专利名称：一种构建中医肾虚证艾滋病猴模型的方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种构建中医模型的方法及用途，具体涉及一种构建中医肾虚证艾滋病模型的方法及用途。
背景技术：
目前艾滋病的治疗主要是应用高效抗逆转录病毒疗法(HARRT)治疗、免疫治疗、 生物治疗、疫苗、中医药治疗等。其中，中医临床治疗具有辨证论治的特点，可根据患者的自身体质特征和症状表现采用个体化治疗，且中药通过调节机体免疫系统，延长患者带毒生存时间，毒副作用少，依从性好。中医药特别是在感染HIV病毒后的无症状期发挥积极的治疗作用。近几年中医药防治艾滋病的实验取得了可喜的成绩，通过体外抑制HIV病毒细胞培养、药物筛选和动物实验发现了多种具有抑制艾滋病病毒作用的中药，临床试验研究也证实了中药在稳定和提高免疫功能、消除和缓解症状、改善生活质量方面具有较好的效果。 中医药通过多环节、多靶点的调节，从多个途径介入，通过影响病毒——宿主网络，改变疾病的病理状态或推迟疾病的进程，在临床治疗中更强调对患者生活质量和生存期的改善， 与西医药着重于抑制病毒有着较大的区别，因此，作为病因病机基础研究和评价标准的动物模型应该有别于西医药研究所采纳的动物模型。然而，目前尚未建立适合中医药筛选抗艾滋病的动物模型，给中医药的筛选工作带来了困难。艾滋病中医动物模型应能够和艾滋病的病因、病理变化相似；满足中医临床的症状模拟，评价指标特异性强、客观；模型应能够被药物反证。概括而言，应符合中医动物模型的基本要求。另外，该模型应该价操作简单、操作步骤和环节精炼，实验结果的重复性好。中医药艾滋病动物模型必须始终以中医理论为指导，体现中医特色。中医的证候是中医药理论和临床的基础，因此，动物模型应该符合中医的证和病机变化。目前，中医艾滋病证候的研究已进行了多年，形成了多种学说，基本认为艾滋病的证候以复合证、虚实夹杂为特点，具有复杂的病机，体现了多样性的特点。我们长期的临床和实验研究认为，AIDS病因病机为HIV侵入人体，首先损伤脾脏，致脾气亏虚，进而损及肾脏和其他三脏，终至五脏气血阴阳俱虚，并伴有气滞血瘀，或痰饮水湿，或风寒火热等邪毒为其基本病机的疾病。艾滋病复杂的临床症状表现，说明除了 HIV病毒之外，其他的因素也参与了证候的形成。利用当前成熟的技术，在动物身上复制能够和临床证候更为相似的动物模型，能够更好地模拟临床表现，提供与临床“证”相似的模型，丰富艾滋病的中医动物模型库，切中中医动物模型中“辨证”的要求。由于临床上艾滋病的发生、发展过程中，症状、证型存在随时空变化而改变的性质，提示某种因素复制的艾滋病动物模型在不同的时期，其所表现的证可能是不同的，这种证的变化尽量拟合临床证的变化。除了客观的症状指标外，应选择科学、准确、量化的指标衡量证候，并应注意这些指标应该有较强的特异性。药物反证 (以下简称反证)，又称以药测证也是衡量模型是否成功的有效手段。当建立稳定的动物模型后，再用该模型相对应的基本方药进行观察治疗，如果治疗能改善或消除模型的症状和检测指标，则佐证了此模型成立，否则，不成立。综上所述，中医艾滋病动物模型应在满足模拟艾滋病病因、病理的基础上，应能体现中医证的特色，满足中医学的发病学原理，模型的症状、客观指标和药物反证比较一致，与中医理论较为吻合。该模型的建立将有利于揭示艾滋病“证”的实质，验证并探讨中医中药的疗效和机理，促进中医药防治艾滋病的理论研究。猴艾滋病病毒SIV属逆转录病毒科慢病毒亚科病毒，SIV病毒株于1985年首先从恒河猴中成功地分离。SIV引起的症状和人AIDS明显相似，第一阶段为感染后第1 3周，其间会出现一个病毒复制的高峰，常表现在血浆中的P27核心蛋白大量增值，有明显的病毒血症，表现为发热、皮疹、腹泻和外周浅表淋巴结肿大等，类似于人感染的临床症状。第二阶段为持续无临床症状期。该期时间长短不一，短的仅为2个月，长的可达几年。 其表现为P27核心蛋白水平下降而相应的抗体出现。第三阶段为AIDS期，猴外周血中⑶4 细胞逐渐下降，血浆病毒水平回升，并伴有体重下降、全身衰竭和机会感染(主要表现为顽固的腹泻和肺炎)。