专利名称：一种三股螺旋银耳多糖及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多糖领域，具体涉及一种三股螺旋银耳多糖及其制备方法和应用。
背景技术：
银耳(Tremella fuciformis Berk)，又名白木耳、雪耳，其内含有碳水化合物、蛋白质、维生素和多种氨基酸等，是滋补强壮、扶正固本的良药。银耳子实体由数片至10余片薄而多皱褶的瓣片组成，呈菊花形、牡丹花形或绣球形，直径3-15cm，白色或类黄色，表面光滑，有光泽，基蒂黄褐色；角质，硬而脆；浸泡水中膨胀，有胶质，气微，味淡，新鲜时软，干后收缩；多生于栎及其他阔叶树腐本上。据国内外的药理作用研究，银耳多糖具有可以调节动物的肠道有益菌群从而增强免疫力的作用；通过调节体液免疫、细胞免疫和细胞因子增强免疫系统的调节能力；直接或间接的对肿瘤细胞具有杀伤作用，是潜在的抗肿瘤药物； 能清除自由基延缓衰老的作用；调节血糖血脂水平，缓解由于高血糖血脂引起的一系列疾病；此外银耳多糖还有抗凝血血栓、抗溃疡、促进蛋白质合成、抗病毒、促进神经细胞生长及改善记忆力等多方面的活性。现有的银耳多糖的制备方法多采用酸碱或微波提取，可以增加多糖的提取率。现有的银耳多糖的制备方法如中国专利ZL200810M0804. 3中公开了一种银耳提取物及其制备方法，是用去离子水浸泡银耳后，调节PH值至8. 5-9. 0之间，于85-95°C恒温反应，过滤浓缩后，得到银耳提取物。中国专利申请CN20041007^65.5中公开了几种均一体银耳(孢子)多糖及其提取方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，提取方法包括将银耳孢子发酵物经水煮、醇沉或不同浓度的NaOH水溶液梯度提取，经柱层析分离、纯化得到含量在90%以上碱提银耳多糖ATF-A、ATF-B, ATF-C, ATF-D，水提银耳多糖WTF-A、 WTF-B。中国专利ZL02144648. 2中公开了银耳多糖，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，其制备方法包括将银耳孢子、银耳子实体加水搅拌均勻制成水溶液，离心后取上清液经活性炭过柱两次，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60%，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80%，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。中国专利申请CN20041007^64. 0中公开了具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物及其制备方法和含它们的制剂。中国专利ZL 200710014978. 3中公开了一种银耳多糖的酶法逆向提取工艺，将银耳浸于水中，调节PH至7. 3-7. 6，将膨胀后的银耳移入酶解液中进行酶解，酶解温度为35-38°C，pH7. 5-8. 5，时间1_2H，从酶解液中移出酶解后的银耳，置于碱性溶液中，浸泡后，升温至90-98°C，持续0. 5-1. 0H,搅动，除去液面浮出的泡沫残渣，将絮状固形物移出，置于酸性溶液中，浸泡20-40分钟，移出絮状固形物，置于弱碱溶液中，浸泡10-20分钟，再移入清水，取出，浙干，脱水，低温干燥，得银耳多糖。中国专利ZL 200510023427. 4中公开了银耳杂多糖及其提取物、制备方法和用途，银耳杂多糖，其结构以 α-(1-3)甘露糖为主链，主要由重量百分比为70-93%的中性总糖、6-28%的葡萄糖醛酸、 0. 1-3%的结合蛋白组成；该银耳杂多糖的平均分子量为85-160万道尔顿，其中分子量大于6000道尔顿的占90% (重量)以上。中国专利ZL200910059901. 7中公开了一种以银耳次、残品及耳脚为原料制备银耳多糖的方法，将银耳次、残品及耳脚3 30重量份加水浸泡 20 30MIN，浙干，置于温度-20 -10°C冷冻6 10H，然后粉碎至粒径1 3匪；将上述粉碎后的银耳粒料与水按固液比1 40 80混合均勻，经功率700W，温度90 100°C微波处理15 25MIN，按总固液比1 80定容；再将上述微波处理后的原料放入三角瓶中， 在温度60 80°C水浴中振荡1 2H，经3000 5000RPM离心10 20MIN，取上层清液在真空度0. 08 0. 09MPA、温度55 65°C浓缩至20 30%体积，在温度10 20°C，搅拌加入2 3倍体积的冷藏无水乙醇沉淀粗多糖，静止沉淀后过滤，获得糖泥在真空度0. 08 0. 09MPA、温度55 65°C干燥6 10小时，获得粗多糖产品。上述报道大多是关于多糖粗提取的方法，部分专利或专利申请对单一组分结构进行分析是关于银耳多糖的一级结构的探讨，并没有涉及到活性或高级结构的鉴定。
发明内容
本发明提供了一种三股螺旋银耳多糖。—种三股螺旋银耳多糖，具有三股螺旋结构，各股螺旋结构以1 — 6连接的α -甘露糖为主链，以与主链1 — 2连接的β -岩藻糖为侧链，以与主链1 — 4连接的α -葡萄糖醛酸为侧链，以与主链1 — 2连接的α -木糖为侧链；包括重量百分含量为81. 9% 的总糖和重量百分含量为6. 8%的葡萄糖醛酸，不含核酸和蛋白；其中所述的总糖的组成为甘露糖、木糖和岩藻糖，所述的甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和岩藻糖的物质的量之比为 5.78 0.7 1. 10 1 ；所述的三股螺旋银耳多糖25°C的特性粘度为1392.8ml/g。所述的三股螺旋银耳多糖的侧链有多种不同的变化组合，如可具有如结构式I所示的结构单元
