一种dsRNA与柴胡皂甙的药物的制作方法
【专利摘要】一种dsRNA与柴胡皂甙的药物及其应用，它涉及一种应用于养殖动物病毒性感染防治的药物以及该组合用药物的制备及稳定性控制方法。它的配方组成为：柴胡皂甙含量范围：20-50μg/ml；柴胡挥发油含量范围：紫外吸收值0.45以上；聚肌胞1-3mg/ml，分子量范围：200-500bp(琼脂糖凝胶电泳法)；它的制备方法为：将上述组成部分添加适当的药用辅料按水针剂生产工艺，经配液、过滤、灌封、灭菌、检验合格后即可。它能诱导动物机体产生内源性干扰素，阻遏病毒在动物体内的繁殖。
【专利说明】一种dsRNA与柴胡皂甙的药物
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种应用于养殖动物病毒性感染防治的药物以及该组合用药物的制备及稳定性控制方法，具体涉及一种dsRNA与柴胡皂甙的药物及其应用。
【背景技术】:
[0002]病毒性感染是引起养殖动物死亡、影响动物养殖经济效益的重要因素，随着国家兽药质量标准的规范，取消了大批原地方标准的抗病毒药物，可选用的抗病毒药物的短缺与兽医临床的需求矛盾日益突出。
[0003]1967年，美国Merck药厂的Field等人发现了酶促合成的双链核酸(doublestrained RNA, dsRNA)具有诱生干扰素的能力，其中聚肌胞(Polyinosinic-polycytidylic Acid, PIC)的诱生能力最强,它可以刺激机体产生广谱的内源干扰素，进而激活蛋白激酶和2’，5’ -寡聚腺苷酸合成酶、Mx蛋白等抗病毒因子，以降解进入细胞的病毒，达到抑制、治疗病毒性感染的目的。
[0004]PIC由寡聚肌苷酸与寡聚胞苷酸在合适的条件下按碱基配对的原则聚合而成。研究表明，PIC分子量的大小、双链的紧密程度及其稳定性是决定其诱导干扰素活性高低的重要影响因素。目前，国内虽然有寡聚肌苷酸及寡聚胞苷酸原料的生产，但尚缺乏对双链配对的合适条件、稳定性影响因素等的系统研究，也未见到其与其他活性物质配伍方面的报道。
[0005]国内外的药理学和毒理学研究表明，PIC应用于动物体后，可发生一过性低热的副作用，而如何防止这一副作用的发生，尚未见研究报道。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的是提供一种dsRNA与柴胡皂甙的药物及其应用，它能够诱导动物机体产生干扰素，增强机体免疫力，具有抗病毒作用的合成核酸类化学药品与中药提取物的组合用药物，以及本组合药品稳定性控制方法和在家禽，家畜、宠物和水产动物上的应用。
[0007]为了解决【背景技术】所存在的问题，本发明是采用以下技术方案:它的配方组成为:柴胡皂甙含量范围:20-50 μ g/ml ;柴胡挥发油含量范围:紫外吸收值0.45以上；聚肌胞l-3mg/ml，分子量范围:200_500bp (琼脂糖凝胶电泳法)；它的制备方法为:将上述组成部分添加适当的药用辅料按水针剂生产工艺，经配液、过滤、灌封、灭菌、检验合格后即可。这些组分之间具有一定的促效与 增效作用，并且可以避免dsRNA的副作用。
[0008]为了制成上述的复方制剂，需要对其稳定性进行控制，以确保改组和药品适合保存运输，从而具有上述的药效。
[0009]所述的聚肌胞的合成方法为:
[0010]500ml注射用水中依次加入焦亚硫酸钠0.3g、氯化钠0.6g以及适量的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，加热至20-60°C，进一步优选为30-50°C之间的某一特定温度，加入500mg聚胞苷酸搅拌使溶解，保温10分钟，然后加入500mg聚肌苷酸搅拌使溶解，保温配对15-30分钟；上述溶液中加入紫外吸收值1.6以上、柴胡皂甙含量0.4%以上的柴胡挥发油400ml，充分搅拌混匀，用注射用水定容至1000ml, 0.45um微孔滤膜法过滤,灌封，100°C流通蒸汽灭菌30分钟，灯检、贴标即得。
[0011]所述的柴胡皂甙、柴胡挥发油的分步提取工艺为:
