银耳杂多糖及其提取物、制备方法和用途的制作方法

专利名称：银耳杂多糖及其提取物、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种银耳杂多糖及其制备方法和用途。
背景技术：
银耳(Tremella fuciformis Berk)，又称白木耳、桑鹅(《清异录》)，属银耳目(Tremellales)，银耳科(Tremellacease)，银耳属(Tremella)。银耳杂多糖是从银耳子实体或微生物发酵液中提取分离的一种杂多糖。中国自古以来将银耳称之为高级补品和药品，药食两用之佳品，是宫廷上等进补食品。但对其组成和结构以及对应的功能却很少有报导。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种银耳杂多糖。
该银耳杂多糖，其结构以α-(1-3)甘露糖为主链，主要由重量百分比为70-93％的中性总糖、6-28％的葡萄糖醛酸、0.1-3％的结合蛋白组成；该银耳杂多糖的平均分子量为85-160万道尔顿，其中分子量大于6000道尔顿的占90％(重量)以上。
其中，该中性总糖主要包括下列含量的糖基35-60％甘露糖、10-25％岩藻糖、8-18％木糖和5-15％葡萄糖，上述含量是以银耳杂多糖重量计。
该银耳杂多糖的侧链有多种不同的变化组合，其中的一种组合已通过X光衍射方法测定为如下结构式I所示的结构单元，该结构单元的分子量为2578.5或2724.7。

(接下行)(接上行)

该糖结构是以α-(1-3)甘露糖(Manp)为主链骨架，其2位碳原子上连有2个β-(1-2)木糖(Xylp)，3个β-葡萄糖醛酸(GlcAp)，1或2个岩藻糖(Fuc)，1个甘露糖为侧链。
本发明银耳杂多糖的一些其它特征指标和检测方法简述如下表

本发明的另一目的是提供一种银耳杂多糖提取物，该银耳杂多糖提取物中各组分的百分含量(W/W)为本发明银耳杂多糖80-98％、游离蛋白0.1-3.3％、灰分0.5-8％。该银耳杂多糖提取物的平均分子量为75-140万道尔顿，其中分子量大于6000道尔顿的占75-98％(重量)。
本发明银耳杂多糖提取物的一些其它特征指标和检测方法简述如下表