权利要求
1.一种三股螺旋银耳多糖，具有三股螺旋结构，各股螺旋结构以1 — 6连接的α-甘露糖为主链，以与主链1 — 2连接的β -岩藻糖为侧链，以与主链1 — 4连接的α -葡萄糖醛酸为侧链，以与主链1 — 2连接的α -木糖为侧链；包括重量百分含量为81. 9% 的总糖和重量百分含量为6. 8%的葡萄糖醛酸，不含核酸和蛋白；其中所述的总糖的组成为甘露糖、木糖和岩藻糖，所述的甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和岩藻糖的物质的量之比为 5.78 0.7 1. 10 1 ；所述的三股螺旋银耳多糖25°C的特性粘度为1392.8ml/g。
2.一种三股螺旋银耳多糖的制备方法，包括步骤(1)水提将银耳子实体粉碎得到银耳子实体粉末，加入蒸馏水，每克银耳子实体粉末加入50mL-60mL蒸馏水，90°C -100°C浸提4小时-6小时后离心，取上清液；离心所得沉淀可按所述水提方法重复1-2次，合并上清液得到银耳多糖水提液；(2)醇沉向步骤(1)中的银耳多糖水提液中加入4倍-5倍银耳多糖水提液体积的乙醇水溶液，搅拌混勻，于2°C _5°C沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次银耳粗多糖；所述的乙醇水溶液的体积百分浓度为90% -96% ；(3)去蛋白将步骤(2)所得的一次银耳粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；(4)透析步骤C3)所得的提取液用孔径为8000Da-14000Da的透析袋在自来水中透析 40h-50h,再用去离子水透析40h-50h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次银耳粗多糖；(5)纯化将步骤(4)得到的二次银耳粗多糖用去离子水溶解得到二次银耳粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素52离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状三股螺旋银耳多糖。
3.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，离心的速度为 3000rpm-4000rpm，时间为 15min_30min。
4.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，每克银耳子实体粉末加入50mL蒸馏水，96°C浸提4小时，离心的速度为4000rpm，离心的时间为 20min。
5.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，( 醇沉向步骤(1)中的银耳多糖水提液中加入4倍银耳多糖水提液体积的乙醇水溶液，搅拌混勻，于 4°C沉淀过夜，再于4000rpm离心20min，取离心所得沉淀得到一次银耳粗多糖；所述的乙醇水溶液的体积百分浓度为95%。
6.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶；所述的有机溶剂为氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为5 1。
7.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的二次银耳粗多糖水溶液的浓度为5mg/mL 30mg/mL，流速为lml/min。
8.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的二乙氨基乙基纤维素52离子交换层析柱层析的条件为采用梯度洗脱，洗脱液为 0. lmol/L-0. 6mol/L 的 NaCl 水溶液，流速 lml/min。
9.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)中， 所述的凝胶过滤层析的条件为流速0. 5ml/min，洗脱液为0. 05mol/L磷酸盐缓冲液和 0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3 1。
10.一种权利要求1所述的三股螺旋银耳多糖在制备抗氧化剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种三股螺旋银耳多糖及其制备方法和应用，制备方法步骤包括水提醇沉提取银耳多糖组分，经酶-Sevage结合法去蛋白、透析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，真空冷冻干燥分离纯化组分即为银耳多糖。利用本发明制备银耳多糖，不影响其天然结构和活性，该方法对设备要求较低、成本低，利于工业生产上大规模的推广、开发和使用。本发明对纯化后多糖进行组分分析、结构鉴定及抗氧化活性研究，发现本发明银耳多糖有较强的清除羟自由的活性，是潜在的抗氧化物质。
文档编号A61P39/06GK102336840SQ20111031494
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者李卫旗, 贺亮, 韦朝阳, 马素云 申请人:浙江大学