的溶液保持在25mL-HDPE容器中。0. 25M NH4Ac (或NaAc)取得2. ImL 3M NaAc，并将其与不含金属的水混合，使体积达到25mL。混合所述溶液并在均化后使其过滤通过0. 45 μ m醋酸纤维素薄膜过滤器。将所述的溶液保持在25mL-HDPE容器中。0. IM NH4Ac (NaCH3CO2)，pH 7。取得 3. 3mL 3M NaAc,并将其与不含金属的水混合， 使体积达到100mL。将所述的溶液保持在IOOmL-HDPE容器中。0. IM HCl 取得2. 5mL IOM HCl，并将其与不含金属的水在25mLPE容量瓶中混合。 等候直至溶液冷却，并使体积达到25mL。混合所述溶液并在均化后使其过滤通过0. 45c醋酸纤维素薄膜过滤器。将所述的溶液保持在25mL-HDPE容器中。0. 05M HCl:取得1.25mL IOM HC1，并将其与不含金属的水在25mLPE容量瓶中混合。等候直至溶液冷却，并使体积达到25mL。混合所述溶液并在均化后使其过滤通过 0. 45 μ m醋酸纤维素薄膜过滤器。将所述的溶液保持在25mL-HDPE容器中。NaN3O. 05% 称0. 5g NaN3，并将其溶解于Millipore水中。使体积达到1し1. OM NaHCO30向50ml HDPE容器中加入50. OmL不含金属的水以及8. 4g NaHCO3, 并搅拌至完全溶解。(这产生了 2M NaHCO3溶液)。将17. 8mL 4M NaOH溶液和50mL 2M NaHCO3溶液在Coning Costar 250mL储存瓶中混合(或者是当量的)。混合良好。备选地1. OM NaHCO3 向 IOOmL HDPE 容器中加入 50. OmL 不含金属的水以及 8. 4g NaHCO3, 并与17.8mL 4M NaOH溶液混合。搅拌直至完全溶解，并使体积达到100mL。将所述的溶液保持在Coning Costar 250mL储存瓶中混合(或者是当量的)。混合良好。0. IM HEPES 溶液。将 3. OmL IM HEPES 缓冲剂(Fisher BioReagents，产品号 BP299-500)放置在50ml HDPE瓶中，并加入27ml水用于注射。2. 3. 2. 2 材料表2 用于缀合的化学品和材料的列表
化学品/材料订单名说明/組成供应甸HCl, 30 S1. 00318.1000超純的VWRNaOH, 30 %1. 05589.0250超純的VWR醋酸Na1. 062640050> 99. WkVWR醋酸NH4372331=10 04030KH> 99.999*Sigma Aldrich冰醋酸，100%100264 1000660250超純的VWDOTA =NHS =酯B—280Macro cyclics,
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权利要求
1.一种用于制备锕-225(Ac-220放射性缀合物的方法，该方法包括以下步骤(a)在缀合反应混合物中，使螯合试剂与生物分子缀合，从而制备缀合的生物分子，(b)纯化所述的反应混合物以便除去未缀合的螯合试剂，以及(c)在螯合反应混合物中，使ー个或多个Ac-225放射性核与所述的缀合的生物分子螯合，从而制备Ac-225放射性缀合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的在步骤(a)中的缀合包括在大约37°C下将所述的缀合反应混合物温育大约1. 5小吋。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的在步骤(a)中的缀合包括在大约16°C至大约 20°C下将所述的缀合反应混合物温育大约M小吋。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的纯化包括使所述的缀合反应混合物通过过滤器过滤以便纯化所述的缀合的生物分子。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的缀合反应混合物包含碳酸氢盐缓冲剂。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的缀合反应混合物包含磷酸盐缓冲剂。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的缀合反应混合物的pH为大约8.0至大约9. 2。
8.权利要求1所述的方法，其中所述的过滤是在HEPES缓冲剂中进行的。
9.权利要求1所述的方法，其中所述的过滤是在NaAc缓冲剂中进行的。
10.权利要求1所述的方法，其中所述的过滤包括分子量阻隔为至少大约10，OOODa、至少大约20，OOODa或者至少大约40，OOODa0
11.权利要求1所述的方法，其中所述的螯合反应混合物包含龙胆酸或抗坏血酸。
12.权利要求1所述的方法，其中所述的螯合反应混合物的pH为大约5.5至大约7. 0。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的在步骤(c)中的螯合包括在大约37°C下将所述的ー个或多个Ac-225放射性核与所述的缀合的生物分子温育大约1. 5小吋。
14.权利要求1所述的方法，进ー步包括将终止螯合剂加入到所述的螯合反应混合物中的步骤。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的终止螯合剂为ニ乙烯三胺五乙酸(DTPA)。
16.权利要求14所述的方法，进ー步包括在加入所述的终止螯合剂的步骤之后在大约 37°C下将所述的螯合反应混合物温育大约30分钟的步骤。
17.权利要求1所述的方法，其中所述的生物分子包含蛋白质、肽、多核苷酸、它们的组合或者衍生物。