本发明的又一目的是提供一种本发明银耳杂多糖提取物的制备方法，该制备方法包括如下步骤1)将银耳子实体原料用水在80-100℃下搅拌提取得粗提液；2)将步骤1)所得的粗提液进行过滤，滤液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；3)在步骤2)所得的滤液中加入乙醇，使乙醇的最终体积浓度为50-85％，收集沉淀；4)将步骤3)所得的沉淀干燥。
其中，该银耳子实体原料为干燥的银耳子实体原料，将该干燥的银耳子实体原料用水浸泡、膨胀并清洗干净(包括去黄褐色基部)，每次用20-100倍、多次提取时不超过200倍(重量)于该干燥的银耳子实体原料量的水在80-100℃下搅拌提取得粗提液。
该银耳子实体原料也可以为新鲜银耳子实体原料、保鲜冷藏的新鲜银耳子实体原料或冷冻的新鲜银耳子实体原料，将该银耳子实体原料去黄褐色基部并清洗干净，每次用2-15倍、多次提取时不超过30倍(重量)于该银耳子实体原料量的水在80-100℃下搅拌提取得粗提液。
其中，在步骤1)中将银耳子实体原料用水在80-100℃下搅拌单次提取1-4小时得粗提液；也可以多次提取，合并每次所得的提取液得粗提液，多次提取总时间为＞1小时，≤5.5小时。
步骤2)所得的滤液若不粘稠还可以进一步浓缩，得浓缩液，再将得到的浓缩液用于步骤3)。
在步骤3)中将步骤2)所得的滤液加入乙醇时予以搅拌。
将步骤3)所得的沉淀可用95-100v/v％的乙醇脱水脱色。
所说的干燥可以是80℃以下的各种常规干燥方法，一般为-40℃～80℃的真空干燥、热干燥、热风干燥或冷冻干燥；较佳地是40～80℃的真空干燥、热干燥或热风干燥，或-40℃的冷冻干燥。
上述制备方法如以干燥的银耳子实体为原料则使用方便，便于原料储存和运输；用水浸泡干燥的银耳，并使其膨胀，通过浸泡，使银耳子实体细胞充分地吸涨水分子，有利于银耳中的杂多糖自然渗出，既提取创造了条件，也可以缩短提取时间；而加20-100倍(多次提取总水量不超过200倍)于干料的水提取，为干燥的银耳子实体杂多糖渗出和溶于提取液中的最佳条件，尽管试验显示加小于20倍于干料的水提取也能获得少量本发明产品，但由于提取液十分粘稠，给操作带来不便，产品收率也很低；同时尽管试验也显示加大于100倍(多次提取总水量超过200倍)于干料的水提取也能获得本发明的产品，但由于提取液中的杂多糖比例过低，会大大增加能耗或大大增加沉淀用酒精的使用量；如使用新鲜的银耳子实体为原料，可避免银耳在干燥过程对银耳杂多糖的破坏，省略了水浸泡的步骤，提高了生产效率；使用保鲜冷藏的银耳子实体为原料，则便于原料储存和短距离运输，在短时期内可以防止新鲜银耳变质；若使用经低温冷冻的新鲜银耳子实体为原料，可便于原料长期储存和长距离运输，同时由于低温速冻会产生部分银耳细胞壁破裂，使杂多糖更容易渗出，可提高提取效率；加2倍-15倍(多次提取总水量不超过30倍)于鲜料的水提取，为新鲜银耳子实体杂多糖渗出和溶于提取液中的最佳条件，尽管试验显示加小于2倍于鲜料的水提取也能获得少量本发明的产品，但由于提取液十分粘稠，给操作带来不便，产品收率也很低；同时尽管试验也显示加大于15倍(多次提取总水量超过30倍)于鲜料的水提取也能获得本发明的产品，但由于提取液中的杂多糖比例过低，会大大增加能耗或大大增加沉淀用酒精的使用量；本发明中所说的多次指≥2次。
本发明的产品为大分子多糖，采用加温提取(80℃-100℃水温提取)，既可以使大分子多糖快速溶出，缩短了提取时间，又可以使银耳中的游离杂蛋白变性产生沉淀，提高了产品的纯度。
该提取时间为获得平均分子量85万以上银耳杂多糖的关键。因为单次加热搅拌提取时间低于1h，获得的银耳杂多糖的平均分子量将小于85万(即使可以获得，收率也十分低)；单次加热搅拌提取时间超过4h，由于连续加温提取会使大分子的银耳杂多糖产生裂解(平均分子量将小于85万，1.7％本发明产品水溶液的粘度将小于20pa.s)，导致不能获得大分子的多糖(或者平均分子量大于85万的大分子多糖的收率很低，不适合规模化生产)；多次反复提取总提取时间超过5.5小时，在5.5小时以后提取获得的银耳多糖的平均分子量将小于85万(即使可以获得，收率也十分低，将影响提取效率)。经常规过滤后，最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器过滤，可以去除变性沉淀的蛋白质和银耳残渣，可以提高提取纯度和本发明产品水溶液的透明度。
均匀搅拌可以使滤清液或其浓缩液和乙醇充分混合反应，当混合液体的乙醇最终浓度为50％以下时无法产生多糖沉淀(或者收率十分低，不适合规模化生产)；当混合液体的乙醇最终浓度为85％以上时，酒精用量过大不适合规模化生产，同时也不利于控制多糖沉淀物中的杂质或小分子物，影响产品纯度。
由于大分子多糖具有优异的吸水性能，所以用95％-100％乙醇脱水，有利于缩短干燥时间，降低干燥温度，同时95％-100％乙醇具有脱色性能，可使产品色泽更白；80℃以下低温干燥，不会使产品降解变性，同时能保持产品外观洁白。
本发明的再一目的是提供另一种本发明银耳杂多糖提取物的制备方法，其包括如下步骤1)将按照常规微生物发酵方法(参考文献①银耳深层发酵条件的研究，吴大康等；食品科学；2002，Vol.23，No.1；64；②银耳菌分离方法的研究，张炳炽；中国食用菌；Vol.13，No.3；22)获得的银耳发酵液加热至80-100℃、保温0.5-2小时，过滤，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器得滤液；2)在步骤1)所得的滤液中加入乙醇，使乙醇最终体积浓度为50-85％，收集沉淀；3)将步骤2)所得的沉淀进行干燥。
其中，步骤1)中的过滤可为常规方法，如板框过滤，过滤时可以加入硅藻土等助滤剂。
步骤2)、3)的较佳方式如上述。
上述制备方法中使用微生物发酵获得的银耳发酵液为原料，使银耳多糖的原料来源和工艺更加稳定，减少了对天然或养殖的银耳资源的依赖，避免了银耳子实体的干燥过程对银耳杂多糖的破坏，省略了水浸泡干燥的银耳子实体的步骤，省略了加热提取的步骤；将微生物发酵获得的银耳发酵液，加温80℃-100℃，0.5h-2h，既可杀灭银耳发酵液中的菌丝体和微生物，又可以使发酵液中的游离杂蛋白变性沉淀，有利于提高产品纯度；常规过滤(可以加硅藻土等助滤剂)、弃滤渣，清液最终通过孔径为0.1-1μm以下过滤器，可以过滤银耳发酵液中的菌丝体和变性沉淀的蛋白质以及其它杂质，有利于提高产品纯度。
本发明的又一目的是提供本发明银耳杂多糖的制备方法，其包括将采用上述制备方法制得的提取物进一步纯化的步骤。
其中，该纯化采用Sevag法及透析法来实现。当然，如本领域技术人员所知，其它的多糖纯化方法，如色谱分离法等也能制得本发明银耳杂多糖。
本发明的另一目的是提供本发明银耳杂多糖及其提取物的应用。
本发明的银耳杂多糖及其提取物具有保湿、润滑、清除自由基和抗衰老等抗氧化、抗过敏、增稠稳定体系等作用，而且该银耳杂多糖及其提取物性能及状态稳定；可广泛地应用于化妆品、个人护理用品、日化用品、食品、保健食品和药品等领域。


