专利名称：马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种马钱子碱免疫纳米微粒用于制备肿瘤免疫靶向治疗的药物的用途，具体地，涉及一种抗人AFP McAb (即抗人甲胎蛋白单克隆抗体)-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌特异性靶向治疗药物的用途。
该马钱子碱是一种弱碱性生物碱，水溶性差，作为活血通络和“以毒攻毒”代表药物， 对T淋巴细胞增殖有促进作用，对小鼠淋巴细胞功能有剂量依赖性的功能调节作用，具有明显的抑瘤作用和很强的镇痛作用，邓旭坤等评价马钱子碱对移植性肿瘤模型荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用和生存时间的影响，结果发现马钱子碱在1.61-6.46 mg对实体瘤Ifeps模型小鼠和S180模型小鼠的抑瘤率均不低于30%，马钱子碱还能提高小鼠的免疫器官的重量及其指数，但其对腹水瘤模型(EAC、H印s)荷瘤小鼠的生存时间无明显延长作用，从而证实了马钱子碱能一定程度地抑制实体瘤模型小鼠体内肿瘤生长。短期应用对动物的造血、免疫系统以及肝肾没有明显的毒性，还能刺激和促进造血系统和免疫系统的功能，恢复小鼠因接种肝癌Heps瘤株而造成的肝肾功能的损伤，马钱子碱可能成为新的有发展前景的抗肿瘤药物。 已有技术研究(1)制备马钱子碱脂质体，与马钱子碱溶液对比，用大白兔进行药代动力学研究发现，马钱子碱溶液给药2小时后血中已经测不出Brucine，慢分布半衰期 7. 5分钟，而将马钱子碱包封于脂质体后，给药12小时后血中仍然保持一定的浓度分布，消除半衰期比前者延长了 6. 6，但药物释放仍然过快，而且肝脏靶向性不强，难以在局部达到有效的药物浓度；(2)马钱子碱及其脂质体对小鼠移植性肝癌(Heps)和小鼠移植性实体瘤肉瘤S180细胞的生长均表现出明显的抑制作用，但两者对腹水瘤模型(EAC和H印s)荷瘤小鼠的生存时间无延长作用；(3)马钱子碱聚乳酸纳米粒(Bru-PLA-NPs)静脉注射给药用于家兔体内的药动学观察，结果发现单剂量静脉注射Bru-PLA-NPs (4 mg/ kg)后马钱子碱在兔体内的药动力学数据符合三室模型，单剂量静注马钱子碱溶液G mg/ kg)后符合二室模型，与马钱子碱溶液相比，Bru-PLA-NPs给药后，马钱子碱的消除半衰期(tl/ 2β) 提高6. 6倍；生物利用度提高8. 7倍。与马钱子碱溶液相比，Bru-PLA-Ws静脉注射给药后马钱子碱在家兔体内的药动学行为发生了显著变化，将马钱子碱制成纳米粒可延长药物在动物体内的循环和作用时间，提高生物利用度；(4)腹腔应用马钱子碱溶液、马钱子碱普通
背景技术：
马钱子碱(Brucine)是马钱子主要成分之一，其化学结构如下脂质体和马钱子碱隐形脂质体治疗移植性肝癌H22小鼠，马钱子碱剂量均为3. 23mg -kg-1, 连用8d，结果发现同剂量的马钱子碱溶液、马钱子碱普通脂质体、马钱子碱隐形脂质体的抑瘤率分别为28. 64%,57. 96%和71. 36%，马钱子碱普通脂质体和隐形脂质体对荷瘤小鼠均无免疫抑制作用，与普通脂质体相比，隐形脂质体作为马钱子碱的载体能够进一步增强其抗肿瘤效果。我们近期研究发现马钱子碱与马钱子碱-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米微粒显著抑制SMMC-7721人肝癌细胞从S期进入G2、M期，诱导肝癌细胞凋亡，而且马钱子碱纳米微粒抑制肿瘤细胞增殖效果显著优于马钱子碱单体，马钱子碱能够抑制人肝癌 SMMC-7721细胞的基质黏附，随着药物剂量的增长，对基质黏附抑制作用逐渐增强，马钱子碱用量为32(^g/ml时观察细胞运动迁徙率为17. 46%，侵袭率为2. 52%，与4(^g/ml相比迁徙率和侵袭率均存在显著差异。表明马钱子碱能够有效抑制肝癌细胞粘附，阻止肝癌细胞运动和侵袭，为马钱子碱用于靶向治疗肝细胞肝癌的深入研究奠定了理论基础。但马钱子碱是剧毒中药，其治疗量与中毒量非常接近，全身用药剂量大，毒副作用强。如何进一步改善马钱子碱的靶向性和肿瘤局部药物聚集、持续发挥抗肿瘤效应，降低全身毒副反应，是提高马钱子碱抗肝癌效应的关键所在。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人AFP McAb (即抗人甲胎蛋白单克隆抗体)_聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒，能用于制备肝脏肿瘤靶向治疗药物，使得该药物具有肿瘤精确靶向性、抗肿瘤效应和缓控释药物的效果。为实现以上目的，本发明提供了一种马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，该马钱子碱免疫纳米微粒是以马钱子碱为活性成分，以羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料，外链接抗人AFP单克隆抗体形成的免疫靶向纳米微粒。上述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒携载马钱子碱含量为5 7%，包封率为70、5%。
上述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒携载马钱子碱含量5. 6 士0. 2%，包封率为76. 0 士 2. 3%。上述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其中，所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的通式为PLA-PEG-CH2-CH2-C00H，其分子量的范围为 40-50kD，是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例为1 :1. 5^3的比例共聚形成的。上述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其中，所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例为1. 