18.权利要求1所述的方法，其中所述的生物分子为抗体、抗体的抗原结合片段、包含抗体的抗原结合多肽序列的单链蛋白质、单结构域抗体、之前所述的任何一种物质的类似物或者之前所述的任何ー种物质的衍生物。
19.权利要求18所述的方法，其中所述的抗原结合片段为单克隆抗体的可变区。
20.权利要求1所述的方法，其中所述的生物分子为包含抗体的抗原结合序列的蛋白质。
21.权利要求1所述的方法，其中所述的生物分子为天然、合成或重组产生的蛋白质， 该蛋白质包含与細胞的表面上的抗原结合的抗体的抗原结合序列。
22.权利要求21所述的方法，其中所述的靶向細胞的表面上的抗原为CD-33。
23.权利要求1所述的方法，其中所述的生物分子为HuM195。
24.权利要求1所述的方法，其中所述的放射性缀合物为放射性免疫缀合物。
25.权利要求1所述的方法，其中所述的螯合试剂为双功能螯合试剂。
26.权利要求25所述的方法，其中所述的双功能螯合试剂为S-2-(4-异硫氰基苄基)-1，4，7，10四氮杂环十二烷四乙酸(p-SCN-Bn-DOTA)。
27.权利要求1所述的方法，其中所述的螯合试剂选自二乙烯三胺五乙酸 (“DTPA“ ) ;1，4，7，10-四氮杂环十ニ烷-队が，N" ,N'“-四乙酸(〃 DOTA“ ) ；ρ-异硫氰基苄基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(〃 pSCN-Bz-DOTA" ) ；1，4，7， 10-四氮杂环十二烷-N，N'，N"-三乙酸(〃 DO 3A" ) ； 1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4， 7，10-四(2-丙酸)(“DOTMA “ ) ;3，6，9-三氮杂-12-氧杂-3，6，9-三羧基亚甲基-10-羧基-13-苯基-十三-烷酸(〃 B-19036" ) ;1，4，7_三氮杂环壬烷-N，N'，N"-三乙酸 (“ΝΟΤΑ" ) ；1，4，8，11-四氮杂环十四烷-Ν，Ν'，N"，N'“-四乙酸(〃 TETA“ ) ’三乙烯四胺六乙酸(〃 TTHA “)；反式-1，2_己ニ胺四乙酸(〃 CYDTA “ ) ； 1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-(2-羟基丙基)4，7，10_三乙酸(〃 HP-D03A")；反式-环己烷-ニ胺四乙酸 (“CDTA“)；反式-(1，2)_环己烷ニ乙烯三胺五乙酸(〃 CDTPA“ ) ； 1_氧杂_4，7，10-三氮杂环十二烷-N，N'，N"-三乙酸(〃 OTTA“ ) ;1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四 {3-(4-羧基1)-丁酸} ；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四(乙酸-甲基胺)；1， 4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四(亚甲基膦酸)；2，2'，2〃 -(10バ2_(2，5-ニ氧代吡咯烷基-1-基氧基)-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸 (D0TA-NHS酷)以及它们的衍生物、类似物或混合物。
28.ー种用于制备[Ac-225]-p-SCN-Bn-D0TA/HuM195放射性免疫缀合物的方法，该方法包括以下步骤(a)在大约37°C下，在包含碳酸氢盐缓冲剂以及pH为大约8.0至大约9. 2的缀合反应混合物中，使p-SCN-Bn-DOTA与HuM195抗体缀合大约1. 5小时，从而制备p-SCN-Bn-DOTA/ HuM195免疫缀合物，(b)使所述的缀合反应混合物通过分子量阻隔为至少大约10，000Da、至少大约 20，OOODa或者至少大约40，OOODa的过滤器过滤，以便纯化所述的p-SCN-Bn_D0TA/HuM195 免疫缀合物，其中所述的过滤是使用HEPES缓冲剂或NaAc缓冲剂进行的，(c)在大约37°C下，在包含龙胆酸以及pH为大约5.5至大约7. 0的螯合反应混合物中， 使ー个或多个锕-225放射性核与所述的p-SCN-Bn-D0TA/HuM195免疫缀合物螯合大约1. 5 小时，从而制备[Ac-225]-p-SCN-Bn-D0TA/HuM195放射性免疫缀合物，(d)将DTPA加入到所述的螯合反应混合物中，以及(e)在大约37°C下将所述的螯合反应混合物温育大约30分钟。
29.权利要求1或权利要求观所述的方法，进ー步包括在所述的步骤(b)的过滤之前通过体积排阻树脂的体积排阻色谱的步骤。
30.权利要求四所述的方法，其中所述的体积排阻树脂的体积排阻极限为大约 5000Dao
31.权利要求1所述的方法，进ー步包括通过尺寸排阻树脂的体积排阻色谱来纯化所述的放射性缀合物。
32.权利要求28所述的方法，进ー步包括通过体积排阻树脂的体积排阻色谱纯化所述的[Ac-225]-p-SCN-Bn-D0TA/HuM195 放射性免疫缀合物。
33.权利要求31或32所述的方法，其中所述的体积排阻树脂的体积排阻极限为大约 6000Dao
34.权利要求31或32所述的方法，其中所述的体积排阻树脂的体积排阻极限为大约 5000Dao
35.通过权利要求1或权利要求观所述的方法制备的Ac-225放射性免疫缀合物。
全文摘要
本发明公开制备包含单克隆抗体(mAb)(IgG)的放射性缀合物的方法。所述的Ac-225放射性免疫缀合物为[Ac-225]-p-SCN-Bn-DOTAIHuM195放射性免疫缀合物。
文档编号A61K51/00GK102596258SQ201080036704
公开日2012年7月18日 申请日期2010年7月22日 优先权日2009年7月22日
发明者A·G·金, J·M·莫兰诺贝穆德斯, J·西蒙 申请人:锕医药股份有限公司