图1为本发明银耳杂多糖的红外光谱图。
图2为本发明银耳杂多糖中蛋白的凝胶柱层析法鉴定图。
图3为本发明银耳杂多糖中蛋白的β消除反应法鉴定图。
图4为本发明银耳杂多糖抑制氧自由基能力测定图。
图5为银耳杂多糖与皮肤细胞SOD活性的关系图。
图6为银耳杂多糖与对照样品的保湿能力对比图。
图7为银耳杂多糖与对照样品的饮用润滑感对比图。
图8为银耳杂多糖与对照样品的涂抹润滑感对比图。
图9为银耳杂多糖抑制痛痒效果图。
图10为银耳杂多糖抑制过敏斑点效果图。
具体实施例方式
实施例1将干燥的银耳子实体用水浸泡，膨胀后，去其黄褐色基部并清洗干净；把洗净后的原料放入提取罐中，加20倍于干料的水，80℃水温下搅拌提取1h，然后过滤，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为50％，收集沉淀，用95％乙醇脱水脱色，收集沉淀；80℃热风干燥，粉碎。产品收率1.5％(以干银耳重量计)。
实施例2将干燥的银耳子实体用水浸泡，膨胀后，去其黄褐色基部并清洗干净；把洗净后的原料放入提取罐中，加40倍于干料的水，90℃水温下搅拌提取2h，并收集提取液；将原料重复再次提取2h、然后合并提取液过滤，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为70％，用95％乙醇脱水脱色，收集沉淀；40℃真空干燥，粉碎。产品收率15％(以干银耳重量计)。
实施例3将干燥的银耳子实体用水浸泡，膨胀后，去其黄褐色基部并清洗干净；把洗净后的原料放入提取罐中，加100倍于干料的水，100℃水温下搅拌提取4h，然后过滤，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为85％，收集沉淀，用纯乙醇脱水，收集沉淀；-40℃冷冻干燥，粉碎。产品收率20％(以干银耳重量计)。
实施例4将干燥的银耳用水浸泡，膨胀后，去其黄褐色基部并清洗干净；把洗净后的原料放入提取罐中，加100倍于干料的水，80℃水温下搅拌提取2h，并收集提取液；再重复，将原料再提取2次(分别为2h和1.5h)，弃滤渣，然后合并提取液过滤，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；滤清液加热浓缩，得浓缩液；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为80％，收集沉淀，用95％乙醇脱水，收集沉淀；60℃真空干燥，粉碎。产品收率18％(以干银耳重量计)。
实施例5将经低温冷冻的新鲜银耳，解冻后，去其黄褐色基部并清洗干净；把洗净后的原料放入提取罐中，加2倍于鲜料的水，80℃水温下搅拌提取1h，然后过滤，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为50％，收集沉淀，95％乙醇脱水脱色，收集沉淀；-40℃冷冻干燥，粉碎。产品收率0.2％(以鲜银耳重量计)。
实施例6将新鲜的银耳，去其黄褐色基部并清洗干净；把洗净后的原料放入提取罐中，加8倍于干料的水，90℃水温下搅拌提取2h，并收集提取液；将原料再提取2h，弃滤渣，然后合并提取液过滤，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；滤清液加热浓缩，得浓缩液；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为70％，收集沉淀，用纯乙醇脱水脱色，收集沉淀；60℃真空干燥，粉碎。产品收率1.5％(以鲜银耳重量计)。
实施例7将保鲜冷藏的银耳，去其黄褐色基部并清洗干净；把洗净后的原料放入提取罐中，加15倍于鲜料的水，100℃水温下搅拌提取4h，然后过滤，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；滤清液加热浓缩，得浓缩液；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为85％，收集沉淀，用纯乙醇脱水脱色，收集沉淀；80℃热风干燥，粉碎。产品收率2.1％(以鲜银耳重量计)。
实施例8将保鲜冷藏、速冻、新鲜的银耳混合清洗，并去其黄褐色基部；把洗净后的原料放入提取罐中，加6倍于鲜料的水，100℃水温下搅拌提取2h，并收集提取液；再重复，将原料再提取2次(分别为2h和1.5h)，弃滤渣，然后合并提取液过滤，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；滤清液加热浓缩，得浓缩液；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为80％，收集沉淀，用95％乙醇脱水脱色，收集沉淀；40℃真空干燥，粉碎。产品收率1.9％(以鲜银耳重量计)。
实施例9将微生物发酵获得的银耳发酵液，加温80℃，2h，过滤，加助滤剂硅藻土，弃滤渣，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为50％，收集沉淀，用95％乙醇脱水脱色，收集沉淀；80℃热风干燥，粉碎。产品收率0.25％(以发酵液重量计)。
实施例10将微生物发酵获得的银耳发酵液，加温100℃，0.5h，常规过滤，弃滤渣，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为85％，收集沉淀，用100％乙醇脱水脱色，收集沉淀；-40℃冷冻干燥，粉碎。产品收率0.55％(以发酵液重量计)。
实施例11将微生物发酵获得的银耳发酵液，加温90℃，1.5h，加助滤剂，弃滤渣，清液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；均匀搅拌下，将滤清液和乙醇充分混合，使混合液体中的乙醇最终浓度为70％，收集沉淀，用100％乙醇脱水脱色，收集沉淀；60℃真空干燥，粉碎。产品收率0.45％(以发酵液重量计)。
实施例12将上述实施例1-11获得的银耳杂多糖提取物分别用Sevag法和透析法进行进一步的纯化得到11个本发明纯银耳杂多糖将银耳杂多糖提取物用600倍(重量)去离子水溶解，溶解后，加入200ml的氯仿∶正丁醇＝4∶1(体积比)的混合溶液，充分混合后，用离心机离心(4000r/min，30分钟)，收集上清液。将离心后的上清液与上述氯仿正丁醇混合溶液按3∶1(体积比)混合，并用离心机离心(4000r/min，30分钟)，收集上清液。重复以上操作，反复处理至水相在280nm处的OD值(使用752紫外光栅分光光度计，上海精密科学仪器厂)不再下降为止。水相减压浓缩致三分之一，浓缩液与水相3倍量(体积比)的95％乙醇充分混合，4000r/min，30分钟离心，得沉淀物。沉淀物用100倍(重量)去离子水溶解后，离心，去不溶物，将清液装入30cm长的透析袋内(透析袋可以通过5000分子量以下物质)进行透析(两头扎好吊装入有去离子水的瓶内，并使用去离子水流水冲洗12小时)，收集5000分子量以上物质。经透析后的清液与3倍量(体积)纯乙醇充分混合，再次4000r/min离心、30分钟，得沉淀物，沉淀物用无水乙醇脱水后，60℃真空干燥，获得本发明纯银耳杂多糖。
根据得率，计算出实施例1-11中各提取物分别含有的银耳杂多糖重量百分含量结果如下