[0012]柴胡饮片按料液比1: 6在30_60°C，进一步优化为35_45°C之间某一特定温度下温溃，收集相当于药材2倍量蒸馏液，减压浓缩，得到较高紫外吸收值的柴胡挥发油；温溃后的柴胡药材，按料液比1: 6，加入体积百分比浓度60-98%之间，进一步优选为75-96%之间某一特定浓度乙醇，加热至45°C，回流提取1-1.5小时提取柴胡皂甙，提取液经浓缩，得到较高浓度的柴胡皂甙。
[0013]因为本组合药物制备过程中需要加入较高浓度的柴胡挥发油及柴胡皂甙，而这两种成分在提取过程中存在相互影响，所以本发明采用了兼顾两种成分的分步提取工艺。
[0014]本发明具有以下特征:通过柴胡皂甙与dsRNA的协同作用，诱导动物机体产生内源性干扰素，阻遏病毒在动物体内的繁殖；另一方面，通过柴胡皂甙疏散退热的功效，避免dsRNA类药物可能出现的一过性低热的副作用。本发明涉及以下过程:二步抽提法制备柴胡皂甙和柴胡挥发油的工艺参数；由聚肌苷酸与聚胞苷酸合成一定分子量大小并且对核酸酶具有一定抗性的dsRNA的工艺参数；本发明的稳定化技术及其对家禽、家畜，水产动物的药效学研究。
【专利附图】
【附图说明】:
[0015]图1为本发明的热源性测定示意图，图2为本发明对新城疫感染免疫后15d时攻毒后试验结果不意图，图3为本发明对新城疫感染免疫后22d时攻毒后试验结果不意图，图4为本发明对猪瘟病毒感染的保护作用示意图，图5为本发明对犬的犬瘟热病毒感染的保护作用示意图，图6为本发明对虹鳟病毒感染的保护作用示意图。
【具体实施方式】:
[0016]【具体实施方式】一:本【具体实施方式】采用以下技术方案:它的配方组成为:聚肌胞、柴胡皂甙和柴胡挥发油；它的制备方法为:将上述组成部分添加适当的药用辅料按一定工艺制成复方制剂；这些组分之间具有一定的促效与增效作用，并且可以避免dsRNA的副作用。
[0017]【具体实施方式】二:参照图1，本【具体实施方式】采用以下技术方案:取用两组试验家兔，分别注射单纯聚肌胞注射液和该组合药物进行热源性试验，记录试验兔体温变化情况。结果表明，该组合药物能够减轻单独聚肌胞注射液的热源反应。
[0018]【具体实施方式】三:参照图2和图3，本【具体实施方式】采用以下技术方案:将该药物用注射用水稀释至50 μ g/ml。将240只试验用雏鸡随机分为6个试验组，每组40只。I组:空白对照组；11组:药物对照组(黄芪多糖注射液，按每千克体重20mg) ；III组:疫苗对照组(无药物)；iv组:高剂量药物试验组(每千克体重0.1mg)…组:中剂量药物试验组(每千克体重0.05mg) ；VI组:低剂量药物试验组(每千克体重0.01mg)。将以上雏鸡隔离笼养，空白对照组与阳性对照组和 用药试验组在不同鸡舍饲养，饲养条件保持一致。饲养至10d，II1、IV、V、VI四个组进行新城疫疫苗免疫。将各组再分别分成两组，其中的一部分在免疫后15d，将I1、IV、V、VI组用药物处理，12h后将I至VI组进行第一次攻毒(攻毒500个单位LD5tl的ND强毒)，攻毒后24h将I1、IV、V、VI组再次注射与首次注射剂量相同的药物观察7d ;每个组的另一半鸡在免疫后21d进行攻毒，处理同第一次。
[0019]结果表明dsRNA与柴胡皂甙的药物对家禽(鸡)病毒病的自然感染发病有明显的保护率和高的治愈率，能够抑制病毒在家禽体内的增殖。尤其对于免疫失败的家禽病毒病的防治具有闻的效果。
[0020]【具体实施方式】四:参照图4，本【具体实施方式】采用以下技术方案:将该药物用注射用水稀释至50 μ g/ml。将60头试验用仔猪随机均分为6个试验组进行试验，每组10头。分组及试验方法如下:第I组为生理盐水对照组；第II组为药物对照组(黄芪多糖注射液，20mg/kg.bw);第III组为疫苗对照组(无药物)；第IV组为疫苗组+药物高剂量组(0.1mg/kg.bw);第V组为疫苗组+药物中剂量组(0.05mg/kg.bw) ?’第VI组为疫苗组+药物低剂量组(0.01mg/kg.bw)。
[0021]将断奶仔猪按以上实验分组隔离饲养，生理盐水对照组与阳性对照组和用药试验组在不同猪舍饲养，饲养条件保持一致。饲养至15天，II1、IV、V、VI4个组分别进行猪瘟疫苗(免疫剂量为常规免疫剂量)免疫。免疫后15天，第II组注射黄芪多糖注射液；IV、V、VI组仔猪肌注药物，12小时后进行攻毒(攻毒剂量为500LD5(i猪瘟强病毒)，攻毒后24小时给药组再次注射与首次注射剂量相同的药液，观察7-15天。
