专利名称：奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是危害我国奶牛饲养业重大疾病之一。根据国内外许多学者的研究发现，链球菌属是引起乳房炎的最主要病原菌之一。目前国内乳房炎疫苗方面主要是全菌体灭活疫苗。该疫苗虽具有一定的保护力，但没有异源菌株保护力，因而对新生菌不具有免疫预防的效果。Mackie等报道使用福尔马林灭活后的无乳链球菌菌苗对奶牛无保护力。Giraudo等人采用了乳房链球菌和停乳链球菌多联灭活苗，接种疫苗并不能显著降低奶牛由链球菌引起的乳房炎的发生。奶牛中链球菌主要有五类无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓链球菌和粪链球菌，而其中以无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌为常见病原菌。近年来，研究表明链球菌表面脱氢酶位于细菌表面，具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性,与血纤维蛋白溶酶结合，在疾病发展过程和信号转导过程中起到重要作用，被认为是疫苗发展的良好靶位点。无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌GapC在DNA和氨基酸水平上有相当的同一性，这就暗示了 GapC蛋白可能作为一种抗原，用于保护奶牛对抗无乳链球菌、停乳链球菌以及乳房链球菌感染。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白；第二目的是提供奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白的制备方法；第三目的是提供一种含有奶牛乳房炎链球菌GapC蛋白的亚单位疫苗。为了实现本发明的第一目的，本发明提供了一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗 GapC蛋白，所述GapC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明还提供了编码所述GapC蛋白的相应基因，其具有SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述基因的表达载体及其宿主细胞。为了实现本发明的第二目的，本发明提供了奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC 蛋白的制备方法，该方法包括下述步骤(1)提取牛源链球菌DNA序列；(2)根据NCBI数据库已公布序列AF375662设计引物，PCR扩增出GapC基因；(3)将回收的该基因与PMD18-T载体连接后，转化到大肠杆菌XL-I-Blue中，经酶切鉴定，筛选阳性克隆，序列测定；(4)酶切pMD18-T-GapC及pQE_30质粒，构建重组载体pQE-30-GapC，转化大肠杆菌XL-1-Blue，筛选出的阳性克隆培养后提取质粒，进行双酶切鉴定；(5)在大肠杆菌XL-I-Blue中获得高表达的上述重组工程菌，随后经镍柱纯化后得到目的蛋白，即为GapC蛋白，分子量为38kD。其中，所述重组工程菌经过发酵培养进行优化，其发酵培养的条件为37°C、pH值 7.0、装液量20%、种龄12-1^1、转数180-220rpm，而接种量为1% -3%0其中，扩增GapC基因所用的引物如下所示5' -CGC IGGATCCI ATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3‘5' -GAC |GTCGAC[ AGCGATTTTTGCAAAATACTC-3‘。其中，所述PCR 反应条件为95°C预变性 15min，94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 2min， 30 个循环，72°C IOmin。其中，所述牛源链球菌为停乳链球菌(S. dysgalactiae)。本发明还提供了含有上述GapC蛋白的亚单位疫苗，该疫苗由GapC蛋白溶液与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂按1 1混合混合乳化制成，其中GapC蛋白溶液的浓度为 3. 3mg/ml-4mg/ml0本发明还提供了上述GapC蛋白，制备所述GapC蛋白的方法在制备预防奶牛乳房炎亚单位疫苗中的应用。本发明利用牛源链球菌GapC蛋白制备的亚单位疫苗对奶牛乳房炎常见的三种链球菌都具有交叉保护性，与其他疫苗相比具有更广谱的保护性，可作为奶牛乳房炎亚单位疫苗的候选抗原。