约有20% 30%的感染猴因缺乏有效的免疫应答而死亡。SIV在基因方面和人类有70%的类似度，是研究艾滋病的最佳动物模型。SIV和HIV同属逆转录病毒科慢病毒亚科病毒，SIV与CD4受体和辅助受体CCR5，CXCR4密切相关，并可使猴子致病，还可以通过母猴喂养小猴传播。SIV猴模型作为AIDS模型，得到了越来越多人认可。 国内外艾滋病实验大多数都是应用SIV猴模型，作为AIDS发病机理、药物治疗、疫苗研制的技术平台。本发明人克服了诸多技术问题，成功构建了一种艾滋病灵长类中医肾虚证动物模型。在所述动物中复制的重复性、稳定性好；能体现中医证的特色，模型的症状、客观指标和药物反证比较一致，与中医理论较为吻合。该模型的建立将有利于揭示艾滋病“证”的实质，验证并探讨中医中药的疗效和机理，促进中医药防治艾滋病的理论研究为中医药治疗艾滋病疗效评价和药物筛选提供了比较理想的动物模型。
发明内容
本发明的目的，是构建一种中医肾虚证艾滋病猴模型。这种中医肾虚证艾滋病猴模型，是由同一造模动物中医肾虚症候模型和SIV感染模型叠加构建而成。具由中医肾虚症候和SIV感染艾滋病症候双重特点。本发明的目的是这样实现的
本发明通过两种方案构建了中医肾虚证艾滋病猴模型。第一种是连续使用生大黄浓缩液灌胃，同时肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸泼尼松龙先造成肾虚证，然后感染静脉注射感染Siv病毒，感染14天后检测并最终确认病毒感染，达到构建复合模型。中医肾虚症候模型根据实验要求和恒河猴自身身体状况，连续使用生大黄浓缩液灌胃，同时注射利血平和醋酸泼尼松龙对恒河猴进行3到7周的造模可达实验设计要求。第二种是恒河猴经静脉注射感染猴艾滋病病毒后再用连续使用生大黄浓缩液灌胃，同时肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸泼尼松龙造肾虚证。SIV感染模型采用SIVmac239 病毒株进行静脉感染方式，感染14天后抽血检测确认感染情况，然后用生大黄浓缩液灌胃进行中医肾虚症候模型构建，最终构建复合模型。
恒河猴感染艾滋病病毒后，表现和艾滋病人极为相似，猴感染SIV后病情发展有三个阶段急性感染、慢性感染早期和慢性感染中后期，产生抗艾滋病病毒抗体IgM和IgG 体液分离病毒阳性，检测病毒阳性。中医肾虚SIV复合模型病毒构建前后血浆病毒载量与正常状况下SIV感染猴模型的血浆病毒载量相比较无明显差别，但⑶4计数较正常状况下SIV感染猴模型的更低。⑶4/ CD8比值倒置状况也较正常状况下SIV感染猴模型更加严重。整体来说，中医肾虚SIV复合模型病情较正常状况下SIV感染的恒河猴病情更为严重。本发明的特点和突出优势在于
成功构建了一种中医肾虚证艾滋病猴模型。在最接近于人类的动物模型上既能体现中医肾虚证候特点及演变规律，并可从中获得稳定的肾虚症状和肾虚证相关客观指标，又能体现最接近人类艾滋病的感染与发病过程和症状，并可从中获得稳定的病毒学、免疫学及病理学相关客观指标。构建的病、证结合的艾滋病猴模型具有重复性和稳定性，有利于揭示艾滋病“证”的实质，验证并探讨中医中药的疗效和机理，促进中医药防治艾滋病的理论研究。以下通过实施例进一步说明本发明的内容，本领域技术人员能够通过实施例了解本发明所说的一种中医肾虚证艾滋病猴模型的建立方法和用途。但是这些实施例不得理解为对本发明权利要求的限制。实施例1 第一种构建中医肾虚证艾滋病猴模型的方法和用途
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1实验动物选择健康成年雄性恒河猴，经血清学检测SIV，猴逆转录D型病毒(SRV)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-I)抗体阴性，无肾虚、气虚症状体征；
2造模药物大黄灌胃浓缩液、利血平注射液(lmL: lmg)、醋酸泼尼松龙注射液(5mL: 125mg)
