专利名称：抑制肺转移肿瘤生长的siRNA及其寡聚核酸组合与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制肺转移肿瘤生长的SiRNA及其寡聚核酸组合与应用。
背景技术：
微小核酸(miRNA)是一类高度保守的非编码小核酸，广泛存在于动物植物和病毒中。miRNA通过转录后调控基因的表达，进而调节机体重要的生理与病理过程。微小核酸与肿瘤的发生密切相关。近年来的研究发现，miRNA在肿瘤组织和与正常组织间的表达明显不同。miRNA既可以作为原癌基因促进肿瘤的发生发展，又能作为抑癌基因抑制肿瘤的发生发展，根据miRNA调节肿瘤发生发展的不同机理，将它们组成不同的配方或将它们与其它抗肿瘤的小干扰RNA(siRNA)组成不同的配方，将比单一的miRNA更能有效地治疗肿瘤性疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种寡聚核酸在制备抑制肺转移肿瘤生长的试剂中的应用。本发明所述的寡聚核酸是如下1)-4)中任一所述的双链RNA 1)序列表中序列1和序列2组成的寡聚核酸；2)所述1)的寡聚核酸与PTN-siRNA组成的双寡聚核酸，所述PTN_siRNA是序列表中序列3和序列4组成的寡聚核酸；3)所述1)的寡聚核酸与mil^Ma组成的双寡聚核酸，所述mil^Ma是序列表中序列5和序列6组成的寡聚核酸；4)所述1)的寡聚核酸与VEGF-siRNA组成的双寡聚核酸，所述VEGF_siRNA是序列表中序列7和序列8组成的寡聚核酸。上述2)的双寡聚核酸中，所述1)的寡聚核酸与PTN-siRNA的质量比是 (0.5-2) (0.5-2)，优选是 1 1。上述3)的双寡聚核酸中，所述1)的寡聚核酸与miR_34a的质量比是 (0.5-2) (0.5-2)，优选是 1 1。上述4)的双寡聚核酸中，所述1)的寡聚核酸与VEGF-SiRNA的质量比是 (0.5-2) (0.5-2)，优选是 1 1。进一步，上述1)-4)中的寡聚核酸均是经过如下a)或b)或c)修饰得到的寡聚核酸a)对所述寡聚核酸的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰，优选将所述磷酸二酯键的氧用硫取代；b)对所述寡聚核酸的核糖的2’_0H的修饰，优选将所述2’_0H用甲氧基或氟取代或者对所述2’ -OH进行脱氧修饰；c)对所述寡聚核酸5’端连上胆固醇的修饰。
上述序列表中序列1、3、5、7、9从左至右方向为5’ _3’，序列表中序列2、4、6、8、10 从左至右方向为3’ -5’。上述肿瘤是肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌或肺癌。上述试剂可以包含上述寡聚核酸分子中的至少一种以及至少一种药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明试剂中的双链RNA分子相容。在一个优选实施例中，所述“药学上可接受的载体”是指体内转染试剂，如聚乙烯亚胺(PEI)， jetPEI (线性聚乙烯亚胺)，TF-PEI (转铁蛋白聚乙烯亚胺)脂质体，转铁蛋白，叶酸等。所述寡聚核酸为化学合成，可以进行2'氟代O' _F)、2'甲氧基O' -(Me)At 代(PQ和2'脱氧、2’ -deoxy)化学修饰，也可以在5’端连上胆固醇修饰。用化学合成并修饰的上述寡聚核酸分子转染鼻咽癌细胞株CNE形成的肺转移瘤肿瘤细胞的实验结果表明 miR-210、siPTN、miR-210+siVEGF、miR-34a+miR_210、 miR-210+siPTN这几组均可以有效的抑制肺转移瘤的生长。作为新型小核酸类的抗肿瘤药物，化学合成并修饰的所述寡聚核酸不易被降解， 有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。
图1为2' -F-siPTN及其寡聚核酸治疗抑制肺转移瘤形成的肺部压片效果图。图2为2 ‘ -F-siPTN及其寡聚核酸组合治疗鼻炎癌肺转移6次以后肺部转移灶统计柱形图。图3为2' -F-siPTN及其寡聚核酸组合治疗鼻炎癌肺转移组织切片图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、寡聚核酸的制备本发明中所述寡聚核酸miR-210正义链为5，-CU⑶GC⑶⑶GACAGCGGCUGA-3 ，(SEQ ID No. 1)；反义链为 3，-UUGACACGCACACU(iUCGCCGA-5，序列(SEQ ID No. 2)； PTN-siRNA 序列正义链为5，-GCCCAAACCUCAAGCAGAATT-3，(SEQ ID No. 3)；反义链为 3，-TTCGGGUUUGGA⑶UC⑶CUU-5，(SEQ ID No. 4)；本发明中 miR_34a 正义链为 5，-UGGCA⑶ ⑶CUUAGCUG⑶UGU-3，(SEQ ID No. 5)；反义链为 3，-UUACC⑶CACAGAAUCGACCAA-5，(SEQ ID No. 6)；本发明中 VEGF-siRNA 正义链为 5，-GGAGUACCCUGAUGAGAUCTT-3，(SEQ ID No. 7)；反义链为3，-TTCXUCAUGGGACUA⑶CUAG-5，(SEQ ID No. 8)；本发明中所述随机序列作为阴性对照(NC)，NC 的正义链序列为5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ (SEQ ID No. 9)，反义链序列为3，-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5，(SEQ IDNo. 10)。