结论银耳杂多糖提取物中银耳杂多糖的含量(W/W)为80％-98％。
下述“实施例12中各纯化的银耳杂多糖”即指分别由实施例1-11纯化制得的11个银耳杂多糖。
银耳杂多糖中的中件糖的重量含量检测方法地衣酚硫酸法(Francois，C.et al.，Biochem.J.83335，(1962)，以甘露糖为标准数据和结果

结论银耳杂多糖中的中性糖总含量(W/W)为70％-93％。
银耳杂多糖的组成采用硅胶为载体的薄层层析法分别用标准糖(甘露糖、岩藻糖、木糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖)作为对照，对以上实施例制备得到的银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物进行薄层层析。
薄层层析的条件展开剂丙酮∶异丙醇∶0.1摩尔乳酸＝2∶2∶1(体积比)显色剂4％苯胺丙酮溶液∶4％二苯胺丙酮溶液∶85％磷酸＝5∶5∶1结果显示银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物中均含有甘露糖、岩藻糖、木糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖及半乳糖。
中性糖成分比例分析方法气相色谱法(Gas chyromatography，GC)检测糖的成分，气相色谱仪的型号T-6890、生产产家美国安杰伦公司。
方法1、取样品5mg，加2mol/L TFA(三氟乙酸Sigma公司)4ml，在120℃封管水解2h，蒸干后取部分进行TLC分析，其余部分制备成糖醇乙酸酯，GC分析(220℃)。
2、银耳杂多糖的检测数据和结果(各种中性糖占整个银耳杂多糖的重量百分比)

结论银耳杂多糖中含有甘露糖、岩藻糖、木糖、葡萄糖，其百分含量(W/W)分别为甘露糖35％-60％、岩藻糖10％-25％、木糖8％-18％、葡萄糖5％-15％。
另外，采用气相色谱法未能测出N-乙酰氨基葡萄糖、阿拉伯糖及半乳糖，但上述薄层层析法显示银耳杂多糖中还含有微量或痕迹的N-乙酰氨基葡萄糖、阿拉伯糖及半乳糖。
银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物中的葡萄糖醛酸含量方法咔唑硫酸法(Vitriol-carbazole method)，以葡萄糖醛酸为标准。
数据和结果

结论
1)银耳杂多糖中含有葡萄糖醛酸，所占的重量比例为6％-28％。
2)银耳杂多糖提取物中含有葡萄糖醛酸，所占的重量比例为6％-26％。
银耳杂多糖成份红外光谱分析及结构分析通过红外光谱(仪器型号magna F TIR-750型，生产厂家美国Nicoletmagna IR)对银耳杂多糖进行了指纹鉴定，找出银耳杂多糖的特征峰。
测试条件红外光谱条件溴化钾压片；样品扫描次数32次；背景扫描次数32次；分辨率4；样品得率2；镜速度0.6329；孔径100.00；检测器DTGSKBR；光源IR。
数据和结果见图1。
结论从谱图中看出有多种糖的特征峰，这与前面的薄板层析与气相层析所检测出的银耳杂多糖中具有甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等8种单糖所组成的多糖是相吻合的，同时红外光谱证明了银耳杂多糖中有羟基及乙酰基存在。
1)在谱图810cm-1和870cm-1处有小的特征吸收峰，说明有α-甘露糖组分。
2)在谱图1049～1140cm-1处有吸收峰，表明为碳水化合物吸收峰。
3)在谱图1252cm-1、1723cm-1处有特征吸收峰，这证明是乙酰基特征吸收峰。
4)在谱图2932cm-1、1615cm-1、1416cm-1等处有特征吸收峰出现。
5)在谱图895cm-1(±3cm-1)处有一吸收峰，是β-葡糖醛酸特征峰。
6)在谱图3425cm-1附近是羟基特征峰说明是多聚糖。
银耳杂多糖结构鉴定分析方法将葡聚糖Dextran(型号T500，Pharmacia生产)柱(2.5cm×35cm)，先用0.1M的NaCl水溶液平衡，然后将银耳杂多糖100mg以200倍(重量)0.1M NaCl水溶液溶解并装于柱的顶部，用0.1M NaCl水溶液冲洗柱，流速每小时15ml，每管5ml进行部分收集，用薄层法鉴定，合并相同流分，取其一个流分进行透析，收集分子量在5000以上的物质，收集经透析的清液与4倍量(重量)乙醇混合，离心收集沉淀，纯乙醇洗脱二次，干燥得该银耳杂多糖中的一种杂多糖组合，将样品溶解，通过75％的甲醇水溶液处理，用纯甲醇洗脱二次，自然干燥得银耳杂多糖晶体，使用X光衍射(设备型号RASA-7R，生产商日本理学株式会社)对晶体进行结构分析鉴定并结合薄层层析、红外光谱分析、气相色谱的检测结果，以鉴定其结构。
结论该银耳杂多糖的一种组合包含上述结构式I所示的结构单元，该结构单元的分子量为2578.5或2724.7。
银耳杂多糖中蛋白的重量含量和鉴定检测方法考马斯亮蓝法(Coomassie Brilliant Blue)(BradfordMethod)，以牛血清蛋白为标准数据和结果

