专利名称：川产九节龙皂甙作为制备抗肿瘤药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从植物中提取出的化合物。
川产九节龙(Ardisea pusilla A.DC)系紫金牛科紫金牛属植物的全草，有清热解毒、消肿止痛的功用，民间用于跌打损伤，活血通络，亦可用于蛇咬伤。从川产九节龙中提取出的化合物——川产九节龙皂甙用于制备抗肿瘤药物，国内外尚未见报道。
本发明的目的在于从川产九节龙中提取出的化合物——川产九节龙皂甙，用于制备抗肿瘤药物。
本发明的技术实施方案用95％的乙醇提取九节龙全草粗粉，减压浓缩得浸膏，加水搅拌后，静置过滤，滤液用石油醚，乙醚，乙酸乙脂和正丁醇顺次萃取，将萃取物丙酮沉淀，经硅胶低压柱、层析，加溶剂CHCL3-MeOH-H2O(65∶35∶10，下层)洗脱得晶体化合物。化合物为白色针晶，mp239-241C，红外光谱显示有羟基(3423cm-1)，醛基(2700和1716cm-1)和环醚(1075和1044cm-1)。质谱m/21097(M+Na)+，分子量1074，结合元素分析分子式为C53H86O22.2H2o.化合物的C13核磁共振谱δ101.7，104.4，105.3和103.2ppm信号，其乙酰化物1H核磁共振谱有11个乙酰基信号，都表明化合物中存在四个糖基，化合物在高效硅胶薄层板上用酸蒸气水解，检出D-葡萄糖、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖，经薄层扫描得各糖的比例为2∶1∶1，化合物13C核磁共振谱δc-389.1ppm比甙元向低场移 11.0ppm，δc-226.6ppm比甙元向高场移1.7ppm(表1)，说明糖链与甙元C3-OH相连接。质谱提示了糖链连接的重要信息m/z1097(M+Na)+951(M+Na-146)+，935(M+Na-162)+，626(甙元+Na+132)+，表明糖链是分枝的。化合物的乙酰化物的质谱m/z273(乙酰鼠李糖)、331(乙酰葡萄糖)、561(乙酰鼠李糖-乙酰葡萄糖)。化合物的分步水解试验检出各糖水解顺序为鼠李糖、葡萄糖和阿拉伯糖，以上都表明糖连接顺序为一个葡萄糖和一个鼠李糖葡萄双糖同时与阿拉伯糖相连。由化合物的13C-1H相关谱四个糖基的端基质子(1-H)信号分别出现在δ6.39、5.37、5.21和4.94ppm，在δ3.8-4.7谱区内各糖基的质子信号彼此重迭，用一般方法难以确定其归属，遂采用了一维多重接力相关谱新方法作了研究，此法可以从高度重迭的谱峰中分离和识别出每个糖基的全部质子信号，各糖基质子的化学位移和偶合常数总结于表2。由各糖端基碳的13C核磁共振谱信号确定了各糖的构型，葡萄糖为β-D-型，鼠李糖和阿拉伯糖为α-L-型，再结合NOE差谱(照射1H核使与它偶合的13C核的信号强度增大的效应称为核奥呋豪斯效应即NOE效应或NOE差谱)选择激发各糖基的1-H，观基NOE增益信号，再与一维多重接力谱相对照，这些NOE增益信号得以归属(见表3)。根据NOE效应与核间距关系，从而测定出糖链的结构为
化合物的结构式为3-0-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)][β-D-吡喃葡萄糖(1→2)]α-L-阿拉伯糖-西克拉敏A分子式
表1在氘代吡啶溶液中甙元分子的13C化学位移值C九节龙皂甙I西克拉明皂甙A C 九节龙皂甙I西克拉明皂甙A1 39.639.5 16 76.976.82 26.628.3 17 48.348.23 89.178.1 18 50.450.64 39.239.5 19 24.224.15 55.655.7 20 36.937.36 18.018.2 21 36.836.87 32.732.7 22 32.432.38 44.144.0 23 28.128.69 53.453.3 24 16.416.310 42.642.6 25 16.516.511 19.219.2 26 19.819.812 30.530.7 27 18.618.613 86.586.4 28 77.777.714 44.644.6 29 24.424.115 33.433.4 30 207.9 207.3