图1为本发明所述PCR扩增得到的GapC基因片段大小为1005bp ；图2为本发明所述重组质粒pQE-30-GapC经BamHI和Ml I双酶切，获得预期大小的两个目的基因片段CMOObp和1005bp)；图3为本发明所述诱导菌在约38kD处表达的蛋白条带，与重组融合蛋白大小相一致；图4为本发明所述小鼠ELISA检测各周免疫血清效价；图5为本发明所述奶牛ELISA检测各周免疫血清效价。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。TR-GapC蛋白为停乳链球菌GapC蛋白、WR-GapC蛋白为无乳链球菌GapC蛋白、RF-GapC蛋白为乳房链球菌GapC蛋白。实施例1基因工程重组菌pQE-30-GapC/XL-l-Blue的构建以及牛源链球菌GapC 蛋白亚单位疫苗的制备(1)牛源停乳链球菌亚单位疫苗GapC基因的制备。DNA的提取取1. 5mL停乳链球菌培养物，如LS0312株，IOOOOrpm离心^iiin ；沉淀物加入 567 μ L TE,反复吹打。之后加 30 μ 1 10% SDS 和 3 μ 1 20mg/mL 的 Proteinase K,混勻，37°C水浴Ih ；加100 μ 1 5Μ NaCl，混勻，再加入80 μ 1 CTAB/NaCl，混勻。65°C水浴 IOmin ；加入等体积的氯仿/异戊醇，混勻，12000rpm离心4-5min，上清液转入一新管；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混勻，12000rpm离心5min，上清液转移至一新管；加入0. 6体积的异丙醇，轻混，沉淀DNA 30min，12000rpm离心15min，弃上清；加入ImL 70%乙醇洗涤 DNA ； 12000rpm离心5min，弃上清，干燥，溶于50 μ L TE中。根据停乳链球菌GapC的DNA序列，设计上下游引物及限制性酶切位点，其中在上游加入BamHI酶切位点，下游加入Ml I酶切位点Pl 5' -CGCGGATCCATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3'Ρ2 5' -GACGTCGACAGCGATTTTTGCAAAATACTC-3'反应条件为95°C预变性15min，94°C预变性45s，56°C退火45s，72°C延伸2min， 30个循环，72°C延伸lOmin，得到GapC基因。将回收的GapC基因与pMD18_T连接，转化大肠杆菌XL-1-Blue。利用BamHI和Ml I进行双酶切鉴定，筛选阳性的克隆，测序鉴定。测序正确后对pMD 18-T-GapC及pQE-30质粒用BamHI和Ml I进行双酶切，构建重组载体 pQE-30-GapC，转化大肠杆菌XL-1-Blue。筛选出的阳性克隆培养后提取质粒，进行双酶切鉴定。实验结果表明扩增到了预期大小即约1005bp的目的片段，参见图1。重组质粒 pQE-30-GapC经BamHI和Mil 37°C双酶切，获得预期大小的两个目的基因片段CMOObp 和1005bp)，参见图2。DNA序列经测定，插入的GapC基因的序列正确，结果表明重组 pQE-30-GapC构建完全正确。(2)牛源无乳链球菌和乳房链球菌亚单位疫苗GapC基因的制备。其中除扩增的引物序列和PCR扩增的条件不同外，其它的实验条件和步骤和结果同(1)中的牛源停乳链球菌亚单位疫苗GapC基因的制备。根据NCBI数据库已公布序列AF421899、AF421900设计引物。S. agalactiae、 S. uberis 引物的核苷酸序列为GapC Forward Primer (Pf) 5' -CGCGGATCCATGGTAGTTMAG TTGGTATT-3‘边框内序列为 BamHI 酶切位点。GapC Reverse Primer (Pr) 5' -GACGTCGAC AGCGATTTTTGCAAAGTACTC-3 ‘边框内序列为SalI酶切位点。S. agalactiae GapC基因 PCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C 45s, 58°C 45s, 72°C 2min，30 个循环，72°C IOmin0 S. uberisGapC 基因 PCR 反应条件为94°C预变性 5min， 94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 2min，30 个循环，72°C IOmin0实施例2 :重组菌pQE-30-GapC的诱导表达及GapC蛋白的纯化将100 μ L pQE-30-GapC的重组菌接种于含100 μ g/mL氨苄青霉素的IOmL LB培养基中，37°C培养，0D600约为0. 5时，吸出ImL培养物置于1. 5mL印pendorf管中。