离子取代的磷酸钙颗粒的制作方法

专利名称：离子取代的磷酸钙颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制造离子取代的磷酸钙纳米颗粒、特别是具有形态和结构可控的磷酸钙纳米颗粒的方法。本发明还涉及用于医学应用的此类材料组合物。
背景技术：
磷酸钙(CaP)和特别地羟基磷灰石(Caltl(PO4)6(OH)2, HA)由于其与骨和牙齿的矿物组分的相似性及其生物相容性而作为广泛用于医学应用的矿物质。此外，羟基磷灰石为无毒性、生物相容性和生物活性的。这就意味着羟基磷灰石是无害的并且不会被识别为异物，另一方面其可对骨再造具有积极作用。因此，羟基磷灰石已被广泛用于骨修复并作为药物/基因运载载体、催化剂、离子吸附/交换齐U、光电试剂等。对于许多应用如骨空隙(void)填充物、药物运载载体、牙本质小管(dentin tubuli)的脱敏等,可吸收(resorbable)的纳米颗粒(即，可在体内溶解的颗粒)具有特殊影响。骨中的羟基磷灰石为多取代的磷酸钙，包括痕量CO广、F_、Cl'Mg2+、Sr2+、Si4+、Zn2+、Ba2+、Fe3+等。这些离子取代担负骨形成和正常功能如材料的溶解性、晶体结构和表面化学的重要作用。氟化物(fluoride)存在于脊椎动物体的骨骼和牙齿中。据报道，氟化物对于OH位的取代和氟取代(fluoride-substituted)的轻基磷灰石的形成增强了轻基磷灰石生物陶瓷的耐酸性和机械性能(Gross等人，Biomaterials 2004 ；25 :1375-1384),并诱导更好的生物应答(Robinson 等人，Crit Rev Oral Biol Med 2000 ；11 :481-495)。已发现硅对正常的骨和软骨的生长和发育是必需的。与化学计量磷酸钙相比，在其结构中包括痕量水平Si的合成磷酸钙显示显著增加的生物学性能(Pietak等人，Biomaterials 2007 ；28 =4023-4032)。生物学性能的改进可归因于材料性质中Si诱导的改变以及归因于在骨和结缔组织系统的生理过程中Si的直接影响。通过增加材料的溶解性、产生更多负电性表面以及产生更精细的微结构来将材料表面转化为生物学相当的磷酸钙，Si的取代促进生物学活性。Si复合体释放到细胞外基质和Si在材料表面的存在可诱导对在骨和软骨组织系统的细胞的另外的剂量依赖性刺激效应。由于锶在化学和物理上与钙密切相关，所以易于将其引入作为磷酸钙中钙的天然取代。已证明锶具有增加骨形成和减少骨吸收的效果，导致在正常动物和人类中骨质增加和骨的机械性改进。Sr取代的羟基磷灰石陶瓷已显示比纯羟基磷灰石更好的机械性，以及增强体外研究中成骨细胞的增殖和分化(Landi等人，Acta Biomaterials 2007 ；
3:961-969)。锶离子的积极作用被用于药物，应用于骨质疏松症人群的所谓的雷奈酸锶(strontium ranelate)。生产纯CaP颗粒、球形颗粒和输送材料的方法已在现有技术中描述，并包括以下所记载的湿法化学沉淀、溶胶凝胶法或水热合成法例如US 5858318、US 7326464、US5702677 和 HuiGang Zhang, Qingshan Zhu, Yong Wang, Chem. Mater.2005,17,5824-5830。在其他方法中，磷酸I丐的合成模仿生物矿化,其为天然自组装(self-assembly)过程，通过该过程在生物体中形成该种矿物质。此外，来自溶液的具有特定形态和结构的矿物质纳米材料的合成，由于其独特的物理、化学和生物性质和在高级功能材料中的潜在应用而吸引更多的注意。目前，模仿生物矿化过程的具有如球形、纤维和棒状的不同形态、核-壳结构和中孔结构的矿物质纳米材料的合成集中于使用表面活性剂和生物分子的自组装(Xu等人，JMater Chem2007 ；17 :415-449)。例如，磷酸钙的成核和生长受控于某些特定的表面活性剂或生物分子，该表面活性剂或生物分子指导生长的纳米材料的生长并因而控制生长的纳米材料的形态。在无表面活性剂的情况下，所述形态固有地受控于优先在在溶液中具有最低表面张力的特定晶面上生长的晶体。例如，在过饱和溶液中(通常包括钙和磷酸根离子)磷酸钙自发地生长成沿晶体的c轴定向的鳞片(flake)或纤维/棒。并不是所有的形态都便于用作运载颗粒、催化剂支持体、离子吸 附/交换剂等，直到现在已研究了例如棒、管、片或球状纳米颗粒时为止。举例来说，为了使药物运载过程有效，高表面积和多孔结构对于吸附尽可能多的活性物质是有利的，并且当然也存在生物相容性和载体与物质间的结合的需要。制备CaP颗粒的一个问题是控制颗粒的粒度分布和形状。通常粒度分布很广，并由CaP的六角对称和晶格参数所引起。最可能产生沿c轴的定向并由此产生针状形状(pin-like shape)。

发明内容
鉴于前述，本发明的一个目的为提供形态可控的纳米至微米范围内的磷酸钙(CaP)颗粒，并且其不使用表面活性剂或模板。因此，如在独立权利要求中所定义的，本发明提供经由无表面活性剂的生物矿化过程制造形态和结构可控的离子取代的CaP颗粒的方法、CaP颗粒及其在生物医药应用和作为药物载体的用途。在根据本发明的方法中，在无表面活性剂的仿生过程中制备形态和形态可控的CaP颗粒。对于根据本发明的形态和形态可控的CaP颗粒的制备，旨在使用含类似于它们天然存在的组合物的前体，并且不使用未用于天然过程中的并且也不应包括在产物中的化学制品，即，在本发明的制造方法中，表面活性剂不必用于颗粒合成。在现有技术方法中，使用有机表面活性剂或模板如尿素、胶原蛋白、单糖或Na2EDTA来通过限定的反应空间实现球形结构。生产中，表面活性剂的使用引起许多步骤和另外的步骤，例如热处理，对于从CaP中除去有机组分可能是必要的。此外，体内使用时残基可能引起问题。本发明的一个优势为由于仿生制造方法，这些另外的步骤是不必要的，从而简化了该过程。此外，使用离子取代来控制形态的一个优势为使通过表面活性剂控制过程不能易于形成其他形状和多孔性成为可能。在本发明的方法中用矿化和沉淀法来合成颗粒，所述方法包括制备盐溶液和从盐溶液中沉淀CaP颗粒的基本步骤。更详细地，所述方法包括以下步骤-提供水溶液，其包括钙离子、钠离子、钾离子、氯离子、和/或磷酸根离子中的一种或多种，-所述溶液具有2.0至10.0范围内的初始pH、优选6.0和8.0之间的pH，以及20°C至150°C的温度，-所述溶液进一步包括镁、锶、硅、氟、钡、铁和锌、碳酸根离子和硫酸根离子或其组合中的一种或多种，和-提供在足以形成期望的纳米颗粒的时间中以静态工艺、搅拌工艺和/或水热工艺的形式的自组装过程。