2.1制备工艺取生大黄药材，粉碎成粗粉，称取5 kg，加4倍量水，置不锈钢桶中搅拌均勻，浸泡0.5 h，再将此桶置入沸水浴中，继续加热、保温搅拌20 min，用纱布过滤，残渣加沸水8000 mL，搅拌20 min，四层纱布过滤。先将第二次过滤的药液常压下浓缩至小体积， 再并入第一次的过滤液，常压浓缩至5000 mL，即得。浓度为1 mL = 1 g生药。给药方式大黄灌胃液经鼻插胃管，灌胃给药。利血平注射液肌肉注射。醋酸泼尼松龙注射液肌肉注射。感染模型构建
3.1造模感染病毒株SIVmac239病毒株3. 2感染剂量及方式
感染的剂量为1:3000，使用1640稀释液进行稀释，将稀释后呈粉红色液体Iml进行静脉注射，注射后压按注射口防治血液倒流以确保注射病毒剂量准确，14天后抽血检测确认感染情况。造模效果评价
4.1中医证候积分
复合模型构建前恒河猴中医症候临床观察无特殊异常，中医症候积分一般在0 6分水平波动。复合模型构建启动后，造模恒河猴群出现明显的腹泻、摄食量减少、进食速度减慢、厌食等典型中医脾虚情况；随着造模时间的延长，恒河猴群相继出现腹泻加重出现水样便或粘液血便、摄食和食欲明显下降、对外界刺激反应能力降低和减缓、蜷缩、嗜睡、体重下降等症状体征；在造模后期，造模恒河猴出现类似艾滋病猴终末期死亡前脾肾阳虚症状，主要表现为消化道症状明显加重、毛发开始干涩、疏松、体重进一步下降、摄食明显减少甚至不摄食、明显蜷缩、怕冷、嗜睡、对外界刺激反应明显减弱，甚至对轻度刺激无反应、抽血检测时明显感觉血液流速下降，血液难抽取。体重变化
造模动物在造模后体重迅速下降，个体存在明显差异。中医肾虚造模前体重 4. 8545kg士0. 54726kg,造模后体重 4. 7160kg士0. 4824kg (配对 T 检验方法/M). 006)。临床基线一致的10头同期非造模健康猴造模前体重4. 7270kg士0. 72483kg，造模后体重 5.1520kg士0. 8099kg。部分生化指标变化情况 4.3.1 T3指标变化情况
动物造模后T3 (nmol/L)指标明显下降。肾虚造模后T3下降的幅度较脾虚造模的幅度大，并与造模强度和临床症状密切相关。可能为中医肾虚证特异性指标。造模动物中(n=30) T3指标在中医肾虚造模前均数为6. 02士 1. 09，造模后均数为 2. 65 士 0.49 Od=O. 000)。指标变化情况
动物造模后T4 (nmol/L)指标出现水平波动。造模动物中(n=20) T4指标在中医肾虚造模前均数为112. 4 士 36. 0，造模后均数为 103. 2士 19. 4 (.P=Q. 676)。指标变化情况
动物造模后T (nmol/L)指标出现水平波动，变化未显示特异性。造模动物中(n=20) T指标在中医肾虚造模前均数为0. 31 士0. 09，造模后均数为 0. 21 士 0. 12。指标变化情况
动物造模后E2 (pmol/L)指标出现水平波动，整体水平较造模前有所升高。造模动物中(n=20) E指标在中医肾虚造模前均数为39. 4士23. 4，造模后均数为 78. 84 士 12. 9。指标变化情况
动物造模后Cor (nmol/L)指标出现水平波动，整体水平较造模后下降，已经下降到参考范围下限以下，为肾虚模型特异性指标之一。造模动物中(n=20) Cor指标在中医肾虚造模前均数为1181. 8士360. 4，造模后均数为529. 78士 149. 47。整体水平下降非常显著。指标变化情况
动物造模后ACTH (pmol/L)指标出现水平波动，整体水平较造模后明显下降。但该指标仍在正常动物参考范围内，临床意义有待进一步研究。该指标是属于水平波动还是可以作为肾虚模型特异性指标，尚待进一步研究。造模动物中(n=20) ACTH指标在中医肾虚造模前均数为19. 2 士 8. 8，造模后均数为 10. 8 士 3. 3。指标变化情况
动物造模后cAMP (pmol/L)指标出现水平波动，但该指标仍在正常动物参考范围内，临床意义有待进一步研究。造模动物中(n=20)cAMP指标在中医肾虚造模前均数为42. 1 士 9. 3，造模后均数为 35. 87士 18. 49，下降水平接近正常动物参考范围的下限。指标变化情况