加入IOOmM 的诱导剂IPTG至终浓度为ImM，继续剧烈振荡培养他。每隔Ih吸取ImL菌液，IOOOOrpm离心，弃上清，在沉淀中加入90μ L IX上样缓冲液和IOmL IM DTT后，煮沸5min，取15 μ L用于SDS-PAGE。参见图4。应用Hie QlAexpressionist TM蛋白纯化系统进行纯化。取过夜培养的5mL菌液于0. 5L含有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养3h， 加入IPTG至终浓度为lmmol/L再继续培养4h，离心12000r/min IOmin收集菌体，反复冻融三次，称取菌体重量，按5mL/mg加入Buffer B混勻，离心12000r/min IOmin收集上清，加入 500 μ L镍颗粒，4°C摇床过夜，离心收集沉淀。加入Buffer C洗三次，收集沉淀加入Buffer
5E洗5-8次，收集蛋白。取15 μ L蛋白溶液，经SDS-PAGE检测纯化效果。
与对照和蛋白质分子量Marker相比，诱导菌在约38kD处有一条表达的蛋白条带， 与重组融合蛋白大小相一致，参见图3。将重组菌用蛋白纯化系统The QlAexpressionist TM纯化表达的重组pQE-30-GapC蛋白，用比色法测定TR-GapC、WR-GapC、RF-GapC蛋白质浓度分别能达到3. 3mg/mL,3. 6mg/mL、^ig/mL。纯化蛋白经SDS-PAGE分析，结果单一目的条带，分子量约为38kDa。参见图4。实施例3 工程菌的发酵培养条件优化(I)TR-GapC 工程菌工程菌种子液制备溶解TR-GapC工程菌，分别划线接种于含有Amp抗性的LB固体培养基中，37°C培养Mh ；然后分别挑取生长良好的单菌落接种于装有3mL含有Amp抗性的LB液体培养基的试管中，37°C、190rpm培养16h，以灭菌的基础种子培养基作为空白对照，测定各菌液OD 600，当菌液OD 600在1.3 1.5之间，作为一级种子。取一级种子，接种于LB液体培养基，370C、190rpm培养16h，经检查纯粹，置2 8°C保存，作为二级种子，用于培养条件优化等实验。停乳链球菌Gap C工程菌生长曲线测定将种龄IOh的TR-Gap C工程菌按1 %的接种量分别接种于含有40mL Amp抗性的 LB培养基的IOOmL锥形瓶，37°C、160rpm的条件下震荡培养，每隔一小时分别取出两个样品，以灭菌的含有Amp抗性的LB培养基作为空白对照，测定每个样本菌液的OD 600值。停乳链球菌Gap C工程菌发酵罐诱导表达将种龄为1 种子液按1 %的接种量接种于装有3L发酵培养基的发酵罐中，发酵罐进气口压力为0. 25MPa，出气口压力为0. 05MPa,发酵罐DO控制在90 %，在37°C，350rpm 条件下连续培养，每隔Ih取一次发酵液，测定其OD 600值，当基因工程菌OD 600达到0. 6 时，按0. 1 %的量加入IPTG，进行诱导表达，然后在诱导后证后放出发酵液。(2) WR-GapC 工程菌和 RF-GapC 工程菌工程菌种子液制备、停乳链球菌Gap C工程菌生长曲线测定与程菌发酵罐诱导表达所用的条件和步骤同TR-GapC工程菌。实施例4 奶牛乳房炎全菌体灭活疫苗制备(1) S. agalactiae> S. dysgalactiae> S. uberis将S. agalactiae LSO3IO 株，S. dysgalactiae LSO3I2 株，S. UberisSDO3O6 株接种于鲜血琼脂培养基中，37°C恒温箱培养过夜；挑单菌落接种于BHI液体培养基中，37°C剧烈振荡培养Mh。采用平板法进行细菌计数。加入终浓度为0.4% (ν/ν)的甲醛溶液，37°C振荡培养灭活36h ；取200 μ L菌液涂布于鲜血琼脂培养基，确定灭活效果。将灭活菌液用PBS 离心洗涤3次，调整菌液浓度至1 X 101(lCFU/mL。稀释好的菌液加入1/5体积的铝胶佐剂制备S. agalactiae、S. dysgalactiae、S. uberis全菌体灭活疫苗。按常规方法进行无菌检验和安全性检验。Q)GapC重组蛋白亚单位疫苗的制备分别取TR-feipC(3. 3mg/mL)、WR-GapC(3. 6mg/mL)、RF-GapC(4mg/mL)的蛋白溶液 5mL与弗氏完全佐剂5mL按1 1混合，乳化制备IOmL重组蛋白亚单位疫苗，供一免使用。同时取 TR-GapC(3. 3mg/mL) ,WR-GapC(3. 6mg/mL) ,RF-GapC(4mg/mL)的蛋白溶液各 5mL 与弗氏不完全佐剂5mL按1 1混合，乳化制备IOmL重组蛋白亚单位疫苗，供二免或三免使用。 制备的疫苗在4°C临时保存。实施例5 小鼠免疫试验及保护力试验取健康小鼠150只，随机分为15组，每组10只，分别为TR-GapC、WR-GapC、RF-GapC 亚单位疫苗免疫组，S. agalactiae、S. dysgalactiae、S. uberis全菌体灭活疫苗免疫组以及对照组。