[0022]结果表明dsRNA与柴胡皂甙的药物对猪病毒病的感染发病有明显的保护率和较高的治愈率，能够抑制病毒在家畜体内的增殖。能够降低家畜的死亡率。
[0023]【具体实施方式】五:参照图5，本【具体实施方式】采用以下技术方案:将该药物用注射用水稀释至50μ g/ml。将75只试验用犬随机均分为5个试验组进行试验，每组15只。第I组为空白对照组；第I1、II1、IV组分别以聚肌胞药物高、中、低剂量用药试验组(高剂量组用药剂量为0.lmg/kg.bw ;中剂量组用药剂量为0.05mg/kg.bw ;低剂量组用药剂量为
0.0 lmg/kg.bw);第V组为黄苗多糖注射液药物对照组20mg/kg.bw。
[0024]将比格犬按以上实验分组隔离饲养，空白对照组与阳性对照组和用药试验组在不同犬舍饲养，饲养条件保持一致。饲养一周后，I1、II1、IV组比格犬肌注聚肌胞药物(按照各组的给药剂量给药)，12小时后试验犬全部注射500LD5(i的犬瘟热病毒，攻毒后24小时各组按设计的方法再次注射与首次注射剂量相同的药物，观察7-15天。
[0025]结果表明dsRNA与柴胡皂甙的药物对宠物(犬)病毒病的感染发病有明显的保护率和高的治愈率，能够抑制病毒在宠物犬体内的增殖。
[0026]【具体实施方式】六:参照图6，本【具体实施方式】采用以下技术方案:将150条试验用虹鳟稚鱼随机均分为6个试验组进行试验，每组25条。第I组为空白对照组；第II组为黄芪多糖注射液药物对照组，给药剂量为药物推荐剂量;第II1、IV、V组分别以聚肌胞高、中、低剂量用药(高剂量组用药剂量为0.lmg/kg -bw ;中剂量组用药剂量为0.05mg/kg -bw ;低剂量组用药剂量为0.0 lmg/kg.bw);第VI组为攻毒对照组。
[0027]将虹鳟稚鱼按以上实验分组隔离饲养，空白对照组与阳性对照组和用药试验组在不同渔缸中饲养，饲养条件保持一致。饲养一周后，第II1、IV、V组虹鳟稚鱼腹腔注射聚肌胞注射液，24小时后I1、II1、IV、V、VI注射3000TCID5(I的传染性胰脏坏死症病毒，攻毒后24小时后，按各组方案再次注射与首次注射剂量相同的药液，观察结果。
[0028]结果表明dsRNA与柴胡皂甙的药物能够抑制水产鱼类病毒病增殖。从而达到对水产鱼类病毒病感染的治疗与预防作用。
【权利要求】
1.一种dsRNA与柴胡皂甙的药物，其特征在于它的配方组成为:柴胡皂甙含量范围:20-50 μ g/ml ;柴胡挥发油含量范围:紫外吸收值0.45以上；聚肌胞l_3mg/ml，分子量范围:200-500bp，它的制备方法为:将上述组成部分添加适当的药用辅料按水针剂生产工艺，经配液、过滤、灌封、灭菌、检验合格后即可。
2.根据权利要求1所述的一种dsRNA与柴胡皂甙的药物，其特征在于所述的聚肌胞的合成方法为:500ml注射用水中依次加入焦亚硫酸钠0.3g、氯化钠0.6g以及适量的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，加热至20-60°C，加入500mg聚胞苷酸搅拌使溶解，保温10分钟，然后加入500mg聚肌苷酸搅拌使溶解，保温配对15-30分钟；上述溶液中加入紫外吸收值.1.6以上、柴胡皂甙含量0.4%以上的柴胡挥发油400ml，充分搅拌混匀，用注射用水定容至1000ml, 0.45um微孔滤膜法过滤，灌封，100°C流通蒸汽灭菌30分钟，灯检、贴标即得。
3.根据权利要求1所述的一种dsRNA与柴胡皂甙的药物，其特征在于所述的柴胡皂甙、柴胡挥发油的分步提取工艺为:柴胡饮片按料液比1: 6在30-60°C，收集相当于药材2倍量蒸馏液，减压浓缩，得到较高紫外吸收值的柴胡挥发油；温溃后的柴胡药材，按料液比1: 6，加入体积百分比浓度60-98%之间浓度乙醇，加热至45°C，回流提取1-1.5小时提取柴胡皂甙，提取液经浓缩，得到较高浓度的柴胡皂甙。
【文档编号】A61P31/12GK103751237SQ201110308866
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2011年10月13日 优先权日:2011年10月13日
【发明者】胡鲸波 申请人:胡鲸波