在本发明的优选实施方案中，所述溶液包括钙和磷酸根离子以及镁、钠、钾、氯、碳酸根或硫酸根离子的一种或多种，并且其中所述离子的浓度为钙离子的浓度可在0. 01 X IO^3M至25 X KT3M的范围，镁离子的浓度可在0.01 X KT3M至15X1(T3M的范围，钠离子的浓度可在0.01 X KT3M至1420 X KT3M的范围，钾离子的浓度可在0.01 X KT3M至1420 X KT3M的范围，氯离子的浓度可在0.01 X KT3M至1030 X KT3M的范围，磷酸根离子的浓度可在0.01 X KT3M至IOX KT3M的范围，碳酸根离子的浓度可在0. 01 X IO^3M至270 X KT3M的范围，硫酸根离子的浓度可在0. 01 X IO^3M至5 X KT3M的范围，取代离子的浓度可为Sr2+在0. OlX KT3M至I. 0 X KT3M的范围、Si4+在0. OlXKT3M至IOXKT3M的范围和r在0. 01 X IO-3M至0. 5 X KT3M的范围。在一个实施方案中，制造方法利用包括至少钙离子和取代离子，例如Sr2+、Si4+、F_、Mg2+、Zn2+、Ba2+或Fe3+或其组合的过饱和磷酸盐缓冲溶液。在缓冲溶液中发生无表面活性剂的自组装过程，并可通过温度、pH、组合物和离子浓度控制动态形成率。自组织过程(self-organized process)可为静态工艺、搅拌工艺和水热工艺。形成时间典型地在Ih至4周以内，例如大于2小时或大于5小时或大于10小时或大于I天，但小于4周或小于2周或小于I周，但更长或更短的形成时间也可形成颗粒。在本发明的一个实施方案中，至少一种取代离子为Sr2+。在本发明的另一实施方案中，至少一种取代离子为Mg2+。在本发明的另一实施方案中，至少一种取代离子为Si4+。在本发明的另一实施方案中，至少一种取代离子为F_。在本发明的另一实施方案中，至少两种取代离子为Sr2+和Mg2+。在本发明的另一实施方案中，至少两种取代离子为Sr2+和F_。在本发明的另一实施方案中，至少两种取代离子为Mg2+和F_。在另一实施方案中，溶液的温度为30°C至70°C。在另一实施方案中，在所形成的颗粒中，镁浓度为0至10重量％之间，例如大于1%或大于3%或大于5%或10%或小于8%或小于5%。在一个实施方案中，所述方法包括在溶液中生长和自组装颗粒的步骤，从而由于在所述溶液中取代离子的浓度的调整而形成具中空核和致密壳、或中空核和多孔壳、或多孔核和致密壳或颗粒为多孔的离子取代的颗粒。还在另一实施方案中，离子取代的颗粒为球形。
还在另一实施方案中，溶液中的Sr2+的浓度为小于0. 15mM，优选约0. 06mM，从而形成直径约I U m的无规球形多孔Sr取代的纳米颗粒。还在另一实施方案中，溶液中的Sr2+的浓度大于0. 06mM并小于0. 3mM，优选约0. 15mM,从而形成直径100至300nm的球形多孔Sr取代的纳米颗粒,各纳米颗粒具有中空核和多孔壳。还在另一实施方案中，溶液中的Sr2+的浓度大于0. 15mM并小于0. 6mM，优选约0. 3mM,从而形成直径200至500nm的规则球形Sr取代的纳米颗粒,各纳米颗粒具有中空核和多孔壳。还在另一实施方案中，溶液中的Sr2+的浓度大于0. 3mM并小于0. 67mM，优选约0. 6mM,从而形成直径100至500nm的Sr取代的球形纳米颗粒,各纳米颗粒具有致密壳和多 孔核。还在另一实施方案中，Sr2+的浓度为0. 01至0. 7mM，例如0. 01或大于0. 05或大于0. I或大于0. 3或0. 7以下或小于0. 5mM ;和Mg2+的浓度为0. I至0. 5mM，例如0. I或大于0. 2或大于0. 3或0. 5或小于0. 4mM。还在另一实施方案中，溶液中的F_的浓度约0. 04至0. 2mM，从而形成直径300至500nm的球形多孔的F取代的纳米颗粒。还在另一实施方案中，Si4+的浓度约6mM，从而形成200至500nm大小的多孔的Si取代的纳米颗粒。在本发明的第一方面，提供形态可控的颗粒，如中空或多孔CaP颗粒或其组合。例如，所述颗粒可具有中空核和致密壳，或中空核和多孔壳，或多孔核和致密壳，或者所述颗粒为多孔的。本发明的CaP颗粒的形态可通过调整取代离子在生长溶液中的浓度来控制。本发明的球形颗粒的直径优选10至IOOOnm,例如大于30nm或大于50nm或大于IOOnm但小于IOOOnm或小于500nm或小于300nm。所形成的颗粒不是离子取代的CaP的单晶体，而是由离子取代的CaP的几个较小单元、完全或部分或非晶体组成。颗粒的最小单元可以是例如共同形成为较大颗粒的鳞片状纳米颗粒和针状纳米颗粒。在一个实施方案中，在例如超过30°C或超过50°C或超过100°C来加热处理形成的颗粒。在另一实施方案中，在所形成的颗粒中的锶浓度为0至35重量％之间，例如大于5或大于15%或大于25%或35%或小于30%或小于20%或小于10%。还在另一实施方案中,颗粒为中空的(hollow)和/或多孔的(porous)。还在另一实施方案中，颗粒具有含致密壳的多孔核。在另一实施方案中，颗粒包括作为取代离子的51~2+、514+和？_中的一种或多种。利用各种各样的设计来控制使用根据本发明的方法制备的颗粒的形态。可形成直径IOOnm至I ii m的固体、多孔、中空或绳状(rope-like)结构的球体。除银以外，单独或组合的镁、氟(fluor)、硅和液态前体(缓冲溶液)可强烈地影响形态。在本发明的一个实施方案中，提供多孔和/或中空、锶掺杂的球形磷酸钙颗粒。在另一实施方案中，提供氟和/或硅掺杂的球形磷酸钙颗粒。在本发明的第二方面，提供用于在人类或模拟躯体环境中控制从所制备的颗粒的离子释放(如锶释放)的颗粒。
