专利名称：牛膝提取物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种天然植物提取物及其提取方法和新用途。
背景技术：
慢性咽炎(chronicpharyngitis)为咽部黏膜、黏膜下层及淋巴组织的慢性炎症， 可分为单纯性、增生性和萎缩性三种类型。以发音困难，咽部不适、发干、异物感或轻度疼痛、干咳、恶心，咽部充血呈暗红色，咽后壁可见淋巴滤泡等为主要临床表现。慢性咽炎患者，因咽分泌物增多，故常有清嗓动作，吐白色痰液。目前治疗慢性咽炎的方法很多，如西医一般主张用口泰、复方硼砂溶液等漱口液， 含服华素片、安吉含片、g菌含片等。这些药物长期使用会导致口腔内环境紊乱，采用抗生素药物达到咽部较少，且会产生耐药性和毒副作用。对于肥厚增生性咽炎，可采用激光、微波、 冷冻等方法。但这些疗法目前有滥用趋势，门诊上经常见到因手术后咽部瘢痕严重增生、挛缩而病情加重前来就诊的病人。因此，采用天然植物有效成分预防或治疗慢性咽炎越来越受人关注。在江苏省扬州等地民间，常用苋科牛膝属植物牛膝Uchyran thes biden ta ta Blume.)泡茶治疗和预防慢性咽炎，效果显著。中国传统医学认为，牛膝性味酸平，归肝、肾经，具有补肝肾，强筋骨，活血通经，引火下行，利尿通淋等功效。现代药理学研究表明，牛膝具有抗衰老、抗肿瘤、镇痛消炎、提高机体免疫力等多种生物活性和药理作用，其主要活性物质以牛膝多糖、牛膝皂苷研究较多。但是，在研究和应用方面存在以下问题
(1)牛膝治疗和预防慢性咽炎虽在民间有所应用，但应用地域并不广泛，其它地区用于治疗咽炎的记载较少。(2)对牛膝功效的研究，目前以抗衰老、抗肿瘤、提高免疫力等较多，对抗炎作用报道较少，抗炎研究都大多停留在对急性炎症及其可能相关因素方面，针对在慢性咽炎方面的研究更为少见。(3)将牛膝用于治疗和预防慢性咽炎还停留在经验水平上，其作用机理尚不明确。以牛膝为原料，具有以下优点
(1)在河南焦作等地，有大面积栽培，即历史上有名的地道药材“怀牛膝”。每年秋后采收地下部分，并将地上茎叶部分废弃。因此，与一般市售清咽功能产品原料相比，牛膝原料丰富易得，原料成本更低。(2)中国传统医药学认为，牛膝性平，适宜人群更广泛，特异体质者长期食用也不易对身体产生不良影响。在我国卫生部于2002年3月5日公布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》中，牛膝已经被批准列入“可用于保健食品的物品名单”。因此，安全性较高，无毒副作用。(3)将牛膝作为单方使用，更易于质量控制。本发明涉及牛膝提取物的制备方法及其在清咽功能方面的新用途。取本发明提取物的有效部位，附加常规使用的辅料，按照常规工艺方法，可制成多种剂型的清咽保健食品或是药品，如清咽保健饮料、清咽保健口香糖、清咽保健糖果制品或是药用片剂、颗粒剂、软
胶囊剂等。
发明内容
本发明的目的是提供牛膝有效部位在清咽功能方面的新用途，并公开牛膝提取物有效部位的制备方法。本发明所述的牛膝提取物，是通过以下方法制备将牛膝以极性溶剂室温提取 3-5次，每次1-3天；将3-5次提取液过滤后合并，常压浓缩得粗提物浸膏。将粗提物浸膏以蒸馏水溶解，采用石油醚脱脂后，分别用乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3-5次，合并正丁醇萃取液，常压浓缩至无醇味后_70°C冷冻干燥成冻干粉，即为牛膝的提取物有效部位。所述的牛膝可取全株植物，包括根、茎、叶和种子，优选地上部分。提取的极性溶剂使用水、醇类，或是水与醇类的混合物。优选的醇包括甲醇、乙醇、 正丁醇或是其混合物，最优选的是乙醇，乙醇浓度为体积比10%-95%。浸提时溶剂量为原料重量的1-15倍。提取可以在静态或是动态下，优选在静态条件下。