对实施例12中纯化的银耳杂多糖中的蛋白进行鉴定方法1)凝胶柱层析法检查糖和蛋白的洗脱峰位方法用Sephadex G75作介质，以0.15mol NaCl水溶液冲洗，对0.5％银耳杂多糖水溶液进行凝胶过滤，对其接收组分分别进行蛋白及糖成分分析。用地衣酚-硫酸法测中性总糖含量(以甘露糖作为标准)；用考马斯亮兰法(以牛血清蛋白为标准)测蛋白。
结果从图2中看出在同一组分处银耳杂多糖中的糖和蛋白都有一较高的洗脱峰位，并且是一致的。说明此组分蛋白和糖是共价结合。
2)β消除反应法(参考文献张维杰主编糖复合物生化研究技术129页 杭州浙江大学出版社1999 2版)结果如图3所示，银耳杂多糖的糖与肽之间是通过O-糖苷键相连接的。
结论银耳杂多糖中的蛋白为结合蛋白，所占的比例(W/W)为0.1％-3％。
银耳杂多糖提取物中总蛋白和游离蛋白重量含量的检测和计算检测方法考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)(Bradford Method)，以牛血清蛋白为标准银耳杂多糖提取物中总蛋白重量百分含量；

将上述银耳杂多糖提取物总蛋白含量的检测结果，分别扣除经实施例12纯化获得的银耳杂多糖中的结合蛋白，计算公式如下A＝A1-A2×BA各银耳杂多糖提取物中游离蛋白重量百分含量；A1各银耳杂多糖提取物总蛋白重量百分含量；A2各银耳杂多糖中结合蛋白重量百分含量；B各银耳杂多糖提取物中的银耳杂多糖重量百分含量；银耳杂多糖提取物中游离蛋白的含量结果如下

结论银耳杂多糖提取物中游离蛋白所占的重量比例为0.1％-3.3％。
银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物平均分子量的测定方法乌氏粘度计法(Ubbelohde Viscometer Method)试剂 0.2M NaCl水溶液步骤1.准确称取已干燥的样品100mg，用0.2M NaCl水溶液溶解定容至100ml。(母液)2.分别吸取母液10、15、20、25ml用溶液0.2M NaCl水溶液稀释定容至50ml。
3.用乌氏粘度计(毛细管内径0.5-0.6(毫米)在25℃下分别测定它们的流出时间t0(0.2M NaCl)和t1、t2、t3、t4(各稀释液)。
4.以浓度Ci(g/100ml)为横坐标，比浓粘度ηsp为纵坐标作图，该回归直线与纵坐标的截距为特性粘度[η]5.根据公式[η]＝3.6×10-4×M0.78，计算待测样品的分子量。注ηsp＝ti/t0-1检测数据和结果

结论1)银耳杂多糖的平均分子量为85万-160万道尔顿；2)银耳杂多糖提取物的平均分子量为75万-140万道尔顿。
银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物分子量的测定方法HPGPC测试条件1.色谱柱型号Ultrahydrogel 2000与500串联柱(美国Waters公司)
2.流动相3mM的醋酸钠水溶液3.检测器Waters2410示差检测器、Waters2487双波长紫外检测器4.进样体积20μl5.进样时间50分钟6.柱温30℃7.泵型号Waters 515型高效液相泵8.标准品葡聚糖右旋糖苷DEXTRAN银耳杂多糖的检测数据和结果

结论银耳杂多糖中分子量大于6000道尔顿所占的重量比例为90％-100％，分子量小于6000道尔顿所占的重量比例为10％以下。
银耳杂多糖提取物的检测数据和结果

结论银耳杂多糖提取物中分子量大于6000道尔顿物质所占的重量比例为75％-98％，分子量小于6000道尔顿物质所占的重量比例为2-25％。
银耳杂多糖提取物中灰分的含量方法根据国家标准GB/T 14770-1993方法检测。
数据和结果

结论银耳杂多糖提取物中的灰分重量含量为0.5％-8％。
银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液的pH值方法分别配制1％(重量)银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液，分别用pH计进行检测数据和结果

结论1)1％银耳杂多糖水溶液的pH值为5.6-6.9；2)1％银耳杂多糖提取物水溶液的pH值为5.5-7.0；银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液的粘度和增稠效果检测鉴定方法恒温25℃，分别配制0.5％(重量)银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液，用旋转粘度计(型号NDJ-1，3号转子，上海精密科学仪器厂)分别测定粘度。
数据和结果


结论1)0.5％银耳杂多糖水溶液的粘度为0.7-2pa.s；2)0.5％银耳杂多糖提取物水溶液的粘度为0.6-1.8pa.s。
银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物的亲水能力和增稠功能的检测鉴定方法恒温25℃，分别配制2％(重量)的银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液，用旋转粘度计(型号NDJ-1上海精密科学仪器厂)分别测定粘度，并观察其状态。
银耳杂多糖的检测数据和结果

结论当银耳杂多糖水溶液中的银耳杂多糖含量大于2％，溶液成凝胶状态(粘度＞20pa.s)银耳杂多糖提取物的检测数据和结果

结论当银耳杂多糖提取物水溶液中的银耳杂多糖提取物含量大于2％，溶液成凝胶状态(粘度＞20pa.s)银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液的透光率方法分别配制0.5％(重量)的银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液，以水为对照，用752紫外光栅分光光度计(上海精密科学仪器厂)在400nm透光度下检测。
数据和结果

结论1)0.5％银耳杂多糖水溶液的透光率为90％-99％；2)0.5％银耳杂多糖提取物水溶液的透光率为80％-97％。
银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物的溶解性及其对稳定体系的作用鉴定方法分别称取0.5g银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物，分别溶于100ml的各种溶液中，高速均匀搅拌，待银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物溶解或均匀分散后，将溶液离心(转速4000r/min，时间15分钟)后观察其状态。
数据和结果