通过使用根据本发明的颗粒的锶释放研究，显示出离子释放量对pH值的依赖性。发现浸液的PH值从8. 0降至6. 8使锶释放量加倍，在不改变溶液的情况下，在13天后释放了总计为20%的引入的锶。此外，浸液中无机离子的存在使溶液中的锶含量降低，分别诱导颗粒上的CaP的结晶作用,这显示出颗粒为生物活性的(Hench L L. J Am Ceram Soc 1991 ；74 :1487-1510)。该性质对于再矿化性质具有重要意义的应用如牙科和矫形应用特别重要。由于可通过将生物相容的、生物可降解的、人工制备的离子取代的CaP嵌入躯体中来刺激例如受损骨骼的再生，并因而增大骨的强度，所以CaP形成形态可控的非化学计量晶体的能力能够使材料适用于特定应用。然而不限定于此，可用本发明产生的广泛范围的颗粒形态和组成开启了多种应用-具有持续和控释行为的药物运载。药物的非限制性实例包括抗生素、抗炎剂、蛋白质、癌症治疗剂和用于治疗疼痛的药物。可使用任何本领域技术人员已知的方法进行载药。非限制性实例包括颗粒制造期间的浸透和装载或二者的组合。例如，本发明的CaP颗粒可通过具有大表面积和多孔结构使有效的药物运载成为可能，其能够在满足生物相容性 和载体与物质之间的强烈结合的需求的同时吸附大量活性物质。-颗粒可用于骨修复和再生。可使用本领域技术人员已知的方法将颗粒运载至骨缺损处。两个非限制性实例包括在血浆中浸透颗粒并将其添加至缺损处，或者使用载体液体或凝胶经注射器运载颗粒。所述凝胶可为多糖如透明质酸或壳聚糖或其任意衍生物。其他实例包括甘油、聚乙二醇或其他水混溶性液体。此外，可将颗粒添加到可注射的自硬化材料系统，其非限制性实例包括可注射的生物陶瓷(磷酸钙水泥(cement)、硫酸钙水泥和娃酸I丐水泥等)，以及添加到非可吸收(non resorbable)的可注射聚合物如聚丙烯酸甲酯(poly-methy 1-meta-acrylate, PMMA)。为了进一步改进再生，颗粒和/或液体或凝胶可另外包括生物学物质如生长因子。-颗粒可用于牙齿修复和再生。可使用本领域技术人员已知的方法将颗粒运载至骨缺损处。两个非限制性实例包括在血浆中浸透颗粒并将其添加至缺损处，或者使用载体液体或凝胶经注射器运载颗粒。所述凝胶可为多糖如透明质酸或壳聚糖或其任意衍生物。其他实例包括甘油、聚乙二醇或其他水混溶性液体。此外，可将颗粒添加到可注射的自硬化材料系统，其非限制性实例包括可注射的生物陶瓷(磷酸钙水泥、硫酸钙水泥和硅酸钙水泥等)，以及添加到非可吸收的可注射聚合物如聚丙烯酸甲酯(PMMA)。为了进一步改进再生，颗粒和/或液体或凝胶可另外包括生物学物质如生长因子。-牙科微创和预防性治疗如清洁、抛光、增白、漂白和喷砂牙齿(blastingteeth),嵌缝添料(sealant)，龋洞(cavity)预防，牙齿保存及修复，以及改善漂白后牙釉质的表面。-使用载体凝胶或液体用于牙周炎的治疗，或作为龋洞修复(cavityrestoration)或作为频洞填充修复的一部分。-用于种植体周围炎(peri-implantatis)的治疗(填充并再生由于种植体周围炎形成的牙种植体周围的骨空隙)。此处，CaP颗粒可使用可注射制剂用运载机制运载至位点，或与血液等混合并包装进缺损中。-用于治疗敏感牙根的牙膏中的填料颗粒,为了使开口小管(opentubulis)脱敏和治疗早期龋齿。优选地使用球形CaP颗粒，甚至更优选包含F离子的球形CaP颗粒。
-重金属离子的吸附剂。基因、生长因子、对照物、放射性标记颗粒或物质或药物的运载。-牙本质小管的脱敏。中空和/或多孔颗粒适用于填充开口牙本质小管。-用于治疗牙釉质的洁牙带(dentaltape)、洁齿漂白带或膏。-牙膏、洗口液(mouthwater) 、漱口水、口气清新剂、牙科用乳霜(tooth cream)、漂白和增白膏。-食品补充剂和口香糖。对于口香糖，添加大约10重量％以下的CaP颗粒以实现再矿化性质。本发明的颗粒可与其他材料组合以改进例如可注射生物材料中的填料颗粒的性质。非限制性实例包括PMMA骨水泥、生物陶瓷(如，磷酸钙、硫酸钙)、玻璃离聚物水泥。对于药物运载，本发明的上述第一和第二方面分别产生使颗粒形态适应于能够在颗粒的孔(pores)或空腔(hollows)中装载药物的第一方法,和包括控制离子释放的第二方法。在第一方法中，药物可在生长后和/或生长期间装载。类似于图9的F取代的颗粒，图10的Si取代的颗粒的表面相对粗糙并包括从表面突出的鳞片。然而，F取代的颗粒具有更规则的球形形状。这两种取代颗粒将适用于药物运载、基因运载、蛋白质吸附和色谱柱中的填料材料。在独立的权利要求中定义本发明的实施方案。当与附图和权利要求一起考虑时，本发明的其他目的、优势和新特征从本发明的以下详细描述中将变得明显。


