专利名称：低分子量银耳多糖的制备方法及其医药新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有治疗萎缩性胃炎和可作为肿瘤治疗辅助药物的低分子量银耳多糖，具体地说，是涉及低分子量银耳多糖的制备方法及其医药用途，属于中药领域。
背景技术：
银耳(Tremella fueiformis Berk)又名白木耳，为担子菌纲银耳科银耳的干燥子实体，为常用保健药品，具有滋阴润肺的功效，已有几百年的药用历史。其主要化学成分为多糖类化合物。还含有脂类、蛋白类(酶、蛋白质、氨基酸)无机盐、维生素B族等。银耳多糖主要为酸性杂多糖，分子量在60万左右；主要由木糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖醛酸构成，其主链为1-3连接的甘露糖组成；在主链的2，4和6位具有分支点，连接着由葡萄糖、甘露糖、木糖、岩藻糖组成的侧链；其非还原末端主要为葡萄糖醛酸构成。大量的化学和药理实验证明，银耳多糖具有明显的抗辐射，升高白细孢、降血糖、抗溃疡、增强免疫、 抗肿瘤、对抗放化疗的毒副作用等活性；急性毒性和长期毒性研究表明，该多糖口服或注射给药均未见明显的毒副作用。银耳多糖易溶于热水，微溶于低浓度的乙醇，不溶于高浓度的乙醇等有机溶剂，其水溶液成透明粘稠状。银耳多糖在体内的吸收、分布和代谢研究结果表明，其口服吸收利用率极低(> )，静脉给药时银耳多糖提高免疫功能、升白、抗癌的作用明显高于口服给药。但由于银耳多糖分子量大，结构复杂，其水溶液还具有一定的粘稠性，作为新药研发，无论口服或静脉给药，都会影响其体内吸收和分布、质量的评价、控制和作用机理的探讨。因此本专利对银耳多糖进行降解，制备结构相对简单、分子量小、水溶性好的片段，通过药效学试验研究，口服给药显示出明显的药理活性作用，该实验结果不仅对其银耳多糖新药研发和应用具有重要的意义，同时对于总结低分子量银耳多糖的构效关系，以及作用机理的探讨都起到了推动作用。慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是常见的胃部疾病，属于中医胃脘痛范畴，多由慢性胃炎进一步发展产生，严重影响患者的工作和生活，且与胃癌的发生有密切的关系，1978年WHO将该病列为胃癌的癌前状态，在其基础上伴发的不完全型肠上皮化生及中、重度异常增生被视为癌前病变。目前对该病的防治日益引起人们的关注，但尚未有有效的治疗方法和药物。恶性肿瘤是严重威胁人类生命的疾病，近年来恶性肿瘤的发病率不断提高，对肿瘤治疗药物的需求也在不断的增长。目前临床主要应用放、化疗的方法治疗，化疗时的的抗肿瘤药物主要为细胞毒类药物。无论是放疗还是化疗，对机体的正常生长发育和代谢均有明显的影响，具有明显的毒副作用。因此筛选和研发具有对抗放化疗毒副作用或对放、化疗具有增效作用的药物，在肿瘤治疗中具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供了一种由银耳通过酸水解、超滤等制备低分子量银耳多糖的方法，表征了该多糖的理化性质和平均结构，研究了该多糖对荷瘤鼠放、化疗时的降低毒副作用、增加放、化疗疗效的“减毒增效”作用，也研究了低分子量银耳多糖对慢性萎缩性胃炎的治疗作用，并以该发明为基础制备的用于肿瘤和慢性萎缩性胃炎治疗的药物制剂。本发明的创新点之一是在于制备低分子量银耳多糖时采用了酸水解的方法。以往的制备多糖制备传统方法多采用水提取和乙醇分级沉淀的方法，此种方法制备银耳多糖操作困难，制备的多糖分子量和粘度较大。在本发明中我们增加了酸水解的步骤，通过改变酸水解时酸的浓度和水解时间制备出的不同分子量的低分子量银耳多糖，为银耳多糖的制备提供了一种新的方法。本发明的创新点之二是提供了从银耳中制备的低分子量的银耳多糖，并表征了它们的平均结构。低分子量银耳多糖具有结构相对简单、水溶性好、有利于口服吸收、活性高等特点，有利于其开发、应用和对其产品的质量控制。