结论1、本发明银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物均可以溶解于水、含可溶性蛋白质或乳制品的水溶液以及低浓度有机溶剂(乙醇、丙二醇、丁二醇、甘油等)，同时银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物均可以溶解或很好分散于乳化液(软磷脂、油脂等)中；2、添加了银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物的各类混合液的体系均十分稳定，无分层或沉淀现象发生，说明银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物对稳定溶液体系具有明显的作用。
银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物的稳定性方法和结果1)分别将浓度为0.1％-0.5％的无菌银耳杂多糖和无菌银耳杂多糖提取物水溶液分别置于60℃(72小时)、80℃(1小时)、100℃(20分钟)环境中，待溶液温度恢复到室温后，分别检测粘度和透光率，并观察其状态。检测后发现银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液经上述测试，粘度和透光率均无明显变化，外观透明、无分层和沉淀现象；2)分别将浓度为0.1％-0.5％的无菌银耳杂多糖和无菌银耳杂多糖提取物水溶液置于自然光照下10天、20天、30天，分别检测粘度和透光率，并观察其状态。检测后发现银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液经上述测试，粘度和透光率均无明显变化，外观透明、无分层和沉淀现象；3)分别将浓度为0.1％-0.5％的无菌银耳杂多糖和无菌银耳杂多糖提取物水溶液调节pH，分别在pH4～9环境下检测粘度和透光率，并观察其状态。检测后发现银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液在上述pH状态下，粘度和透光率均无明显变化，外观透明、无分层和沉淀现象；4)分别将浓度为0.1％-0.5％的无菌银耳杂多糖和无菌银耳杂多糖提取物水溶液调节pH分别至4～9再进行中和至pH7，分别检测粘度和透光率，并观察其状态。检测后发现银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液经上述测试，粘度和透光率均无明显变化，外观透明、无分层和沉淀现象；5)分别将银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物粉末置于60℃(1天、2天、3天、7天)，待粉末温度恢复到室温后，观察其状态，并分别溶解检测粘度和透光率。检测发现所有粉末色泽均洁白无变化，无结块现象发生；所有溶解后的银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物水溶液的粘度和透光率均无明显变化，外观透明、无分层和沉淀现象；结论银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物粉末和水溶液经稳定性试验证实性能和状态稳定。
进一步研究发现，本发明所涉及的银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物具有清除自由基和抗衰老等抗氧化、保湿、润滑、抗过敏和刺激、增稠、稳定体系等功能，考虑与其结构有关1、由于银耳杂多糖中含有葡萄糖醛酸糖基，而且其百分含量(W/W)较高(6％-28％)，葡萄糖醛酸中羟基结构上的氢原子，可以与自由基结合，从而可以清除过氧化自由基。同时由于大分子的银耳杂多糖具有优异的亲水成膜性能，可以阻隔外界环境对皮肤等生物膜的破坏和侵袭，因此银耳杂多糖具有清除自由基和抗衰老的作用。
2、由于银耳杂多糖具有平均分子量为85-160万道尔顿以及分子量大于6000道尔顿占90％-100％的结构特性，同时也因分子量特性而决定的其具有粘度高的物理特征(0.5％水溶液粘度可达0.7-2pa.s；2％水溶液粘度大于20pa.s，溶液呈凝胶状态)，因此其在以下几方面也具有明显的功能1)因其高分子量特性而决定其具有极强的亲水能力，可以防止和延缓水分散失，因此银耳杂多糖具有优异的保湿性能；2)因其为大分子物质，所以能够在物体表面形成亲水润滑膜，其溶液对于人体或动物体，例如消化道、口腔、鼻腔、阴道、眼睛、皮肤和头发等均具有润滑作用；3)因其为大分子物质，所以能够在物体表面形成亲水膜，同时因为银耳杂多糖结构稳定不易被分解(具有耐热和耐弱酸碱特性)，因此其可以在人的体内和体外(例如皮肤、口腔)形成保护膜，以抵御和阻隔各类致敏刺激物的侵袭，因此银耳杂多糖具有抗过敏和刺激作用；4)因其具有大分子粘度高的特征，所以银耳杂多糖可以起增稠作用，同时溶解性和稳定性试验也表明该特征在稳定体系方面也具有明显的作用。
3、溶解性及稳定性试验表明银耳杂多糖和银耳杂多糖提取物的应用领域广泛，性能可靠，可以在多种领域被广泛使用。下面通过效果实施例来说明之。
效果实施例1银耳杂多糖的抗氧化能力银耳杂多糖抑制氧自由基能力的测定实验样品采用葡萄糖醛酸含量较低，经实施例2提取，并经实施例12纯化获得的银耳杂多糖(葡萄糖醛酸含量6.4％)。
方法用蒸馏水将银耳杂多糖配成浓度为1.0％、0.5％、0.1％的应用液，以蒸馏水为参比对照，使用活性氧测定试剂盒，依据Fenton反应产生OH-的量，进行抗活性氧能力测定。
结果(见表1和图4)表1.银耳杂多糖抑制氧自由基能力测定(x±SD)