动物造模后cGMP (pmol/L)指标出现下降趋势，但该指标仍在正常动物参考范围内，临床意义有待进一步研究。该指标是属于水平波动还是可以作为肾虚模型特异性指标，尚待进一步研究。造模动物中(n=20) cGMP指标在中医肾虚造模前均数为9. 95 士 2. 85，造模后均数为5. 62士2. 12，下降水平接近参考范围的下限。指标变化情况
动物造模后IL-2 (ng/mL)指标出现正常水平波动。造模动物中(n=20) IL-2指标在中医肾虚造模前均数为2. 64士 1. 08，造模后均数为 3. 96 士 0. 90。指标变化情况
动物造模后IL-6 (ng/mL)指标出现水平波动，整体呈上升趋势，可能为复合模型的特异性指标。造模动物中(n=20) IL-6指标在中医肾虚造模前均数为74. 2 士 20. 1，造模后均数为 82. 22 士 28. 08。指标变化情况
动物造模后BMG ( μ g/mL)指标出现水平波动，但该指标仍在正常动物参考范围内，临床意义有待进一步研究。该指标是属于水平波动还是可以作为肾虚模型特异性指标，尚待进一步研究。造模动物中(n=20) BMG指标在中医肾虚造模前均数为0. 57 士 0. 13，造模后均数为 0. 83 士 0. 14。指标变化情况
动物造模后TNF (ng/mL)指标出现水平波动。但该指标仍在正常动物参考范围内，临床意义有待进一步研究。该指标是属于水平波动还是可以作为肾虚模型特异性指标，尚待进一步研究。
造模动物中(n=20)TNF指标在中医肾虚造模前均数为2. 41 士0. 74，造模后均数为 2. 98 士 0. 68。血浆病毒载量和⑶4计数、⑶4/⑶8比值
中医肾虚SIV复合模型病毒构建后每2周收集标本，用RT-PCR方法测定病毒载量，证实了本发明使SIV病毒在该动物模型中复制。复合模型造模后病毒载量变化，为复合模型特异性指标。中医肾虚SIV感染复合模型构建前后血浆病毒载量与正常状况下感染自然症候观察组比较差别不显著，但⑶4计数结果比正常感染恒河猴计数低，而且⑶4/⑶8复合模型倒置严重，具统计学差异，证实肾虚造模后能加重SIV感染病情。血浆病毒载量
造模动物中(n=20)病毒载量对数指标在造模前为0，造模后均数为4. 2315士 1. 08221。动物造模后⑶4%出现下降，而且幅度较大，与造模和临床相关，为中医肾虚SIV感染复合模型特异性指标。造模动物中(n=20)⑶4%指标在造模前均数为27. 08士7.观811，造模后均数为 16.009士7. 51131。比值
动物造模后⑶4+/⑶8+比值出现下降，而且幅度较大，与造模和临床相关，为中医肾虚 SIV感染复合模型特异性指标。造模动物中(n=20) CD4+/CD8+比值指标在造模前均数为1. 5695士0. 72369，造模后均数为 0. 8905 士 0. 43173。中药反证实验
肾虚复合模型非治疗组死亡比例4/4，同期病毒模型对照死亡比例4/10。补肾治疗方案死亡比例1/15，清热解毒死亡比例7/15，同期病毒模型对照死亡比例4/10，差异有统计学意义。数据说明，采用补肾方案死亡率最低，应该是艾滋病治疗的关键。模型具体应用
5. 1 造模后观察肾虚证对艾滋病感染急性期病毒高峰的改变，毒血症的病理变化，观察药物或疫苗的预防效果，特别是观察早期应用中药对疾病进程的影响，为临床窗口期的中医药治疗提供依据。5. 2 SIV感染早期模型的应用观察证候对艾滋病进展的相关性和病理机制，观察中药或西药的药代动力学、疗效或疫苗的效果，较普遍适用。5. 3 SIV感染中、后期模型的应用观察中药或中西药联合应用的药代动力学和疗效，特别是中医药对艾滋病患者全身状况的变化，病毒载量的下降，免疫学改善的影响及中药对HAART治疗减毒增效的研究。5. 4不同时期淋巴结病理学活检观察中医证候演变与艾滋病病情轻重形态学指标的相关性。通过治疗前后的对比，可以清楚知道抗艾滋病药物的疗效和药效维持时间的长短；运用免疫组织化学的方法，可以测出幼稚淋巴细胞的再生的情况，具有说服力。实施例2 第二种构建中医肾虚证艾滋病猴模型的方法和用途
权利要求