本发明的创新点之三是提供了低分子量银耳多糖在对肿瘤和萎缩性胃炎治疗时的用途。本发明是通过如下技术方法实现的。一.实验方法1.通过酸水提取，直接制备低分子量银耳多糖银耳以清水洗净、浸泡，膨胀后去除杂质，摘除底座，勻浆后加入酸水(不同浓度的盐酸、硫酸或三氟乙酸溶液)溶液，在一定的温度和压力下以酸水提取1-3小时，酸水提取液以碱水(氢氧化钠、氢氧化钙等的水溶液)中和至中性，离心，上清液浓缩至适当体积，通过截留分子量不同的超滤膜，得到不同分子量的银耳多糖；或通过乙醇分级沉淀的方法，制备不同分子量的银耳多糖。为了验证本发明，我们分别选择分子量为1250道尔顿的低分子量银耳多糖(A)和分子量为4800道尔顿的低分子量银耳多糖(B)为代表对制备低分子量银耳多糖的方法、理化性质分析、测定以及药效进行表述。本发明所用银耳均是符合山东省药材标准，具有法定标准。2.不同分子量银耳多糖的理化性质分析理化性质分析和化学结构表征的样品分子量为1250道尔顿的银耳多糖(A)、分子量为4800道尔顿的银耳多糖(B)。2. 1蛋白质、总糖、糖醛酸的含量测定蛋白质、总糖和糖醛酸的含量测定分别采用Lowry法(1)、酚-硫酸法O)、 m-hydrobiphenol(3)方法测定，结果表明，样品(A)和(B)的总糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量分别为 82%U1%>2. 禾口 85%U0. 2%,3. 5%02.2分子量的测定分子量测定采用高效液相色谱法色谱条件与系统适应性试验用OHpak SB-802. 5HQ (8mmX 300mm)凝胶柱；0. 7%硫酸钠溶液为流动相；柱温35°C，流速0. 5ml/min ；示差折光检测器，理论板数按葡萄糖峰计算，应不小于5000，标样为已知分子量的Dextran T180, T1000, T5000, T12000, T25000的葡聚糖。测定法取本品10mg，加2ml流动相溶解，0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取20 μ 1注入色谱仪，记录色谱图，采用GPC多糖专用软件处理。结果以重均分子量表示。2. 3组成糖分析
组成糖分析采用还原乙酰化方法2. 3. 1试剂与仪器标准品Fuc (岩藻糖)、Iiha (鼠李糖)、Ara (阿拉伯糖)、Xyl (木糖)、Man (甘露糖)、foil (半乳糖)、Glu (葡萄糖)、GalA (半乳糖醛酸)GlcA (葡萄糖醛酸)、均购自Sigma 公司，纯度为99%。气相色谱为温岭福立分析仪器公司GC-9790及N-2000双通道色谱工作站，1 % 0V-225不锈钢填充柱(02mmX2m)。2. 3. 2糖醇乙酸酯衍生物的制备精称不同分子量银耳多糖各5mg，置具塞试管中，加2mol/L三氟乙酸lml，密封，置 121°C水解1. 5小时，吹干。加lmol/L氨水0. 5ml，加硼氢化钠20mg室温反应1. 5小时，吹干。残渣加10%醋酸甲醇溶液1ml，吹干。分别加0. 5ml吡啶，Iml醋酸酐密封，置121°C烘箱中3小时，，吹干，残渣加3ml水溶解，加Iml氯仿萃取，氯仿层吹干，残渣加少量丙酮溶解，作为供试品溶液。另取岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸标准品按供试品制备方法操作，制成对照品溶液。分别取1 μ 1注入气相色谱仪，以0V-225为固定液，柱温为195°C，进样器和检测器(FID)均为250°C， N2 :10mL/min。通过与标准乙酰化单糖气相图谱的比较，确定多糖中的单糖组成。结果表明低分子量银耳多糖的组成糖主要由甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸。3.不同分子量银耳多糖化学结构表征不同分子量银耳多糖的化学结构分析采用甲基化的方法进行；3. 