现在将参考附图描述本发明的优选实施方案，其中图I说明在60°C下使用0. 06mM Sr掺杂的PBS处理I周后的SrCaP的形态，图2说明在60°C下使用0. 15mM Sr掺杂的PBS处理I周后的SrCaP的形态，图3说明在60°C下使用0. 3mM Sr掺杂的PBS处理I周后的SrCaP的形态。图中的箭头说明中空颗粒。图4说明在60°C下使用0. 6mM Sr掺杂的PBS处理I周后的SrCaP的形态，图5说明在60°C下使用0. 6mM Sr掺杂的PBS处理2周后的SrCaP的形态，图6说明通过在60°C下使用0. 6mM Sr掺杂的PBS处理I周所获得的SrCaP颗粒的TEM图像，图7说明在60°C下使用0. 6mM Sr掺杂的PBS搅拌I天后的SrCaP的形态，图8说明在100°C下使用0. 6mM Sr掺杂的PBS水热化I小时后的SrCaP的形态，图9说明在100°C下使用(a) 0. 04mM和(b) 0. 2mM F掺杂的PBS水热化24小时后的FCaP的形态，图10说明在100°C下使用6mM Si掺杂的PBS水热化24小时后的SiCaP的形态，图11说明在100°C下使用纯PBS老化24小时后CaP的形态，图9'示出根据本发明的具有增加的Ca/P比的Sr掺杂的CaP颗粒，图10'示出根据本发明的F掺杂和Si掺杂颗粒，图I' (a)-(c)示出根据本发明分别使用M1、M2和M3_Sr所获得的形态，图2，(a)-(d)示出根据本发明来自M2_H20(无缓冲溶液)的颗粒的形态，
图3'示出Mg和Sr对使用M2制造的颗粒形态的影响，图4'示出根据本发明使用不同Mg和Sr浓度的M2制造的颗粒的XRD图谱，图5'示出根据本发明使用M3制造的颗粒的形态，
图6'示出根据本发明使用M3_Sr制造的颗粒的XRD图谱，图T示出根据本发明使用Ml制造的IOOmg颗粒的累积的锶释放，和图8,示出根据本发明在37°C的水溶液中老化13天后的来自Ml的颗粒的形态。图9'示出在100°C下老化24小时具有增加的Ca/P比的0. 6mM Sr掺杂的多孔CaP 球体的 SEM 图像。Ca/P 比为(A)O. I、(B)O. I、(C)和(D) 2. 5、(E)和(F) 5. O。图10'示出氟取代的磷酸钙纳米颗粒的SEM图像，所述氟取代的磷酸钙纳米颗粒通过在100°c下处理包含0. 2mM氟离子(fluoride ion)的磷酸盐缓冲溶液(A) 12小时和⑶24小时，和0. 15mM硅酸盐离子的磷酸盐缓冲液(C) 12小时和⑶24小时而制备。图11示出利用在⑷至(E)中从0增加至0. 6mM的锶浓度在60°C下老化I周的磷酸钙的形态。Ca/P比为0. I。(D)中的箭头表示颗粒的中空性质。图12示出在100°C下处理不同反应时间的锶掺杂的磷酸钙球体的SEM图像。图13示出使用含0. 6mM Sr离子的溶液的Sr-CaP球形颗粒的XRD图谱。
具体实施例方式在本申请中，措辞“掺杂的”可与“取代的”互换使用。为了应用目的，生物材料为与生物系统连接(interface)以评价、处理、增加或替换任何躯体组织、器官或功能的材料。化学计量的羟基磷灰石(HA)的化学式为Caltl(PO4)6(OH)2,但为了该申请的目的可使用多种变体。本发明主要用磷酸钙(CaP)来描述，其包括但不限于磷酸二钙二水合物(DCPD)、磷酸八钙(OCP)、磷酸三钙(TCP)和无定形磷酸钙(ACP)或其任意衍生物。可将不同的离子引入三种亚晶格，并由此可改变材料的性质，例如溶解性、晶体结构、结晶度、晶粒大小或多孔性。可能地，阳离子取代离子为Sr2+、Mg2+、Si4+、Zn2+、Ba2+、Fe3+或Ti4+以及阴离子取代离子为Cl—、F—、HCO3-或C032—。离子取代的来源可为包含待取代离子的可溶性盐和微溶性盐，例如但不限于 SrCl2, SrCO3> Sr (NO3)2、Na2SiO3、硅酸钙如(CaOSiO2' CaO(SiO2)2、CaO (SiO2) 3) ;ZnCl2、ZnSO4, BaCl2, FeCl3、Fe (NO3) 3、Na2C03、NaF、Na2FPO4, NaHCO3 或 NaTi03。在根据本发明的方法中，在无表面活性剂的仿生过程中制备形态可控的离子取代的CaP颗粒。仿生学，由Otto Schmidt在20世纪50年代创造的术语,是指研究天然过程并将所获得的知识从生物学转化为科技，因而，模仿自然发生的过程，在该情况下所述自然发生的过程为生物矿化。以下为本发明和各种形态中的某些、它们如何受到不同因子的影响以及如何通过本发明而获得它们的一般的、非限制性综述本发明涉及为了控制形态和结构的离子取代的CaP的较小单元的聚集体，优选球体，单元/晶体的形态受离子浓度的影响，优选地,颗粒的直径小于IOOOnm,更优选小于IOOnm,优选直径大于10nm。当使用锶作为取代离子时，Sr2+ Ca2+ HP042_的比优选x I 10，其中x优选O < X < 0. 67，例如X为O以上，或大于0. 10或大于0. 20或大于0. 30或0. 67以下，或小于0. 50或小于0. 40。-0. 01至0. 09mM以形成直径约700nm至2 y m的无规球形多孔颗粒-0. 01至0. ImM以形成直径约100至300nm的球形多孔颗粒-0. 2至0. 4mM以形成直径约200至500nm的具有中空核和多孔壳的规则球形颗粒-0. 5至0. 7mM以形成直径100至500nm的具有致密壳和多孔核的球形颗粒。图9'示出在⑷至(E)中用从0增加至0. 6mM的锶浓度在60°C下老化I小时的磷酸钙的多孔形态。Ca/P比为0.1。(D)中的箭头表示颗粒的中空性质。此外，图10'、11和12说明锶掺杂的CaP。当使用氟作为取代离子时，F_ Ca2+ H0P42_的比优选为X I 10，其中x优 选0 <x彡0. 22，例如X大于0. 05或大于0. 10或0. 22以下或小于0. 15-以形成直径约300至500nm的球形多孔颗粒。当使用硅作为取代离子时，SiO32- Ca2+ HPO42-可为X I 10，优选0<x彡10，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10，-以形成直径约200至500nm的球形多孔颗粒。在以下实施例中，将更详细地描述具有不同形态的离子取代C aP颗粒的形成。由于许多例举的过程的目的在于CaP颗粒的球形形状，所以颗粒可互换地称作纳米球(nanosphere)。