1.一种构建中医肾虚证艾滋病猴模型的方法，其特征在于选择健康成年雄性恒河猴， 经血清学检测猴艾滋病病毒SIV，猴逆转录D型病毒(SRV)和猴T淋巴细胞性I型病毒 (STLV-I)抗体阴性，无中医肾虚、气虚症状体征；采用的毒株为SIVmac239病毒株，经健康猴PBMC体外扩增；连续使用生大黄浓缩液灌胃，同时肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸泼尼松龙造肾虚证；生大黄浓缩液为将生大黄粉碎成的粗粉加沸水煎煮，制成ImL=Ig生药的浓缩液，灌胃平均剂量是0.5 g/kg.d至4.0 g/kg.d;肌肉注射利血平的平均剂量是0.03 mg/kg. d M0. 10 mg/kg. d ；肌肉注射醋酸泼尼松龙的平均剂量是3. 0 mg/kg. d至6. 0 mg/ kg. d ；造成中医肾虚模型所需平均时间是4周；采用静脉注射方式进行病毒接种，接种量为 1 :(1000-5000)。
2.根据权利要求1所述的构建中医肾虚证艾滋病猴模型的方法，其特征在于用放射免疫学方法检测三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)、促甲状腺素(TSH)、睾酮(T)、雌二醇(E2)、皮质醇(Cor)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、环腺苷酸(cAMP)、环鸟苷酸 (cGMP)、白介素2 (IL-2)、白介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)等指标，用比色法测定 D-木糖；每1-2周收集标本，接种CEMX174细胞，进行病毒分离；用RT-PCR方法测定体液和组织内的SIV病毒载量；用流式细胞术测定模型动物的淋巴细胞亚群数据，包括CD4、CD3、 CD8计数；用活检方法取模型动物的淋巴结，福尔马林固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，染色，进行病理形态及半定量分析；中医肾虚证艾滋病猴模型指标体系中的主要特异性指标为三碘甲状腺原氨酸(T3)、皮质醇(Cor)、白介素6 (IL-6)、病毒载量、⑶4、⑶4 / CD8比值。
3.根据权利要求1或2所述的构建中医肾虚证艾滋病猴模型的方法，用于肾虚造模后观察中医证候积分。
4.根据权利要求1或2所述的构建中医肾虚证艾滋病猴模型的方法，用于研究艾滋病的中医病因、病机和证候。
5.根据权利要求1或2所述的构建中医肾虚证艾滋病猴模型的方法，用于抗艾滋病中药和复方的药效评价。
全文摘要
本发明公开了一种构建中医肾虚证艾滋病猴模型的方法及用途。在现有艾滋病实验动物中猴子最接近人类，发明人应用两种方法都成功地构建了恒河猴艾滋病病毒感染中医肾虚证复合模型。第一种方法是连续使用生大黄浓缩液灌胃，同时肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸泼尼松龙造肾虚证后经静脉注射感染猴艾滋病病毒。第二种方法是先经静脉注射感染猴艾滋病病毒，然后连续使用生大黄浓缩液灌胃，同时肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸泼尼松龙造肾虚证。通过了解艾滋病病毒在肾虚证模型体内感染过程、发病过程、病理变化，以研究包括感染的靶器官、靶组织和靶细胞,对免疫系统的攻击,免疫系统细胞的反应，中医证候的演变规律等。通过所建立的中医肾虚证艾滋病病毒感染猴复合模型，对于研究艾滋病中医发病机理、证候学演变，评价抗艾滋病中药和复方的药效有着不可替代作用。
文档编号A61K49/00GK102210754SQ20111012046
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月11日 优先权日2011年5月11日
发明者何金洋, 刘抗伦, 刘政, 周红燕, 张苗苗, 李志强, 李茂清, 符林春, 胡英杰, 胡董仁, 董伯振, 陈津岩, 陈芝喜 申请人:广州中医药大学