蛋白免疫组采用腹腔注射0. 2mL(100yg蛋白)亚单位疫苗，间隔三周，用同样方法及剂量进行加强免疫。全菌体免疫组采用皮下多点注射0. 2mL(20亿个菌)灭活疫苗，间隔三周，用同样方法及剂量进行加强免疫。在一免后开始每周进行一次割尾采血，采集后血液 37°C恒温箱中放置池，于4°C冰箱放置过夜后，析出的透明、淡黄色上清液即为抗血清。离心后分装，于_70°C保存。采用间接ELISA检测血清抗体。对GapC亚单位疫苗免疫组、灭活苗组及对照组通过腹腔注射的方法，分别用60亿菌无乳链球菌、20亿菌停乳链球菌、80亿菌乳房链球菌菌株攻毒，攻毒后每日观察小鼠死亡情况。结果表明三组GapC亚单位疫苗免疫组加强免疫3周后，IgG效价水平达到最高值。 ELISA检测TR-GapC亚单位疫苗各周免疫血清效价，反映抗体消长水平，参见图4。结果表明二免后抗体效价有明显提高，随着时间推移，抗体效价快速上升，二免三周达到高峰。用无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌在二免后21d对三组亚单位疫苗及对照组进行攻毒，结果显示三组亚单位疫苗组均产生了较好的免疫保护效果，尤其停乳链球菌免疫效果最好。 参见表1。而未免疫的对照组小鼠在一周内全部死亡。表1免疫小鼠攻毒保护试验结果
权利要求
1.一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白，其特征在于，所述GapC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.编码权利要求1所述GapC蛋白的基因。
3.含有权利要求2所述基因的载体。
4.制备权利要求1所述GapC蛋白的方法，其特征在于，该方法包括下述步骤(1)提取牛源链球菌DNA序列；(2)根据NCBI数据库已公布序列AF375662设计引物，PCR扩增出GapC基因；(3)将回收的该基因与PMD18-T载体连接后，转化到大肠杆菌XL-I-Blue中，经酶切鉴定，筛选阳性克隆，序列测定；(4)酶切pMD18-T-GapC及pQE_30质粒，构建重组载体pQE-30-GapC，转化大肠杆菌 XL-1-Blue，筛选出的阳性克隆培养后提取质粒，进行双酶切鉴定；(5)在大肠杆菌XL-I-Blue中获得高表达的上述重组工程菌，随后经镍柱纯化后得到目的蛋白，即为GapC蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述重组工程菌经过发酵培养进行优化，其发酵培养的条件为温度37°C、pH值7.0、装液量20%、种龄12-1 、转数 180-220rpm、接种量为 1% -3%0
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，扩增GapC基因所用的引物如下所示，5 ‘ -CGC IGGATCC丨 ATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3 ‘5 ‘ -GAC lGTCGAC丨 AGCGATTTTTGCAAAATACTC-3 ‘。
7.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR反应条件为95°C预变性 15min，94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 2min，30 个循环，72°C IOmin0
8.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，牛源链球菌为停乳链球菌 (S. dysgalactiae) 0
9.含有权利要求1所述GapC蛋白的亚单位疫苗。
10.权利要求1所述GapC蛋白在制备预防奶牛乳房炎亚单位疫苗中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白及其制备方法和应用，所述GapC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明利用牛源链球菌GapC蛋白制备的亚单位疫苗对奶牛乳房炎常见的三种链球菌都具有交叉保护性，与其他疫苗相比具有更广谱的保护性，可作为奶牛乳房炎亚单位疫苗的候选抗原。
文档编号A61K39/09GK102304174SQ20111027093
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者于立权, 周玉龙, 崔玉东, 张军, 朱战波, 朱洪伟, 杨玉英, 柳强, 王鹤, 车车 申请人:黑龙江八一农垦大学