提取温度从室温到溶剂回流温度的范围内，优选在15°C _35°C的温度下。提取可连续或间歇进行，间歇提取时可重复3-5次，提取时间是8-72小时，优选为M-观小时。本发明还公开了上述牛膝提取物在制备清咽类和/或抗炎类的保健食品或药品中的应用。依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003)中“清咽功能”的评价方法，通过动物实验证明，牛膝的该有效部位对慢性炎症模型的大鼠具有显著的抗炎消肿的作用，可预防慢性炎症类疾病的发生。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。牛膝的该有效部位可以用于各种清咽类和/或抗炎类的保健食品或药品，使用范围包括在此主料基础上，适量添加其它提取物、和/或添加其它原料和/或添加食品添加剂的各种配方。实施例1 牛膝有效部位的制备
选用怀牛膝地上部分包括茎、叶、种子为植物原料，85%的乙醇溶剂在静态条件下浸提， 浸提时溶剂量为原料重量的1倍，温度为室温，间歇提取三次，一次Mh。将上述方法所得的提取液进行合并，过滤。滤液常压加热浓缩至无醇味并呈一定体积后，以蒸馏水转移溶解，通过萃取，得到有效部位。萃取剂分别为石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。具体方法为讲蒸馏水稀释转移液倒入萃取瓶中，先用石油醚脱脂，共3次，合并萃取液；取石油醚萃取水相再以乙酸乙酯进行萃取，共3次，合并萃取水相溶液；再以正丁醇对其进行萃取，共3次，合并正丁醇萃取有机相溶液，常压加热浓缩至无溶剂残留后，入超低温冰箱-70°C冷冻一昼夜，再进冷冻干燥机冻干成粉末，此冻干粉末即为本发明的有效部位。牛膝提取物清咽保健功效的测定
本发明牛膝有效部位经药理学试验实验证实，具有清咽保健功效，可用于制备具有清咽功效的保健品。以下药理实验用于进一步说明但不限于本发明。牛膝有效部位的清咽功效评价实验 1. 1试验材料
试验材料本发明有效部位，置于玻璃干燥器或冰箱内在阴凉处保存。试验动物SPF级Wistar大鼠，单一性别，本实验优选雌性性别，体重150_220g。 共50只，随机分5组，每组10只。试验环境条件无对流风，屏障系统。温度为21_27°C，相对湿度为50%士5。样品处理按《中国药典》2010年版中药材及饮片临床标准修订内容中牛膝用法用量的推荐量4. 5-9. 0g，分别扩大相应倍数，设牛膝有效部位提取物低、中、高剂量，分别为400mg/kg、800mg/kg、1200mg/kg(大概相当于人体推荐剂量的5、10、15倍)。低、中、高剂量受试液配制时分别按容量ImVlOOgBW的标准配制，配制液使用蒸馏水。主要仪器和试剂游标卡尺、大鼠灌胃器、琼脂、解剖手术设备。1. 2试验方法与结果
1. 2. 1大鼠足趾肿胀试验(参照《保健食品检验与评价技术规范》中“清咽功能”的评价方法)
单一性别雌性大鼠按体重分为5组，分别为空白对照组、阳性对照组和3个受试样品剂量组。各组分别按lml/100g灌胃量给药。第一组为空白对照组灌胃给予10ml/kg蒸馏水， 第二组为阳性对照组灌胃给予50mg/kg阿司匹林，第三组为有效部位小剂量组灌胃给予 400mg/kg的活性物质，第四组为有效部位中剂量组灌胃给予800mg/kg的活性物质，第五组为有效部位高剂量组灌胃给予1200mg/kg的活性物质。每日清晨空腹灌胃，晚间禁食12h， 不控制饮水，连续给药30天，试验结束当天再给一次受试样品，1小时后于大鼠右后足趾皮下注入1%琼脂0. Iml/只，分别在致炎后1、3、5、7小时，测量各鼠足趾部厚度，同一部位测量三次，取平均值。分别比较不同浓度样品和空白对照组在不同时间点足趾部厚度差异情况，观察时间不少于30天。任一时间点刺激前后足跖厚度的差值明显减少，差异有显著性， 可判定该受试品动物实验结果为阳性。试验结果