注**与对照组相比，P＜0.01。
结果表明本次体外测试结果发现，0.1％、0.5％、1.0％银耳杂多糖均可明显抑制Fenton反应中氧自由基的产生，并有随着银耳杂多糖浓度升高，抑制氧自由基能力增强的趋势，表明银耳杂多糖具有较强的抗氧化能力。
效果实施例2银耳杂多糖对皮肤细胞抗氧化功能银耳杂多糖对皮肤细胞抗氧化衰老功能的实验。目的是观测银耳杂多糖对皮肤细胞抗氧化衰老功能的作用。实验样品采用葡萄糖醛酸含量较低，经实施例2提取，并经实施例12纯化获得的银耳杂多糖(葡萄糖醛酸含量6.4％)。
方法1、皮肤角质形成细胞原代培养采用初生SD大鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下，分离皮肤，用0.15％胰酶进行消化。消化完成后，终止消化，分离表皮组织，收集角质形成细胞，显微镜下计数，接种于24孔培养板中，细胞培养液为无血清角质细胞培养液(GIBCO公司)。置于5％二氧化碳37℃培养箱中，待细胞达到亚融合状态时，再进行相关测试。
2、皮肤成纤维细胞原代培养将上述操作分离后的真皮组织置于37℃培养箱中继续消化2h，然后终止消化，收集成纤维细胞。显微镜下计数，接种于24孔培养板中，细胞培养液为含15％小牛血清的DMEM培养液(GIBCO公司)。置于5％二氧化碳37℃培养箱中，待细胞达到亚融合状态时，再进行相关测试。
3、应用培养液配置将银耳杂多糖分别用角质形成细胞培养液和成纤维细胞培养液配置成浓度为0.5％、0.1％和0.05％受试应用液，然后滤过除菌，分装，4℃保存备用。
4、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定待原代培养的皮肤角质形成细胞和成纤维细胞达到亚融合状态后，将培养液更换成含银耳杂多糖为0.5％、0.1％和0.05％的应用培养液。培养24h后，采用SOD测定试剂盒，检测SOD活性。
5、丙二醛(MDA)含量测定待原代培养的皮肤角质形成细胞和成纤维细胞达到亚融合状态后，将培养液更换成含银耳杂多糖为0.5％、0.1％和0.05％的应用培养液。培养24h后，采用MDA测定试剂盒，测定MDA含量。
结果(见表2、3和图5)
表2.银耳杂多糖对皮肤原代培养细胞SOD活性的影响(x±SD)

注与对照组相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
表3.银耳杂多糖对皮肤原代培养细胞MDA含量的影响(x±SD)

注与对照组相比*p＜0.05**p＜0.01实验结果显示，浓度为0.1％和0.5％的银耳杂多糖可提高角质形成细胞SOD活性(P＜0.01)；0.05％、0.1％和0.5％的银耳杂多糖则均可升高皮肤成纤维细胞SOD的活性(P＜0.05或0.01)。角质形成细胞在含有0.1％和0.5％的银耳杂多糖的培养液中，MDA含量明显降低(P＜0.05)，而皮肤成纤维细胞，在0.5％银耳杂多糖组中，MDA含量减少(P＜0.01)。银耳杂多糖对皮肤细胞抗氧化衰老功能具有一定的作用。
效果实施例3银耳杂多糖具有保湿功能实验样品采用平均分子量较低，经实施例3提取，并经实施例12纯化获得的银耳杂多糖(平均分子量为85万道尔顿)方法用蒸馏水将银耳杂多糖配成浓度为1.0％的应用液，以相同浓度的透明质酸、甘油作为参比对照。在温度为25℃，相对湿度为34％的条件下，测定不同时间的失水率(％)。
结果(见表4和图6)表4.银耳杂多糖保湿能力测定(x±SD)

注与1.0％银耳杂多糖组相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
结果发现1.0％银耳杂多糖(水基)的保湿能力优于相同浓度和基质的透明质酸。在较长时间暴露于测试环境中，1.0％银耳杂多糖的保湿能力也高于1.0％甘油，表明本发明银耳杂多糖是性能优良的保湿剂。
效果实施例4银耳杂多糖的润滑功能实验样品采用平均分子量较低，经实施例3提取，并经实施例12纯化获得的银耳杂多糖(平均分子量为85万道尔顿)方法1用蒸馏水将银耳杂多糖、蜂蜜、麦芽糊精分别配成浓度为0.1％、0.3％、0.5％、1％的应用液，以水作为参比对照(滑感指数为0)。在溶液温度为25℃条件下，由40名自愿者(男女各20名)进行饮用盲试，记录饮用时的润滑感受(无润滑感指数为0，稍有润滑感为指数1，较强润滑感为指数2，强润滑感为指数3)，统计数据见下表及图7。
数据


结果上述数据显示，饮用0.1％、0.3％、0.5％、1％浓度的银耳杂多糖水溶液，饮用者明显可以感受到润滑舒适感觉，并且润滑舒适感随浓度增高而加强，同时银耳杂多糖水溶液饮用时的润滑感明显优于同等浓度的蜂蜜和麦芽糊精水溶液，表明银耳杂多糖可以明显增强溶液的润滑度。
方法2用蒸馏水将银耳杂多糖、甘油、硅油分别配成浓度为0.1％、0.3％、0.5％、1％的应用液(硅油配成乳化液)，以水作为参比对照(润滑感指数为0)。在溶液温度为25℃条件下，由40名自愿者(男女各20名)进行手背涂抹盲试，记录测定涂抹时的润滑感受(无润滑感指数为0，稍有润滑感为指数1，较强润滑感为指数2，强润滑感为指数3)，统计数据见下表及图8。
数据