1试剂与仪器气质联用仪(GC-MS)为Agilent公司的6890N/5973MSD，DB-One石英毛细管柱 (30m X0. 25mm)。3. 2Na0H-DMS0 混悬液制备4A分子筛于对01烘干池，放凉后加入DMSO密封搅拌过夜。称取IgNaOH，加入ImL 水溶解，加入ImL脱水DMSO搅拌，离心。重复此操作10-15次。沉淀加入ImL脱水DMS0，充氮气密封搅拌过夜，备用。3. 3甲基化样品IOmg真空干燥Mh，加入脱水DMSO 0. 5mL，充氮气密封搅拌过夜。加入 0. 5mLNa0H-DMS0混悬液，充氮气密封搅拌他，加入0. 3mL碘甲烷，充氮气搅拌密封10h。搅拌下室温以氮气吹尽剩余的碘甲烷，加2mL水终止反应。加3mL氯仿，搅拌离心，弃去水层， 氯仿层用水洗脱2次。吹干氯仿层，得全甲基化多糖。3. 4水解还原乙酰化将全甲基化样品加2mol/L三氟乙酸1ml，密封，置121°C水解1. 5小时，吹干。残渣加lmol/L氨水0. 5ml，加硼氢化钠10mg，室温还原1. 5小时，吹干。残渣加10%醋酸甲醇溶液1ml，吹干。分别加0. 5ml吡啶，Iml醋酸酐密封，置121°C烘箱中3小时进行水解，水解液放冷后吹干，残渣加3ml水溶解，加Iml氯仿萃取，氯仿层吹干，残渣加少量丙酮溶解，作为供试品溶液，进行GC-MS分析。分析条件DB-One石英毛细管柱(30mX 0. 32)，进样口温度250°C。柱温120°C保持5min，5°C /min升到220°C。进样量0. 2 μ L。根据保留时间和质谱碎片峰，确定糖的种类和糖苷键的连接方式。
结果表明，低分子量银耳多糖的糖苷键连接方式主要有l一3、l一2，3连接甘露糖，木糖、葡萄糖醛酸为非还原末端。
4．药效学研究
药效学研究选择了两个样品重均分子量为1250D的银耳多糖(A)、重均分子量为4800D的银耳多糖(B)。
4．1减毒增效实验
4．1．1药物
低分子量银耳多糖2个样品(A、B)，用0．5％羧甲基纤维素钠配制为不同浓度；注射用环磷酰胺上海华联制药有限公司生产，批号20101020，规格200mg／支，以氯化钠注射液配成不同浓度的溶液，现用现配。
4．1．2动物
昆明种小鼠，6—8周龄，体重18—22g，雌雄兼用(每批实验采用同一性别，实验前在实验室常规饲养三天)，合格证号SCXK一(吉)2007—0003，由吉林大学实验动物中心提供。
4．1．3细胞株
小鼠肉瘤STRO瘤株由吉林省肿瘤研究所提供，经本实验室传代保存。
4．1．4动物分组及给药方案
将小鼠按体重随机分为下列15组
正常对照组给予0．5％羧甲基纤维素钠
阳性药小剂量组给予C／X 10mg／kg
阳性药大剂量组给予C／X 20mg／kg
阳性药小+样品A小剂量组给予C／X 10mg／kg+样品A 100mg／kg
阳性药小+样品A中剂量组给予C／X 10mg／kg+样品A 200mg／kg
阳性药小+样品A大剂量组给予C／X 10mg／kg+样品A 400mg／kg
阳性药小+样品B小剂量组给予C／X 10mg／kg+样品B 100mg／kg
阳性药小+样品B中剂量组给予C／X 10mg／kg+样品B 200mg／kg
阳性药小+样品B大剂量组给予C／X 10mg／kg+样品B 400mg／kg
阳性药大+样品A小剂量组给予C／X 20mg／kg+样品A 100mg／kg
阳性药大+样品A中剂量组给予C／X 20mg／kg+样品A 200mg／kg
阳性药大+样品A大剂量组给予C／X 20mg／kg+样品A 400mg／kg
阳性药大+样品B小剂量组给予C／X 20mg／kg+样品B 100mg／kg
阳性药大+样品B中剂量组给予C／X 20mg／kg+样品B 200mg／kg
阳性药大+样品B大剂量组给予C／X 20mg／kg+样品B 400mg／kg
药物组及正常对照组均采用口服给药，CTX组采用腹腔注射，每曰给药1次，给药容量为0．2ml／10g，共lo—15天。
4．1．5方法