经口灌胃给予Wistar大鼠本发明样品三种不同的浓度30天后，小剂量组即每公斤体重给药400mg组没有表现出抗炎消肿的功能，SPSS统计分析的/7值大于0. 05。中剂量组 800mg/kg和高剂量组1200mg/kg灌胃给药30天后给予致炎剂，分别在1小时、3小时、5小时、7小时时足趾厚度的差值与对空白照组相比差异显著，经SPSS统计软件分析，/7 < 0. 01 或/7 < 0. 05，提示该浓度的受试样品对试验动物具有清咽功能，且抗炎功效可维持7小时之久。
本发明样品的三个剂量组与阳性对照组阿司匹林相比较，抗炎效果略低于阿司匹林；且本发明样品的用药剂量也高于阿司匹林，但与国药字号的抗炎药物相比，从服用安全性或是服用后的毒副作用角度考虑，本样品的食用安全性远比阿司匹林要高。小剂量组经SPSS统计软件分析，ρ值大于0. 05，表明该剂量组的药物对试验动物没有抗炎消肿的影响，抗炎功能不显著。由此可表明，牛膝提取物的抗炎消肿功效是有一定剂量要求的。大鼠琼脂肉芽肿实验(参照《保健食品检验与评价技术规范》中“清咽功能”的评价方法)
单一性别雌性大鼠按体重分为5组，分别为空白对照组、阳性对照组和3个受试样品剂量组。各组分别按lml/100g灌胃容量给药。第一组为空白对照组灌胃给予10ml/kg蒸馏水，第二组为阳性对照组灌胃给予50mg/kg阿司匹林，第三组为有效部位小剂量组灌胃给予400mg/kg的活性物质，第四组为有效部位中剂量组灌胃给予800mg/kg的活性物质，第五组为有效部位高剂量组灌胃给予1200mg/kg的活性物质。给药前各大鼠左腋下注射洲琼脂溶液anl。每日清晨空腹灌胃，晚间禁食12h，不控制饮水，连续给药30天。末次给药后lh， 处死动物，剥离出肉芽琼脂肿块，称取湿重，比较各给药组与空白对照组之间有无统计学差异。实验组与空白对照组比较，肉芽肿净量明显下降，经统计处理差异有显著性，可判定该受试样品动物实验结果阳性。试验结果
给予致炎剂后，经口灌胃给予Wistar大鼠本发明样品三种不同的浓度30天后，小剂量组即每公斤体重给药400mg组没有表现出抗炎消肿的功能，SPSS统计分析的/7值大于 0. 05。中剂量组800mg/kg和高剂量组1200mg/kg灌胃给药30天后，实验组与空白照组相比差异显著，肉芽肿净量明显下降，经SPSS统计软件分析/7 <0.01，提示该浓度的受试样品对试验动物具有清咽功能，且抗炎功效显著。本发明样品的三个剂量组与阳性对照组阿司匹林相比较，抗炎效果虽不及阿司匹林，且本发明样品的用药剂量也远远高于阿司匹林，但与国药字号的抗炎药物相比，从服用安全性或是服用后的毒副作用角度考虑，本样品的食用安全性远比阿司匹林要高。小剂量组经SPSS统计软件分析，ρ值大于0. 05，表明该剂量组的药物对试验动物没有抗炎消肿的影响，不具有抗炎功能。由此可表明，牛膝提取物的抗炎消肿功效是有一定剂量要求的。从试验数据分析可看出，在800mg/kg和1200mg/kg剂量范围内，本发明样品的抗炎功能与用药剂量呈量效正相关关系。2牛膝有效部位的安全性研究 2. 1试验材料
试验材料本发明有效部位(详见实施例1)，置于玻璃干燥器在阴凉处保存。实验动物SPF级Wistar大鼠，雌雄各半。试验环境条件无对流风，屏障系统。温度为21_27°C，相对湿度为50%士5。2. 2试验方法与结果 (1)急性毒性
SPF级Wistar大鼠按外来化学物急性毒性分级(WHO)微毒(5000 mg/kg)剂量灌胃给药。试验结果
SPF级Wistar大鼠雌雄性均未出现急性中毒症状，这个剂量换算到人体的可能致死量为> 1000g/60kg，即60kg体重的人每天服用大于IOOOg的量也许会产生微量的毒副作用， 而一般人每天是无法达到这个剂量的，所以认定牛膝提取物的安全性很高，为确保其性状稳定，我们将继续进行下一步的亚慢性毒理实验，以确保其安全性。( 2 )亚慢性毒性试验(30天喂养)