实施例I在静态工艺中，由包含Ca2+、HPO42' Na+、K+、Cl—、Mg2+(浓度参见表I)的Sr掺杂的过饱和磷酸盐缓冲溶液合成锶取代的多孔CaP纳米球。为了模仿体液，将Sr掺杂的磷酸盐缓冲盐水的pH值控制为7. 4。Sr2+ Ca2+ HP042_的初始比为x I 10(其中乂为0至0.67)。锶取代的CaP在过饱和溶液中结晶、生长并自组装。为了增加晶体生长和自组装的进程，在静态工艺期间，在37°C或60°C下在炉中进行处理。该过程产生具外壳结构和多孔内部以及颗粒大小约100至IOOOnm的Sr取代的CaP纳米球。用磷酸盐缓冲溶液中的锶离子浓度改变Sr取代的CaP纳米球的形态。当PBS溶液中Sr的初始浓度为0. 06mM时纳米球变成直径约I微米的无规球形多孔颗粒(图I)。当PBS溶液中Sr的初始浓度增加到0. 15mM时，球的大小降低至100至300nm，颗粒变成具中空核和多孔壳的球形(图2)。当Sr离子浓度增加到0. 3mM时，颗粒变成具有中空核和多孔壳，以及直径约200至500nm的规则球(图3)。然而，在将PBS溶液中Sr的初始浓度增加到0. 6mM时，颗粒转变为具有致密壳和多孔核，以及直径约100至500nm的球(图4、图6)。当处理时间增加到2周时，形态未改变，颗粒未生长，大小变得与I周的结果相同(图5)。实施例2与实施例I相同的实验步骤，只是溶液在37°C或60°C下的水浴中磁力搅拌。该过程产生具有中空核和比静态工艺的壳更粗糙的壳，以及颗粒大小约200至400nm的Sr取代的CaP纳米球。在图7的形态中，示出了此Sr取代的CaP纳米球的球体，其具有粗糙外层和中空核。反应在0. 6mM Sr掺杂的PBS中在60°C下搅拌I天。
实施例3 与实施例I相同的实验步骤，只是溶液置于60°C、80°C或100°C下的高压灭菌锅中以获得水热工艺。该过程产生具有致密壳和多孔内部，以及颗粒大小约200至500nm的Sr取代的CaP纳米球。经水热工艺,合成时间从I周大大缩短至I小时。在图8的形态中，说明了此Sr取代的CaP纳米球的具有光滑表面的球体。反应在O. 6mM Sr掺杂的PBS中在100°C下水热化I小时。因此，实施例I至3和相应的图I至8示出磷酸盐缓冲溶液中Sr离子浓度可用于控制Sr取代的颗粒的形态。Sr浓度对羟基磷灰石纳米晶体的形态的作用之前已由Bigi等人(Inorganica Chaemica Acta 2007 ；360 :1009-1016)观察到。在他们的研究中，当降低Sr含量时，Sr取代的纳米晶体的形态从板状变化成具不清晰边缘的更混乱的形状。之前的研究未揭示任何球体或球形颗粒的产生，并且他们未提出任何关于浓度如何影响形态的结果。在较高Sr含量下，晶体的尺寸随Sr含量的增加而增加。这些较大的纳米晶体，即O. 5X0. I μ m，具有沿平行于结晶c轴的方向伸长的轮廓非常清晰的形状。与此相反，本发明的Sr取代的颗粒基本上为球形聚集体，称作多态纳米晶体的10至IOOOnm的纳米球和微米球。此外，除了当改变Sr离子浓度时的形态变化之外，当Sr离子浓度增加时纳米球的大小降低。实施例I至3产生四种类型的形态，如下所示图1，直径约I μ m的无规球形多孔颗粒；图2 :具有中空核和多孔壳及直径约100至300nm的球形颗粒；图3，具有中空核和多孔壳及直径约200至500nm的规则球形颗粒；和图4至6，具有致密壳和多孔核及直径约100至500nm的球形颗粒。本发明不限定于借助Sr浓度控制形态。以下实例说明使用氟取代和硅取代所形成的颗粒形态的控制，后者可例举为硅酸盐类如二氧化硅。这些实例示出通过选择不同的取代离子或结合不同的取代离子，并通过改变取代离子浓度，可获得广泛范围的形状、大小和形态。实施例4在水热工艺中，由包含Ca2+、HPO42'Na+、K+、Cl'Mg2+的F掺杂的过饱和磷酸盐溶液合成氟取代的多孔CaP纳米球。为了模仿体液，将F掺杂的磷酸盐缓冲盐水的pH值控制为
7.4。F- Ca2+ HPO广的初始比为X I 10 (其中x为O至O. 22)。氟取代的CaP在过饱和溶液中结晶、生长并自组装。该合成为在60°C、80°C或100°C下在炉中进行的水热化过程。该过程产生直径约300至500nm的球形多孔的F取代的颗粒。图9中说明了使用O. 04mM(图9a)和O. 2mM(图9b)F掺杂的PBS在100°C下水热化24小时后此F取代的CaP颗粒的形态。当与例如图4至6中的Sr取代的颗粒的图像比较时，可认识到F取代的颗粒表面形态不同于Sr取代的颗粒的表面形态，即，Sr取代的颗粒具有比具有从表面突出的薄片的粗糙平面的F取代的颗粒更光滑的表面。对氟取代的磷灰石的晶体形态的一种影响已示于Jha等人的Journal ofMaterials Science !Materials in Medicine 1997 ;8 :185-191 中。在他们的工作中，沉淀出类似球体或更加针状的晶体。发现沉淀温度的降低和氟离子浓度的增加趋于降低所产生的晶体纵横比。在本发明中，氟化物浓度用于获得其中聚集体具有可控的形态的氟取代的磷酸钙晶体的球形聚集体。在许多上述应用中，聚集体形态的控制是最重要的，然而，晶体形态的影响有限。实施例5由包含Ca2+、HPO42' Na+、K+、Cl' Mg2+的Si掺杂的过饱和磷酸盐溶液合成硅酸盐取代的多孔磷酸钙纳米球。为了模仿体液，将硅酸盐掺杂的磷酸盐缓冲盐水的PH值控制为