5 2. 5的比例共聚形成的。上述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，马钱子碱与羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比为 1:15 30。上述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，马钱子碱与羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比为1:20。上述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，抗人AFP单克隆抗体的浓度范围为1(Γ20μβ抗体/mg纳米微粒。上述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，抗人AFP单克隆抗体的浓度是抗体/mg纳米微粒。本发明以马钱子碱为活性成分，以生物降解材料羧基化聚乙二醇(carboxylation polyethylene glycol，CPEG)和聚乳酸(polylactic acid，PLA)作为药物辅料，通过化学改性技术研制羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物，采用超声乳化-化学交联法制备工艺技术，制备马钱子碱-羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米微粒(Brucine /CPEG/ PLA Nanoparticles, BCPNS)，通过化学偶联法将抗人AFP McAb与羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱纳米微粒链接，成功研制抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒(Anti-hAFP McAb-Brucine /CPEG/PLA Nanoparticles, AHMBCPNS)。粒径 274. 5 士 64. 3 nm，Zeta 电位为-4. 73 士 4. 73 mV，载药率5. 6 士 0. 2%，包封率76 士 2. 3%，携载马钱子碱浓度为800μ g/ml，抗人AFP McAb在马钱子碱纳米微粒上的浓度是抗体/mg纳米微粒。体外药物释放结果马钱子碱M小时累积释放超过80%，48 小时释放完全。本发明抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒体内代谢、组织分布与抗肿瘤作用
大鼠体内马钱子碱在马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组与马钱子碱免疫纳米微粒组的半衰期(t1/2)分别为6. 98士0.65 h、16. 88士5. 67 h与15. 69士3. 76 h。马钱子碱纳米微粒组与马钱子碱免疫纳米微粒组半衰期明显长于马钱子碱组，且两者在体内代谢过程相接近，即初始是一个快速代谢的过程，到后期消除缓慢，表现出明显的缓释性。而马钱子碱体内呈现一个快速代谢过程。给药3d后马钱子碱组荷瘤裸鼠体内各组织中均未测出马钱子碱，马钱子碱纳米微粒组在脾、肺、肾、肌肉、肝癌和癌旁肝组织中马钱子碱浓度分别为341. 00 ng/ mg、9.09 ng/mg、7. 90 ng/ mg、14. 41 ng/ mg、24. 00 ng/ mg 和 246. 50 ng/ mg，其余组织未测出；马钱子碱免疫纳米微粒组仅在脾、肝癌和癌旁肝组织中马钱子碱浓度分别为341. 50 ng/ mg、 57. 13 ng/ mg和135. 93 ng/ mg。马钱子碱免疫纳米微粒组马钱子碱在肝癌组织中的药物浓度高于马钱子碱纳米微粒组，癌旁肝组织中马钱子碱药物浓度明显低于马钱子碱纳米微粒组，差异具有统计学意义(庐445. 85，/X0. 05)。马钱子碱免疫纳米微粒组给药7d、14d、21d与30d时抑瘤率分别为36. 73%、 54. 77%,69. 48%,75. 96%,显著高于其他阳性给药组。5_Fu(5_氟尿嘧啶)组、马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组和马钱子碱免疫纳米微粒组荷瘤动物生存期(d)分别为63. 60士 16. 26、 50. 10士 11. 19%,60. 50士 12. 54,81. 50士 14. 25，尤以马钱子碱免疫纳米微粒组生存时间最长，与其他实验组相比差异显著(厂=9. 010，P<Q. 05) ；5-Fu组、马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组和马钱子碱免疫纳米微粒组生命延长率分别为25. 20%、-1. 38%、19. 09%和60. 43%，其中马钱子碱免疫纳米微粒组荷瘤动物生存时间明显延长。本发明利用羧基化的聚乙二醇与聚乳酸形成嵌段共聚物，共聚物末端含有水溶性聚合物聚乙二醇镶嵌，显著提高体内长循环时间，避免马钱子碱免疫纳米微粒体内释药速
5度过快，难以在局部达到有效抗癌药物浓度等缺陷。利用聚乙二醇外露羧基，与抗人AFP McAb的氨基通过化学偶联技术成功链接，显著提高了抗人AFP McAb与羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱纳米微粒的链接效率。本发明制备的抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒，可用于制备抗肿瘤免疫靶向药物，该药物用于肝细胞癌治疗，通过外周静脉给药后，抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米载体能够增加马钱子碱在肝癌细胞聚集， 使药物在局部缓慢释放，延长药物对肿瘤细胞的作用时间，提高局部药物浓度，使其载药更加“精确”地积聚在肿瘤组织，极大发挥马钱子碱抗肿瘤作用，最大限度地降低马钱子碱的毒性作用；具有精准靶向肿瘤组织细胞药物聚集、药物释放稳定，抗癌效果好，安全等优势。