本发明有效部位(详见实施例1)，以外来化学物急性毒性分级(WHO)微毒剂量5000mg/ kg的剂量灌胃连续给药30天。试验结果
通过30天的喂养实验后观察，10只大鼠(雌雄各半)饮食、活动粪便情况正常，生长发育良好，无一只出现明显中毒症状，也无一只死亡。大鼠的肝、血液循环系统、肠胃系统、泌尿系统、造血或凝血系统、神经系统、眼、呼吸系统、内分泌系统、生殖系统、骨骼系统、心血管系统、皮肤和肌肉的一般检查均无异常反应出现，证明牛膝提取物是无毒、副作用的。长期食用也不会对人体产生不良的副作用。实施例2 选用怀牛膝地上部分包括茎、叶、种子为植物原料，甲醇溶剂回流提取， 浸提时溶剂量为原料重量的5倍，温度为15°C _35°C，间歇提取5次，一次他。将上述方法所得的提取液进行合并，过滤。滤液常压加热浓缩至无醇味并呈一定体积后，以蒸馏水转移溶解，通过萃取，得到有效部位。萃取剂分别为石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。具体方法为讲蒸馏水稀释转移液倒入萃取瓶中，先用石油醚脱脂，共3次，合并萃取液；取石油醚萃取水相再以乙酸乙酯进行萃取，共5次，合并萃取水相溶液；再以正丁醇对其进行萃取，共5次，合并正丁醇萃取有机相溶液，常压加热浓缩至无溶剂残留后，入超低温冰箱-70°C冷冻一昼夜，再进冷冻干燥机冻干成粉末，此冻干粉末即为本发明的有效部位。清咽功效评价与安全性与实施例1相似。实施例3 与实施例1基本相同，不同之处在于原料用10%的乙醇溶剂在静态条件下浸提，浸提时溶剂量为原料重量的15倍，温度为室温，间歇提取三次，一次48h。实施例4 与实施例1基本相同，不同之处在于原料用95%的乙醇溶剂在静态条件下浸提，浸提时溶剂量为原料重量的5倍，温度为室温，间歇提取三次，一次48h。实施例5 与实施例1基本相同，不同之处在于原料用正丁醇溶剂在静态条件下浸提，浸提时溶剂量为原料重量的5倍，温度为室温，间歇提取三次，一次72h。
权利要求
1.一种牛膝提取物，其特征在于，由如下方法制成牛膝以极性溶剂室温提取3-5次， 每次1-3天；将3-5次提取液过滤后合并，常压浓缩得粗提物浸膏；粗提物浸膏以蒸馏水溶解，采用石油醚脱脂后，分别用乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3-5次，合并正丁醇萃取液，常压浓缩至无醇味后冷冻干燥为冻干粉。
2.根据权利要求1所述的牛膝提取物，其特征在于，所述的极性溶剂为水、甲醇、乙醇、正丁醇或水与醇类的混合物。
3.根据权利要求2所述的牛膝提取物，其特征在于，所述的极性溶剂是乙醇，乙醇浓度为体积比10%-95%。
4.权利要求1所述牛膝提取物在制备清咽类和/或抗炎类的保健食品或药品中的应用。
全文摘要
本发明涉及牛膝有效部位及清咽功能方面的新用途。所述牛膝有效部位由如下方法制成牛膝以极性溶剂室温提取3-5次，每次1-3天；将3-5次提取液过滤后合并，常压浓缩得粗提物浸膏；粗提物浸膏以蒸馏水溶解，采用石油醚脱脂后，分别用乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3-5次，合并正丁醇萃取液，常压浓缩至无醇味后冷冻干燥为冻干粉。本发明根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003)中“清咽功能”的评价方法，通过动物实验说明牛膝有效部位对慢性炎症模型的大鼠具有显著的抗炎消肿作用，可以用来制备预防慢性咽炎或抗炎的保健品或药物。
文档编号A61K36/21GK102357108SQ201110308159
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者崔桂友, 潘冬梅 申请人:扬州大学