7.4。SiO32- Ca2+ HPO42-的初始比为X I 10 (其中x为O至10)。用硅酸盐取代的磷酸钙在过饱和溶液中结晶、生长并自组装。为了增加晶体生长和自组装的进程，将溶液置于80°C或100°C下的高压灭菌锅中。该过程产生直径约200至500nm的球形多孔的Si取代的CaP颗粒。图10中说明了使用6mM Si掺杂的PBS在100°C下水热化24小时后此Si取代的CaP颗粒的形态。类似于图9的F取代的颗粒，图10的Si取代的颗粒的表面相当粗糙并包括从表面突出的鳞片。然而，F取代的颗粒具有更规则的球形形状。实施例6由包含Ca2+、HPO42' Na+、K+、Cl—、Mg2+(浓度参见表I)的过饱和磷酸盐溶液合成多孔磷酸I丐纳米球。为了模仿体液(body fluid sounding),在接下来的处理之前将该磷酸盐缓冲盐水的pH值控制为7. 4。Ca2+ ΗΡ042_的初始比为I : 10。磷酸钙在过饱和溶液中结晶、生长并自组装。为了增加晶体生长和自组装的进程，将溶液置于80°C或100°C下的高压灭菌锅中。该过程产生直径约300至500nm的多孔颗粒。图11中说明使用纯PBS在100°C下水热化24小时后此类颗粒的形态。实施例7在另一实施例中，缓冲溶液的Ca/P比为O. I至I. OmM内变化的钙和IOmM的磷酸根离子，而Sr在O至O. 6mM内变化，并在60°C下老化颗粒I周。磷酸钙颗粒在没有锶离子时沉淀为纳米鳞片的随机簇(random cluster)。在将银添加到磷酸盐缓冲盐水中后,注意到了颗粒形态的变化。随着Sr浓度增加到O. 06mM,鳞片状CaP颗粒聚集体比由无锶离子的溶液获得的聚集体更规则。Sr离子进一步增加到O. 15mM导致颗粒聚集成为具更小直径的球形。单个的CaP颗粒仍与鳞片状纳米磷酸钙组装。Sr增加到O. 3mM后CaP颗粒的形态为在球体周围有鳞片状翼的球形。这些CaP颗粒的平均直径约为500nm。特别有趣的是这些CaP球体为中空的。当Sr离子的浓度增加到O. 6mM时，CaP颗粒似乎完全为球形，并且直径为200nm至I μ m。该样品的XRD分析表明具有(002)、(211)和(203)的磷酸钙的特定峰，证实这些球体为磷酸I丐晶体。通过高角度环形暗视野(CaPADF)扫描透射电子显微镜(STEM)进一步分析了由O. 6mM锶溶液所获得的CaP颗粒的结构。很明显CaP球体具有中空核和约IOOnm厚度的壳，图6。来自EDXS的元素分布图证实球体包含Ca、P、O和Sr，并贯穿样品均匀分布。元素分布图还证实球体的确是中空的，因为Ca、P、O和Sr信号 仅沿壳分布。很明显在该矿化过程中，锶离子的添加是关键因素，其不仅改变组成，还改变磷酸钙的形态和结构。磷酸钙的形态从鳞片状颗粒的随机簇变化为鳞片状颗粒的规则簇，变化为具有粗糙表面的球形颗粒，变化为具有粗糙壳的中空球体，和最终变化为具有光滑壳的中空球体。该现象说明仅借助无机离子改变CaP的形态和结构的可能性，这与结构导向(structure directing)表面活性剂截然相反。本发明提供确保最终材料为掺杂CaP而并无其他残留物或其他晶体如磷酸锶的方案。锶掺杂的磷酸钙的形态不仅取决于Sr离子浓度，还受钙与磷酸根之比的影响。在该系统中，Sr浓度和钙与磷酸根之比越高，形状变得越呈球形。举例来说，当Ca/P比为O. I时，对于O. 6mM锶浓度，获得直径20至40nm的CaP颗粒，然而当增加Ca/P比至I. O时，CaP生长成纳米鳞片，具有与花样形态一起聚集的趋势。当Ca/P比进一步增加到2. 5时,鳞片状颗粒自组装成直径O. 6至I μ m的球形颗粒。此外，当Ca/P比增加到5. O时，CaP颗粒显示具有多孔结构的完整的球状形态，并且直径增加到约I至5μπι。图9'示出具有比例增加的离子掺杂CaP颗粒(A) O. I、⑶I. O、(C)和(D)2.5、(E)和(F) 5. O。溶液处理的温度也对所得颗粒的形态具有较大的影响。当在60°C下处理I周后， 包含I. OmM钙离子、IOmM磷酸根离子和O. 6mM锶离子的溶液产生完整的中空CaP球体。当增加温度至100°C时，在I小时处理后形成球状CaP纳米颗粒。这些颗粒具有直径200至500nm，并被纳米鳞片所覆盖。12小时的反应后，CaP球体似乎更光滑，球体的直径增加至500至800nm。24小时的反应后CaP球体的直径进一步增加到600nm至I μ m，表面变得比12小时反应后所获得的球体表面更粗糙。长且鳞片状颗粒从CaP球体的内部呈放射状生长。由O. 06mM Sr2+浓度制备的CaP球体在60°C下不产生CaP球体，但随着温度增加到100°C，易于形成球状颗粒。除了锶，可向磷酸盐缓冲溶液添加其他离子如氟和硅酸根离子例如Si032_，如在上述实施例中所示，其类似于Sr，为骨矿化中的天然取代。在向磷酸盐缓冲溶液添加这些离子并在100°C下处理12和24小时后，形成形态可控的氟和硅掺杂的CaP (F-CaP和Si-CaP)颗粒。F-CaP颗粒在仅12h后就形成球体(图6A)。针状颗粒从球形内核呈放射状生长以产生完整的球体。处理24小时后，氟掺杂的CaP颗粒变成球形。然而，硅掺杂的CaP颗粒显现为球形。反应温度在Si/F-CaP系统中的球形颗粒形成中起重要作用，优选温度应为高于60°C。图10'示出在100°C下处理包含O. 2mM氟离子的磷酸盐缓冲溶液(A) 12小时和(B) 24小时，以及处理包含O. 15mM硅酸根离子的磷酸盐缓冲液(C) 12小时和(D) 24小时所制备的磷酸钙球体的SEM图像。静态工艺中增加反应温度的作用类似于水热法的作用。高温不仅增加锶掺杂的CaP球体的形成速率，而且还能够制备在低温下不能制备的氟和硅掺杂的CaP球体。如前所述，额外的热处理不是必须的，也可热处理使用根据本发明的方法制造的颗粒以改变晶体的形态或结晶度。为此，选择在高温炉中煅烧或在水基质中熟成。实施例8根据实施例I用O. 15mM Sr溶液制造包含球形Sr取代CaP颗粒的牙膏,球体的大小为100至300nm，颗粒为具中空核和多孔壳的球形。将7重量％ CaP颗粒添加到商购可得的牙膏中(ACTA, Cederbloms, Vasby Sweden)。该研究的目的为评价含CaP颗粒的牙本质小管的闭合。方法使用来自拔掉的牙齿的人牙本质的标准化板(standardized slab)进行体外实验。