专利名称：抗呼吸道病毒转移因子生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防和治疗常见呼吸道病毒感染的药物生产工艺，特别涉及一种由呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、流感病毒及疱疹病毒提取的特异性抗原免疫哺乳动物而制备的抗呼吸道病毒转移因子生产方法。
感冒是由病毒引起的上呼吸道感染，是人类最常见的疾病，且常由于该疾病引起多种严重的并发症，被认为是“百病之首”。全世界用于预防和治疗感冒的费用惊人，以英国为例，虽仅有5千多万人口，但每年用于预防及治疗感冒及并发症的费用超过数百亿美元。国内外现有的抗感冒药物主要是减轻感冒症状，预防并发症发生，并不能从病因学角度治愈上呼吸道感染。
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提出一种抗呼吸道病毒转移因子药物生产工艺，具有既可预防，又可治疗，标本兼治的特点。
根据转移因子分子量小，无免疫原性，且在哺乳动物间无种属特异性的免疫学原理，本发明采用呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、流感病毒及疱疹病毒等常见的呼吸道病毒提取的特异性抗原，免疫哺乳动物，取其脾脏、淋巴结组织，用分子筛过滤及透析方法提取有效成份，研制出抗多种病毒特异性转移因子。因为人体抗病毒主要是通过细胞免疫和体液免疫的特异性细胞及抗体识别，引起特异性的免疫反应，从而杀灭及清除体内病毒，转移因子可以把通过特异性抗原免疫的具有针对病毒特异性的免疫信息传递给人体免疫细胞，从而引起人体特异和快速的免疫反应，杀灭及清除病毒。另外，呼吸道病毒侵害人体必须首先在上呼吸道找到合适的病毒受体，造成上皮细胞感染，然后侵入人体。本发明的抗呼吸道病毒转移因子通过增强上呼吸道的免疫杀伤细胞特异性杀伤功能及调节粘膜免疫机制，起到预防及治疗上述病毒感染的作用。
本发明的生产工艺如下首先，制备呼吸道病毒抗原将呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒及单纯疱疹病毒，分别接种于已长成单层的Hep-2细胞或BHK细胞，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当CPE出现+++或++++时，收集细胞及上清，放冰箱低温冰冻保存。
流感病毒接种于10天龄鸡胚尿囊液及羊膜腔，33℃ 48～72小时，收集尿囊液及羊水，以鸡或豚鼠RBC测流感病毒HA。
其次，以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒及单纯疱疹病毒的感染细胞CPE+++或++++后，用少许培养液刮下细胞，装厚壁小瓶子内，超声打碎，5000rpm离心20分钟，弃去沉渣留上清。装入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，165000×g 3小时，根据不同病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出备用。流感病毒接种后48～72小时，取鸡胚尿囊液，超声粉碎，取离心上清，不连续梯度密度离心提取病毒抗原，提取方法同上述其它病毒。
然后，用所提取的病毒抗原免疫动物挑选健康哺乳动物(羊体重30～50公斤，猪体重60～90公斤)，取上述制备的病毒抗原，免疫动物，共免疫5～6次。前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫。第3次以后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周。最后一次免疫7天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾及淋巴结节组织，低温冰箱冰冻保存备用。
最后，提取抗呼吸道病毒转移因子病毒免疫的动物脾及淋巴结组织，去其表面的筋膜、脂肪等组织，灭菌生理盐水反复冲洗，剪碎，经组织匀浆机高速粉碎，反复冻融4～6次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎，然后以超滤或透析的方法提取。以透析方法提取时，透析液为0.9％生理盐水，放4℃冰箱透析，放置24小时后收集透析液并以小于0.2μm的微孔滤膜过滤、除菌，放冰箱冰冻保存备用。
抗呼吸道病毒转移因子的安全试验①热原试验取健康成年兔子5只，耳缘静脉注射抗呼吸道病毒转移因子2ml，分别于注射前、注射后30分钟、1小时、2小时，肛门测体温，平均升温，不超过0.5℃。
②急性毒性实验取健康小白鼠5只尾静脉注射抗呼吸道病毒转移因子0.5ml,72小时内没有死亡。
③过敏试验取体重250～350g健康豚鼠5只，连续3次隔日注射本品0.5ml,2周后，再自静脉注射本品1ml，注射后15分钟内，观察动物没明显竖毛、呼吸困难、痉挛、虚脱及死亡等现象。
④无菌试验将抗呼吸道病毒转移因子，分别接种于需氧菌、厌氧菌及霉菌培养管内，30～35°培养5日内没有细菌生长。
⑤活性测定采用活性淋巴细胞E-玫瑰花试验，本品的淋巴细胞花结百分率比对照管高30％以上。
按本发明方法提取的抗呼吸道病毒转移因子具有如下的理化性质1．本发明因含有少量次黄嘌呤，对光检查外观为无色或呈微黄色液体。
2．PH值为7.0～7.2。