结果上述数据显示，0.1％、0.3％、0.5％、1％浓度的银耳杂多糖水溶液经涂抹，试用者明显可以感受到润滑舒适感觉，并且润滑舒适感随浓度增高而加强，同时添加银耳杂多糖所产生的润滑感明显优于同等浓度的甘油和硅油乳化液，试验表明银耳杂多糖可以增强溶液的涂抹润滑度。
效果实施例5银耳杂多糖具有抗过敏和刺激功能实验样品采用平均分子量较低，经实施例3提取，并经实施例12纯化获得的银耳杂多糖(平均分子量为85万道尔顿)方法由24名自愿者(男女各12名)进行盲试，取致敏刺激物SLS(月桂醇硫酸钠)各10ml，分别与0.3％(W/W)银耳杂多糖水溶液100ml和蒸馏水(对照)100ml混合，将以上混合液各1ml滴到滤纸上，再用铝扣粘贴在手臂内侧皮肤上，进行30小时连续观察(每2小时/次)，测量纪录每一次过敏斑点直径，询问皮肤痒和痛的感觉，并且记录指数，取平均值画出30小时变化曲线(如图9、10所示)。
备注痛痒感受指数无感觉为0，稍有痒为1，较痒为2，十分痒为3，稍痛为4，轻微痛5，刺痛或灼痛为6；过敏斑点以铝扣直径为100％，以没有红肿现象为0％。
结果分析本次测试发现，银耳杂多糖对皮肤具有保护作用，可以明显以抵御和阻隔致敏刺激物的侵袭，并有一定的抑制疼痛和消肿的功能。因此银耳杂多糖具有抗过敏和抗刺激的作用。
权利要求
1.一种银耳杂多糖，其结构以α-(1-3)甘露糖为主链，主要由重量百分比为70-93％的中性总糖、6-28％的葡萄糖醛酸、0.1-3％的结合蛋白组成；该银耳杂多糖的平均分子量为85-160万道尔顿，其中分子量大于6000道尔顿的占90％(重量)以上。
2.根据权利要求1所述的银耳杂多糖，其特征在于该中性总糖主要包括下列含量的糖基35-60％甘露糖、10-25％岩藻糖、8-18％木糖和5-15％葡萄糖，上述含量是以银耳杂多糖重量计。
3.根据权利要求1所述的银耳杂多糖，其特征在于该银耳杂多糖包含如下结构式I所示的结构单元， (接下行)(接上行) 该结构单元的分子量为2578.5或2724.7。
4.一种银耳杂多糖提取物，其主要包括重量百分比为80-98％的权利要求1或2所述的银耳杂多糖，0.1-3.3％的游离蛋白及0.5-8％的灰分；该银耳杂多糖提取物的平均分子量为75-140万道尔顿，其中分子量大于6000道尔顿的占75-98％(重量)。
5.一种权利要求4所述的银耳杂多糖提取物的制备方法，其包括如下步骤1)将银耳子实体原料用水在80-100℃下搅拌提取得粗提液；2)将步骤1)所得的粗提液进行过滤，滤液最终通过孔径为0.1-1μm的过滤器；3)在步骤2)所得的滤液中加入乙醇，使乙醇的最终体积浓度为50-85％，收集沉淀；4)将步骤3)所得的沉淀进行干燥。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于该步骤1)中的银耳子实体原料采用干燥的银耳子实体原料，将该干燥的银耳子实体原料用水浸泡、膨胀并清洗干净，每次用20-100倍、多次提取时不超过200倍于该干燥的银耳子实体原料量的水在80-100℃下搅拌提取得粗提液。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于该步骤1)中的银耳子实体原料采用新鲜银耳子实体原料、保鲜冷藏或冷冻的新鲜银耳子实体原料，将该银耳子实体原料清洗干净，每次用2-15倍、多次提取时不超过30倍于该银耳子实体原料量的水在80-100℃下搅拌提取得粗提液。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于在步骤1)中将银耳子实体原料用水在80-100℃下搅拌单次提取1-4小时得粗提液；或多次提取＞1小时，≤5.5小时，合并每次所得的提取液得粗提液。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于将步骤2)所得的滤液进行浓缩得浓缩液，再将得到的浓缩液用于步骤3)。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于在步骤3)中将步骤2)所得的滤液加入乙醇时予以搅拌。
11.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于将步骤3)所得的沉淀用95-100％的乙醇脱水脱色。
12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于在步骤4)中所说的干燥为-40℃～80℃的真空干燥、热干燥、热风干燥或冷冻干燥。
13.一种权利要求4所述的银耳杂多糖提取物的制备方法，其包括如下步骤1)将按常规微生物发酵方法获得的银耳发酵液加热至80-100℃、保温0.5-2小时，过滤，清液再通过孔径为0.1-1μm的过滤器得滤液；2)在步骤1)所得的滤液中加入乙醇，使乙醇最终体积浓度为50-85％，收集沉淀；3)将步骤2)所得的沉淀进行干燥。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于步骤1)中的过滤时加入助滤剂硅藻土。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于在步骤2)中将步骤1)所得的滤液加入乙醇时予以搅拌。
16.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于将步骤2)所得的沉淀用95-100％的乙醇脱水脱色。
17.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于在步骤3)所说的干燥为-40℃～80℃的真空干燥、热干燥、热风干燥或冷冻干燥。
18.一种权利要求1-3任一项所述的银耳杂多糖的制备方法，其包括权利要求5或13所述的银耳杂多糖提取物的制备方法，并将所得提取物进一步纯化的步骤。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于该纯化采用Sevag法及透析法。
20.权利要求1-3任一项所述的银耳杂多糖在制备抗氧化剂、保湿剂、润滑剂、抗过敏剂、增稠剂或稳定剂中的应用。
21.权利要求4所述的银耳杂多糖提取物在制备抗氧化剂、保湿剂、润滑剂、抗过敏剂、增稠剂或稳定剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种银耳杂多糖，其结构以α－(1－3)甘露糖为主链，主要由重量百分比为70－93％的中性总糖、6－28％的葡萄糖醛酸、0.1－3％的结合蛋白组成；该银耳杂多糖的平均分子量为85－160万道尔顿，其中分子量大于6000道尔顿的占90％(重量)以上。本发明还公开了其提取物，以及它们的制备方法。本发明的银耳杂多糖及其提取物具有保湿滑润皮肤和粘膜、增强润滑感、抗氧化衰老、抗过敏、增稠稳定等功能。
文档编号A61K31/736GK1807463SQ20051002342
公开日2006年7月26日 申请日期2005年1月18日 优先权日2005年1月18日
发明者刘桂云, 骆滨, 骆峰 申请人:上海辉文生物技术有限公司