图1是羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(PLA-PEG-CH2-CH2-C00H) 的1H -NMR测定图谱。图加是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒透射电镜图，透射电镜X10，000。图2b是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒扫描电镜图，扫描电镜X 50，000。图3是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒粒径分布图。图4是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒体外药物释放。图5是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒靶向性测定。图6是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒对人肝癌细胞生长抑制作用。图7是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒药代动力学。图8是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒在荷瘤裸鼠体内组织分布。图9是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒抗肿
瘤作用。图10是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒对荷瘤动物生存期影响。
具体实施例方式以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式
。实施例1
抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒的制备方法原料配方如下
权利要求
1.一种马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，该马钱子碱免疫纳米微粒是以马钱子碱为活性成分，以羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料，外链接抗人AFP单克隆抗体形成的免疫靶向纳米微粒。
2.如权利要求1所述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒携载马钱子碱含量为5 7%，包封率为70、5%。
3.如权利要求2所述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒携载马钱子碱含量5. 6 士0. 2%，包封率为76. 0 士 2. 3%ο
4.如权利要求广3任意一项所述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其特征在于，所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的通式为 PLA-PEG-CH2-CH2-C00H，其分子量的范围为40-50kD，是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例为1:1. 5 3的比例共聚形成的。
5.如权利要求4所述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其特征在于，所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例为1. 5 2. 5的比例共聚形成的。
6.如权利要求广3任意一项所述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，马钱子碱与羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比为1:15 30。
7.如权利要求6所述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，马钱子碱与羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比为1:20。
8.如权利要求1或2或3或5或7所述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，抗人AFP单克隆抗体的浓度范围为1(Γ20μβ抗体/mg纳米微粒。
9.如权利要求8所述的马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，抗人AFP单克隆抗体的浓度是抗体/mg纳米微粒。
全文摘要
本发明涉及一种马钱子碱免疫纳米微粒用于制备抗肝癌靶向药物的用途，该马钱子碱免疫纳米微粒是以马钱子碱为活性成分，以羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料，外链接抗人AFP单克隆抗体形成的免疫靶向纳米微粒。本发明提供的马钱子碱免疫纳米微粒，工艺简便，包封率高，药物释放稳定，成球性好，可用于制备抗肿瘤免疫靶向药物，该药物能用于抗肝癌治疗，通过外周静脉给药后，抗人AFPMcAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米载体能够增加马钱子碱在肝癌细胞聚集，使药物在局部缓慢释放，延长药物对肿瘤细胞的作用时间，提高局部药物浓度，降低马钱子碱全身毒性；具有精准靶向肿瘤组织细胞药物聚集、药物释放稳定，抗癌效果好，安全等优势。
文档编号A61K9/14GK102293750SQ20111021014
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年6月30日
发明者张敏, 撒忠秋, 李琦, 杨林, 殷佩浩, 沈鹤柏, 盛霞, 秦建民, 陈庆华, 马经纬, 高科攀, 黄涛 申请人:上海中医药大学附属普陀医院, 上海医药工业研究院, 上海师范大学