3．紫外吸收光谱是本品的一个重要特性，因含有核苷酸，多肽类小分子物质成份，其中含有的嘌呤及嘧啶硷基都具有共轭的双键结构，能强烈吸收250～255nm波长的紫外光，其最大吸收波长在252±2nm。
4．本发明因不含大分子蛋白成份，以紫外吸收光谱OD值260nm/280nm≥2.0作为制剂的纯度指标。
5．多肽含量测定，按Lowry法进行(中国生物制品规格，1990年版第一部301页)；多肽含量每ml≥500μg。
6．核糖含量测定(按中国生物制品规格1990年版第一部321页)，核糖含量每ml≥50μg。
抗呼吸道病毒转移因子对上呼吸道病毒感染不但具有预防作用，还具有治疗功效。经药理学、毒理学等实验证明无毒、副作用，并经临床验证适用于急性上呼吸道病毒感染，反复呼吸道感染、急性咽炎、喉咽、支气管炎以及病毒性眼结膜炎，并可预防感冒。尤其对儿童、老年人及肌体抵抗力低下的患者，能起到增强免疫功能预防感冒的功效。
实施例1．抗呼吸道病毒转移因子雾化滴鼻液按上述方法制备的抗呼吸道病毒转移因子每ml加入8000单位庆大霉毒或其他可局部应用的广谱抗生素。
呼吸道病毒感染首先是病毒感染呼吸道上皮细胞并在局部繁殖或其代谢产生扩散入血造成全身症状，同时破坏局部粘膜功能，造成局部菌群失调及致病菌侵入，引起继发感染。抗呼吸道转移因子雾化滴鼻液所含的抗呼吸道病毒转移因子可起到特异性增强人体T淋巴细胞识别及杀灭病毒能力，阻止病毒在人体进一步扩散，同时所含的抗生素成份可抑制或杀灭局部致病菌的繁殖，防止继发感染，减轻或消除临床症状。用法滴鼻成人每次4～5滴，小儿每次2～3滴，每日4～5次。
滴眼每次1～2滴，每日3～4次。
雾化每次2ml，每日1～2次(可与化痰药物及抗生素联用)。贮藏及有效期贮于4℃冰箱或冰冻(勿反复冻融)，有效期18个月。
2．抗呼吸道病毒转移因子注射液上述方法制备的抗呼吸道病毒转移因子经除菌过滤后，无菌分装安瓿内，每支2ml，火燃封口。
抗呼吸道病毒转移因子注射液可直接将较大剂量的活性抗病毒转移因子注入肌体内，能快速高效调动人体免疫系统，增强抗病毒能力。用法肌肉注射，儿童每次1～2ml，成人每次2～4ml，每日或隔日注射一次。贮藏及有效日期4℃冰箱或冰冻保存(勿反复冻融)有效期18个月。
权利要求
1．抗呼吸道病毒转移因子生产工艺，其特征在于，首先制备呼吸道病毒抗原，其次以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原，然后用所提取的病毒抗原免疫动物，最后从免疫动物中提取抗呼吸道病毒转移因子。
2．根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，将呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒及单纯疱疹病毒，分别接种于已长成单层的Hep-2细胞或BHK细胞，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当CPE出现+++或+++++后，用少许培养液刮下细胞，装厚壁小瓶子内，超声打碎，5000rpm离心20分钟，弃去沉渣留上清，装入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，165000×g 3小时，根据不同病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出备用。
3．根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，将流感病毒接种于10天龄鸡胚尿囊液及羊膜腔，33℃下48～72小时，取鸡胚尿囊液，超声粉碎，取离心上清，然后不连续梯度密度离心提取病毒抗原。
4．根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，挑选健康哺乳动物取制备的病毒抗原，免疫动物，共免疫5～6次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次以后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾及淋巴结节组织。
5．根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，将病毒免疫的动物脾及淋巴结组织，去其表面的筋膜、脂肪等组织，灭菌生理盐水反复冲洗，剪碎，经组织匀浆机高速粉碎，反复冻融4～6次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎，然后以超滤或透析的方法提取。
6．根据权利要求1、5所述的生产工艺，其特征在于，以透析方法提取时，透析液为0.9％生理盐水，放4℃冰箱透析，放置24小时后收集透析液并以小于0.2μm的微孔滤膜过滤、除菌即可。
全文摘要
一种抗呼吸道病毒转移因子生产工艺,首先制备呼吸道病毒抗原,其次以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原,然后用所提取的病毒抗原免疫动物,最后从免疫动物中提取抗呼吸道病毒转移因子,可以制备成注射液或滴鼻液药物,具有既可预防,又可治疗,标本兼治的特点。
文档编号A61P31/00GK1234276SQ99115750
公开日1999年11月10日 申请日期1999年4月12日 优先权日1999年4月12日
发明者许东亮, 张国成 申请人:中国人民解放军第四军医大学第一附属医院