从拔掉的牙齿切割并且通过磨削和抛光来标准化试验表面，从而制备盘(disc)。将其蚀刻以除去任意污点层(smear layer)从而提供良好的观察，将板切成两半以提供相匹配的试验和对照样品。以圆周运动轻柔擦拭牙本质块的抛光表面分别处理30秒。使处理材料置于牙本质块上三十几秒，然后用自来水使劲地冲洗约60秒以除去牙膏残留。然后干燥样品并置于37°C的仿唾液浴中5分钟。5分钟后，再次处理样品，随后进行相同的过程直至处理各样品总计10次。为了可视化效果，装载所有样品以用于扫描电子显微镜(SEM)。结果在SEM评价下注意到对照样品具有丰富的开口牙本质小管，而处理的样品具有非常少的开口小管。小管均被残留的CaP颗粒封闭。实施例9以下，将参考三种不同的方法详细描述在人体或躯体模拟环境中形态可控和控制从制备的颗粒释放离子如释放锶的离子取代的CaP颗粒的形成，所述三种不同方法利用I)基于杜氏磷酸盐缓冲溶液D8862 (D-PBS)的盐溶液，2)自制的Tris-HCl和3)蒸馏水，下文中分别称作M1、M2和M3。这些盐溶液的实例示于表I。可改变盐溶液的一种或多种组成的浓度。
权利要求
1.一种用于形成离子取代的磷酸钙化合物的颗粒的方法，其包括以下步骤 -提供水溶液，所述水溶液包括钙离子、磷酸根离子和选自镁、锶、硅、氟、钡、铁和锌中的一种或多种取代离子以及可选地进一步包括选自钠离子、钾离子、氯离子、碳酸根离子和硫酸根离子中的一种或多种离子，所述水溶液具有2. O至10. 0范围内的初始pH以及20°C至150°C的温度；和 -以静态工艺、搅拌工艺和/或水热工艺的形式，通过自组织过程在所述溶液中沉淀颗粒。
2.根据权利要求I所述的方法，其进一步包括在所述溶液中生长和自组装所述颗粒，从而由于在所述溶液中所述取代离子的浓度的调整而形成具有中空核和致密壳、或中空核和多孔壳、或多孔核和致密壳，或多孔的离子取代的颗粒的步骤。
3.根据权利要求I和2任一项所述的方法，其中所述一种或多种取代离子的浓度应为对于 Sr2+ 为 0. 01 X KT3M 至 I. 0X1(T3M、对于 Si4+ 为 0. 01 X KT3M 至 IOXKT3M 和对于 r 为0.01 X IO-3M 至 0. 5 X KT3M 的范围。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Sr2+的浓度为0.01至0. 08mM。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述Sr2+的浓度为0.I至0. 2mM。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述Sr2+的浓度为0.2至0. 4mM
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述Sr2+的浓度为0.5至0. 7mM。
8.根据权利要求I至7任一项所述的方法，其中所述Sr2+的浓度为0.01至0. 7mM，例如0. 01或大于0. 05或大于0. I或大于0. 3，或者0. 7或小于0. 6或小于0. 5mM ;和所述Mg2+的浓度为0. I至0. 5mM,例如0. I或大于0. 2或大于0. 3，或者0. 5或小于0. 4mM。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述pH为6.0至8. 0之间。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述溶液包括钙、镁和磷酸根离子以及选自钠、钾、氯、碳酸根或硫酸根离子的一种或多种，并且其中所述离子的浓度为 钙离子在0. 01 X KT3M至25 X KT3M的范围， 镁离子在0. 01 X IO-3M至15 X KT3M的范围， 钠离子在0. 01 X IO-3M至1420 X IO^3M的范围， 钾离子在0. 01 X KT3M至1420 X IO^3M的范围， 氯离子在0. 01 X IO-3M至1030 X IO^3M的范围， 磷酸根离子在0. 01 X IO-3M至IOXKT3M的范围， 碳酸根离子在0. 01 X KT3M至270 X IO-3M的范围，或 硫酸根离子在0. OlX KT3M至5 X KT3M的范围。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中至少一种所述取代离子为Sr2+。
12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中至少一种所述取代离子为Mg2+。
13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述温度为30至70°C。
14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述形成的颗粒例如在超过30°C或超过50°C或超过100°C下热处理。
15.一种由结晶的、无定形的或二者的多个较小单元的聚集体所组成的磷酸钙化合物的颗粒，磷酸钙材料的特征在于，所述磷酸钙颗粒包括镁、锶、硅、氟、钡、铁和锌中的一种或多种取代离子，并且所述颗粒具有中空核和致密壳、或中空核和多孔壳、或多孔核和致密壳，或者所述颗粒为多孔的。
16.根据权利要求15所述的颗粒，其中所述颗粒基本上为球形。
17.根据权利要求15和16所述的颗粒，其中所述颗粒具有直径10至lOOOnm，例如IOnm或大于50nm或大于IOOnm,或者IOOOnm或小于500nm或小于300nm。
18.根据权利要求15至17任一项所述的颗粒，其中所述颗粒为中空的和/或多孔的。
19.根据权利要求15至18任一项所述的颗粒，其中所述颗粒具有多孔核和致密壳。