所述寡聚核酸和 NC 序列中的 A、G、 C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T 表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。所述寡聚核酸和NC委托上海吉玛(GenePharma)制药技术有限公司合成并进行如下任意一种化学修饰2'甲氧基O' -OMe),2'氟代O' -F)、硫代和2'-脱氧 (2' -deoxy), 5'胆固醇(5' -Cholesterol)。然后经冻干处理得到寡聚核酸粉末，用于实施例2中的实验。其中miR-210经2'氟代修饰后命名为2' -F_miR-210 ;miIKMa经2 ‘氟代修饰后命名为2' -F-miR-34a ;PTN-siRNA经2 ‘甲氧基修饰后命名为2' -F-SiPTN0 VEGF-siRNA经2 ‘甲氧基修饰后命名为2' _F_siVEGF ;NC经2 ‘氟代修饰后命名为 2' -F-NC。上述合成方法源自一篇1995年公开的文献Wincott F，DiRenzo A, Shaffer C, GrimmS, Tracz D, Workman C, Sweedler D, Gonzalez C, Scaringe S and Usman N. Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res. 1995,23 2677-840整个化学合成可大致分成四个的过程(1)寡聚核糖核酸的合成；⑵脱保护；⑶纯化分离；⑷脱盐退火无菌消毒。(1)寡聚核糖核苷酸的合成在自动DNA/RNA 合成仪(例如，AppliedBiosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的 5'-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第η次 (19 ^n ^ 2)循环中，在第η-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。(2)脱保护将连接有RNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙胺(体积比为1 3)，然后密封，置于55-70°C温箱中，孵育2-30小时，取出连接有siRNA 的固相支持物并用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。 然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(IM)，室温放置4-12小时，再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到小RNA的粗产物。(3)纯化分离将得到的RNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的RNA产物。(4)脱盐退火用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的RNA产物2_4次(每次2毫升)，以除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(IOmM Tris, pH = 7. 5-8. 0,50mM NaCl)，将此溶液加热至95°C，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有双链微小RNA的溶液。实施例2、2' -F寡聚核酸对肺转移肿瘤生长的抑制作用用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养鼻咽癌CNE细胞株，取对数生长期的细胞， 制成单细胞悬液，调节细胞浓度1. 5X IO6个细胞/ml。在5周龄的雄性BALB/C裸鼠的尾静脉注射0. 35ml肿瘤细胞悬液，15天左右可形成肺转移瘤。将裸鼠分为6组(7只/组)， 分别为 2 ‘ -F-NC (简称 NC 组)，2 ‘ -F-miR-210 加 2 ‘ -F-siVEGFA (简称 miR-210+siVEGF 组)，2 ‘ -F-miR-34a 加 2 ‘ -F-miR-210 (简称 miR-34a+miR_210 组)，2 ‘ -F-miR-210 加 2' -F-siPTN(简称miR-210+siPTN组)，2' -F-siPTN(简称 siPTN组)，2' -F_miR-210(简称miR-210组)，接种肿瘤细胞以后，先后进行6次尾静脉注射。然后处死小鼠，取左肺部压片计数肺转移瘤个数，并用10%的福尔马林固定样本进行病理切片检查。