表2在氘代吡啶溶液中糖分子质子的化学位移值和偶合常数
表3 在氘代吡啶溶液中糖分子的NOE值
川产九节龙皂甙对体外培养的癌细胞分化诱导作用-MTT法其原理是四唑蓝化合物MTT(Methylthiazolyl tertrazolium)在活细胞线业体酶作用下可裂解为紫色不溶性的甲化合物，加入二甲基亚砜后用酶标仪测出其光密度变化，可求出抗癌药物作用的瘤细胞数量变化，以此求出细胞的存活率，根据肿瘤细胞的半数致死量(ID50)判断肿瘤细胞对抗癌药的敏感程度。将肝癌(SMMC-7721)、肝癌(HCC-9204)、肺癌(A549)、胃癌(SGC-7901)、卵巢癌(HO-8910)、宫颈癌(Hela)、食管癌(Eca-109)、肾癌(GRC-1)8种人肿瘤细胞制成单细胞悬液，在96孔平面培养板中，细胞(5×104/ml)和川产九节龙皂甙水溶液一起培养72h后，加入MTT20ul，继续培养4h，离心，弃上清液，加150ul二甲基亚砜溶液沉淀，测定OD490。
计算细胞存活率的公式
结果MTT法测定表明川产九节龙皂甙对8种人肿瘤细胞的抑制作用皆至剂量-效应关系，随药物的浓度增加，细胞存活率逐渐下降。(见下表)MTT法测定8种肿瘤细胞存活率(％)<
>本发明的优点从川产九节龙中提取的化合物——川产九节龙皂甙，系新发现的具有抗肿瘤药物的化合物，实验表明此化合物对8种人肿瘤细胞的抑制作用皆呈剂量——效应关系，随药物浓度增加，细胞存活率逐渐下降。
实验还表明川产九节龙皂甙水溶液小鼠LD50分别为iv10.29±0.84mg/kg，95％可信限为9.50-11.17mg/kg；ig666.70±55.82mg/kg，95％可信限为613.30-724.82mg/kg。说明化合物iv给药LD50很小，不宜推荐为临床给药方式，而口服给药LD50约为最小有效量的12倍，说明本途径安全性较大，值得进一步开发。
具体实施例方式九节龙全草粗粉20kg用95％乙醇EtOH提取，减压浓缩得浸膏1785g，加H2O搅拌后，静置过滤，滤液用石油醚，乙醚Et2O，乙酸乙脂EtOAc，和正丁醇n-BuOH顺次萃取，正丁醇n-BuOH萃取物丙酮Me2CO沉淀得总皂甙61g，经硅胶低压柱层析，溶剂CHCl3-MeOH-H2O(65∶35∶10下层)洗脱得晶体化合物20g。
权利要求
1.川产九节龙皂甙作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于用95％的乙醇提取九节龙全草粗粉，减压浓缩得浸膏，加水搅拌后，静置过滤，滤液用石油醚，乙醚，乙酸乙脂和正丁醇顺次萃取，将萃取物丙酮沉淀，经硅胶低压柱层析，加溶剂CHCl3-MOH-H2O(65∶35∶10下层)洗脱得晶体化合物；经化学分析鉴定，此化合物的分子结构式为3-0-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)][β-D-吡喃葡萄糖(1→2)]α-L-阿拉伯糖-西克拉敏A分子式
将此化合物命名为川产九节龙皂甙。
2.根据权利要求1所述的川产九节龙皂甙作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于化合物川产九节龙皂甙对肿瘤细胞有抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。
全文摘要
川产九节龙皂甙作为制备抗肿瘤药物的应用,涉及从植物中提取出的化合物,以川产九节龙为原料,经醇提、减压浓缩,萃取、低压层析,洗脱等一系列提取方法,得晶体化合物—川产九节龙皂甙,经实验,川产九节龙皂甙对肿瘤细胞的基因复制有抑制作用,而口腹给药LD
文档编号A61P35/00GK1266687SQ9911573
公开日2000年9月20日 申请日期1999年3月12日 优先权日1999年3月12日
发明者王晓娟, 朱玲珍, 王四旺 申请人:中国人民解放军第四军医大学