按抗肿瘤药物实验方法制备体内移植性肿瘤模型“．2’，取接种于昆明种小鼠第7天的肉瘤STRO腹水，在无菌条件下配制成瘤细胞悬液，调整活细胞数为l×10‘／ml，接种于昆明种小鼠左腹股沟皮下，每只小鼠接种0．2ml。末次给药后24小时颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，取瘤并称重，比较单纯应用CTX 10、20mg/kg治疗组与加用银耳多糖100、200、400mg/kg组之间抑瘤率的差异，观察低分子量银耳多糖的增效作用β]。称量各组动物体重、胸腺重、肝重及脾重，计算脏器指数，按常规方法M计数外周血白细胞数，观察低分子量银耳多糖的减毒作用。4. 1. 6 结果三批试验结果表明，CTX 10mg/kg组对小鼠肉瘤S18tl的平均抑瘤率为35. 4%，加用低分子量银耳多糖样品A 100、200、400mg/kg组的平均抑瘤率分别为47. 3%,52. 7%及 53. 9%，样品 B 100、200、400mg/kg 组的平均抑瘤率分别为 44. 4%、46. 5%及 48. 6%。CTX 20mg/kg组对小鼠肉瘤S18tl的平均抑瘤率为66. 3%，加用低分子量银耳多糖样品A100、200、 400mg/kg组的平均抑瘤率分别为79. 0%,79. 8%及81. 9%，样品B 100、200、400mg/kg组的平均抑瘤率分别为75. 3%、73. 7%及76. 5%。此外，CTX 10mg/kg及20mg/kg组在抑瘤同时可见动物体重、免疫器官指数及白细胞总数均明显下降，与对照组比较差异显著(P < 0. 05 或ρ <0.01)。低分子量银耳多糖样品A、样品B与CTX合用可不同程度对抗其引起的体重及白细胞下降，提高小鼠免疫器官指数，与相应CTX组比较差异显著(ρ < 0. 05或ρ < 0. 01)， 见表1、2。表1低分子量银耳多糖对环磷酰胺治疗小鼠肉瘤S180的增效作用(三批试验平均值，χ士 S)
权利要求
1.一种由银耳子实体制备的低分子量银耳多糖，其特征在于银耳洗净、浸泡，膨胀后去除杂质，摘除底座，勻浆后加入酸水溶液，在一定的温度和压力下以酸水提取1-3小时， 酸水提取液以碱水中和至中性，离心，上清液浓缩至适当体积，通过截留分子量不同的超滤膜或乙醇分级沉淀的方法，制备不同分子量的银耳多糖。
2.根据权利要求1所述的低分子量银耳多糖，其特征在于，分子量分布范围为 500-10000道尔顿；组成糖主要由甘露糖、木糖和葡萄糖醛酸组成，其中的糖苷键连接方式主要有1 — 3、1 — 2，3连接甘露糖为主链，木糖、葡萄糖醛酸为非还原末端。
3.—种药物制剂，其特征在于含有权利要求2所述的治疗有效量的低分子量银耳多糖和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
4.根据权利要求2所述的低分子量银耳多糖，在制备治疗慢性萎缩性胃炎的药物中的应用。
5.根据权利要求2所述的低分子量银耳多糖，在制备肿瘤治疗辅助药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种由银耳中制备的低分子量银耳多糖的方法以及低分子量银耳多糖用于慢性萎缩性胃炎的治疗及其作为肿瘤治疗辅助药物方面的用途。低分量银耳多糖的制备方法是银耳净制、匀浆后加入酸水溶液，在一定的温度和压力下以酸水提取1-3小时，酸水提取液以碱水中和至中性，离心，上清液浓缩至适当体积，通过截留分子量不同的超滤膜或乙醇分级沉淀的方法制备而得。将本发明制备的低分子量银耳多糖进行慢性萎缩性胃炎的治疗和肿瘤治疗辅助药物方面的药效学研究，药效良好。
文档编号A61K31/715GK102161710SQ20111012522
公开日2011年8月24日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者姜瑞芝, 睢大筼, 陈英红, 高其品, 高阳 申请人:高其品