20.根据权利要求15至19任一项所述的颗粒，其中所述颗粒包括Sr2+、Si4+和F_的一种或多种作为取代离子。
21.根据权利要求15至20任一项所述的颗粒，其中所述锶浓度为0至35重量％之间，例如大于5%或大于15%或大于25%，或者35%或小于30%或小于20%或小于10%。
22.根据权利要求15至21任一项所述的颗粒，其中所述镁浓度为0至10重量％之间，例如大于1%或大于3%或大于5%,或者10%或小于8%或小于5%。
23.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒的用途，所述用途为在药物运载应用中的用途，所述用途为通过用药物、对照物、放射性标记颗粒填充所述空腔和/或孔，或者将所述药物、对照物、放射性标记颗粒吸附至或附着于所述颗粒表面来药物运载。
24.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒的用途，所述用途用于基因或生长因子的运载，所述用途为通过用所述基因和/或生长因子填充所述空腔和/或孔，或者将所述基因和/或生长因子吸附至所述颗粒表面来运载所述基因或生长因子。
25.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒用于控制离子释放的用途。
26.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒的用途，所述用途为用于牙科微创和预防性治疗如清洁、抛光、增白、漂白和喷砂牙齿，嵌缝添料，龋洞预防，牙齿保存及修复，以及改善漂白后牙釉质的表面。
27.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒的用途，所述用途为用于治疗牙周炎，或作为龋洞填充材料或作为植入材料或作为重金属离子吸附剂的用途。
28.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒的用途，所述用途为作为用于治疗敏感牙根的牙膏中的填料颗粒，以改善敏感性和早期龋齿的治疗的用途。
29.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒的用途，所述用途为作为用于治疗牙釉质的洁牙带或膏、牙膏、洗口液、漱口水、口气清新齐U、牙科用乳霜、漂白和增白膏的用途。
30.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒作为食品补充剂和口香糖的用途。
31.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒作为骨填料或在骨生长刺激手术中的用途，其中所述颗粒包括Sr2+作为取代离子，所述Sr2用于离子释放。
32.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒用于骨修复和再生的用途。
33.根据权利要求15至22任一项所述的颗粒用于牙齿修复和再生的用途。
34.一种组合物，其包括在药物运载应用中的根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，其中所述药物包括对照物和放射性标记颗粒。
35.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物用于通过用所述基因和/或生长因子填充所述颗粒的空腔和/或孔，或者将所述基因和/或生长因子吸附至所述颗粒表面来运载基因或生长因子。
36.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物用于控制离子释放。
37.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物用于牙科微创和预防性治疗如清洁、抛光、增白、漂白和喷砂牙齿，嵌缝添料，龋洞预防，牙齿保存及修复，以及改善漂白后牙釉质的表面。
38.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物用于牙周炎的治疗，或作为龋洞填充材料或作为植入材料或作为重金属离子的吸附剂。
39.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物用于治疗敏感牙根的牙膏中，以改善敏感性和早期龋齿的治疗。
40.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物作为用于治疗牙釉质的洁牙带或膏、牙膏、洗口液、漱口水、口气清新齐U、牙科用乳霜、漂白和增白膏。
41.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物作为食品补充剂和口香糖。
42.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物作为骨填料或用于骨生长刺激手术，其中所述颗粒包括Sr2+作为取代离子，所述Sr2用于离子释放。
43.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物用于骨修复和再生。
44.一种组合物，其包括根据权利要求15至22任一项所述的颗粒，所述组合物用于牙齿修复和再生。
全文摘要
本发明涉及用于形成离子取代的磷酸钙的球形颗粒的方法。所述方法基于在静态、搅拌或水热条件下来自缓冲溶液的颗粒的沉淀物。本发明还涉及所形成的材料和颗粒本身的用途。
文档编号A61K47/04GK102639159SQ201080044350
公开日2012年8月15日 申请日期2010年8月4日 优先权日2009年8月4日
发明者H·恩奎斯特, W·夏 申请人:生物材料细胞公司