各组的尾静脉注射用的寡聚核酸制剂的配制方法是单寡聚核酸组(NC组、 miR-210a组和siPTN组)是用不含RNA酶的DEPC水稀释20 XHBS至1 XHBS (试剂盒 HBS原始浓度为20XHBQ取50 μ 1分别溶解40 μ g每组相应的寡聚核酸；双寡聚核酸组 (miR-210+siVEGF 组、miR-210+siPTN 组、miR-210+miR_34a)是用两份不含 RNA 酶的 DEPC 水稀释的IXHBS无菌水25 μ 1分别溶解每组内的两种20 μ g寡聚核酸后混合(总容积50ul)。然后各组再加转染剂TF-PEI (加入DEPC水120 μ 1/瓶溶解混勻)6μ 1(购自 Bander公司)，与294 μ 1 IXHBS溶液混合起来，总体积350ul，在室温孵育15分钟后进行尾静脉注射。一次注射的寡核苷酸用量为40 μ g/只。每隔2天注射一次，尾静脉注射共6 次。图1为寡聚核酸治疗抑制肺转移瘤形成的效果图，NC为对照组，只注射转染剂。与 NC比较，可以观察寡聚核酸治疗组的肺部压片肿瘤转移灶个数明显少于对照组。图中透光度高的白色点状病灶经组织切片检查为肿瘤转移灶(图1)。图2为寡聚核酸治疗抑制肺转移瘤形成的统计图。与肺压片对比图相似，siPTN 单独处理组(肿瘤转移灶平均值23. 67) ,miR-210+siVEGF组(肿瘤转移灶平均值14. 71)、 miR-210+siPTN组(肿瘤转移灶平均23. 66) ,miR-34a+miR-210 (肿瘤转移灶平均值21. 85) 与对照组(NC)(肿瘤转移灶平均值43. 86)肿瘤转移灶个数明显减少，且有显著性差异。图3为肺组织切片结果，可以观察到正常鼠(normal)的肺部组织均一，而模型组 (NC)肺部有明显的转移灶，与肺压片中透明点的转移灶相对应。因此可以用计算肺压片中转移灶的个数来确定肿瘤的治疗情况。本实施例中，各组寡聚核酸经2'甲氧基O' -OMe)、硫代(PS)、2'脱氧和5'胆固醇(5' -Cholesterol)修饰对肺转移肿瘤生长的抑制作用与经2'氟代O' -F)修饰后的作用无显著性差异。
权利要求
1.寡聚核酸在制备抑制肺转移肿瘤生长的试剂中的应用；所述寡聚核酸是如下1)-4) 中任一所述的双链RNA 1)序列表中序列1和序列2组成的寡聚核酸；2)所述1)的寡聚核酸与PTN-siRNA组成的双寡聚核酸，所述PTN-siRNA是序列表中序列3和序列4组成的寡聚核酸；3)所述1)的寡聚核酸与mil^Ma组成的双寡聚核酸，所述mil^Ma是序列表中序列5 和序列6组成的寡聚核酸；4)所述1)的寡聚核酸与VEGF-siRNA组成的双寡聚核酸，所述VEGF_siRNA是序列表中序列7和序列8组成的寡聚核酸。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述2)的双寡聚核酸中，所述1)的寡聚核酸与PTN-siRNA的质量比是(0.5-2) (0.5-2)，优选是1 1。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述3)的双寡聚核酸中，所述1)的寡聚核酸与miR-34a的质量比是(0. 5-2) (0. 5_2)，优选是1:1。
4.如权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于所述4)的双寡聚核酸中，所述1) 的寡聚核酸与VEGF-siRNA的质量比是(0. 5-2) (0. 5-2)，优选是1:1。
5.如权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于所述1)-4)中的寡聚核酸均是经过如下a)或b)或c)修饰得到的寡聚核酸a)对所述寡聚核酸的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰，优选将所述磷酸二酯键的氧用硫取代；b)对所述寡聚核酸的核糖的2’-0H的修饰，优选将所述2’-0H用甲氧基或氟取代或者对所述2’ -OH进行脱氧修饰；c)对所述寡聚核酸5’端连上胆固醇的修饰。
6.如权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于所述肿瘤是肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、 肝癌、乳腺癌或肺癌。
全文摘要
本发明公开了一种抑制肺转移肿瘤生长的siRNA及其寡聚核酸组合与应用。本发明所述的寡聚核酸是如下1)-4)中任一所述的双链RNA1)序列表中序列1和序列2组成的寡聚核酸；2)所述1)的寡聚核酸与PTN-siRNA组成的双寡聚核酸，所述PTN-siRNA是序列表中序列3和序列4组成的寡聚核酸；3)所述1)的寡聚核酸与miR-34a组成的双寡聚核酸，所述miR-34a是序列表中序列5和序列6组成的寡聚核酸；4)所述1)的寡聚核酸与VEGF-siRNA组成的双寡聚核酸，所述VEGF-siRNA是序列表中序列7和序列8组成的寡聚核酸。上述寡聚核酸作为新型小核酸类的抗肿瘤药物，化学合成并修饰的所述寡聚核酸不易被降解，有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。
文档编号A61K48/00GK102178959SQ20111006211
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者何杰, 张佩琢, 张雅鸥, 李建娜, 谢伟东 申请人:上海吉玛制药技术有限公司, 清华大学深圳研究生院