一种米非司酮诱导的caspase-1-ES细胞系的制作方法

专利名称：一种米非司酮诱导的caspase-1-ES细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞系，具体地说，是一种米非司酮诱导的caspase-1-ES细胞系及其制备方法和应用。
背景技术：
帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是发病率居第二位的常见的神经系统变性疾病，其病理特征主要表现为黑质多巴胺能神经元的丢失和路易小体的形成。常用的治疗策略仅仅局限于对症治疗，尽量减轻患者的临床症状，这类治疗手段并不能够从根本上逆转PD的发生和发展。胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ES细胞)是具有多种分化潜能的细胞，能够诱导分化成为特定的细胞类型，这种特性使其在细胞替代治疗方面具有广阔的前景。ES细胞移植有望应用于治疗PD，但是混入移植物的少量未分化ES细胞可能在体内形成肿瘤，这对患者是很大的威胁。肿瘤是ES细胞移植常见的风险，这是由移植细胞中混入的幼稚细胞造成的。最常见的自杀基因治疗是将一个对细胞自身无害的酶的基因转入细胞，但这个酶能将无毒的药物前体转变为有毒的形式杀死该细胞，例如HSVtk/GCV系统。转入HSVtk的ES细胞会被 GCV诱导死亡。但是考虑到细胞毒效应和旁观者效应，尚不能证实GCV存在时所需的分化成熟的细胞能够存活。与HSVtk/GCV系统相比，caspase-Ι是细胞内固有的基因，caspase-1 表达导致的细胞死亡效果是局限于特定的细胞类型。在不同的细胞类型中caspase-Ι表达产生的效果不同。caspase-Ι的激活在肿瘤细胞中会导致细胞死亡，但在上皮细胞，CHO (Chinese hamster ovary cell，中国仓鼠卵巢)细胞和Hela细胞中反而有助于细胞存活。 但是关于将caspase-Ι转入ES细胞，既维持ES治疗的疗效，又降低ES细胞移植成瘤的风险目前还未见报道。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种米非司酮诱导的caspase-1-ES 细胞系。本发明的再一的目的是，提供一种米非司酮诱导的caspase-1-ES细胞系的制备方法。本发明的另一的目的是，提供一种米非司酮诱导的caspase-1-ES细胞系的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种米非司酮诱导的caspase-1-ES 细胞系，所述的caspase-1-ES细胞系的保藏号为CCTCC C201193。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种米非司酮诱导的 caspase-1-ES细胞系的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤
a、pSwitch质粒线性化后用Lipofectamine2000转染入CGR8细胞，用Hygromycin筛选出pSwitch稳转株；
b、PCR反应扩增caspase-Ι的全长cDNA；C、对caspase-1 cDNA和pGene载体进行双酶切，酶切产物以Solution I连接后转化入大肠杆菌；
d、从大肠杆菌中抽提质粒，线性化后用Lipofectamine2000转染入pSwitch稳转株， 用kosin筛选稳转株；
e、挑单克隆进行扩增，用RT-PCR和westernblot鉴定。所述的步骤b中caspase-Ι的全长cDNA序列是SEQ ID N0. 3所述的核苷酸序列。所述的步骤b中PCR反应扩增caspase-Ι的全长cDNA所用的引物序列是SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所述的核苷酸序列。所述的ES细胞为小鼠ES细胞。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是所述的caspase-1-ES细胞系在制备治疗帕金森病药物中的应用。所述的caspase-1-ES细胞系在干细胞移植中的应用。所述的caspase-1-ES细胞系在干细胞移植中的应用是指caspase-1-ES细胞系在制备治疗可以采用干细胞移植来治疗的疾病药物中的应用，所述的可以采用干细胞移植来治疗的疾病是指脑瘫、脊髓损伤、运动神经元病、脑出血、脑梗塞后遗症、脑外伤后遗症、糖尿病、皮肌炎、肌无力、血管病变、硬化病、白血病、肝病、肝硬化、股骨头坏死。本发明优点在于
1、本发明首次将caspase-Ι转入ES细胞，且不影响该细胞分化潜能。首次在ES细胞内高表达caspase-Ι，证实caspase-Ι激活后通过引发DNA损伤导致体外未分化的 caspase-1-ES细胞死亡，可以降低ES细胞移植成瘤的风险；
2、本发明首次发现在分化的ES细胞内高表达caspase-Ι对细胞无显著影响，有助于维持ES细胞治疗的疗效；
3、本发明建立的caspase-1-ES细胞系既提高了胚胎干细胞移植的安全性又保留了治疗帕金森病的效果，可以在干细胞移植中广泛应用。


图1是GeneSwtich系统运作机制图解。图2是米非司酮对诱导pSwitch-ES细胞GFP表达的效果呈剂量依赖。图3是米非司酮诱导caspase-1 mRNA在caspase-1-ES细胞内高表达，且呈剂量依赖(n=3)。图4是米非司酮诱导caspase-Ι在caspase-1-ES细胞内的高表达。图5是米非司酮诱导caspase-1-ES细胞死亡。图6是米非司酮诱导caspase-1-ES细胞死亡，且呈时间依赖(n=10)。图7是米非司酮诱导caspase-1-ES细胞死亡，且呈剂量依赖(n=10)。图8是米非司酮诱导caspase-1-ES细胞出现DNA剪切。图9是经过3周米非司酮处理caspase-1-ES细胞形成的肿瘤体积明显缩小。图10是caspase-1-ES细胞形成的肿瘤体积注射米非司酮后明显减少，而野生型细胞生成的肿瘤体积未受米非司酮影响。图11是组织切片显示肿瘤内存在早期的内胚层、中胚层和外胚层，证实畸胎瘤形成。图12是注射3周米非司酮后caspase-1-ES细胞形成的肿瘤细胞死亡。图13是注射米非司酮使caspase-1-ES细胞形成的肿瘤内caspase-Ι表达量显著增长。图14是米非司酮诱导caspase-1-ES形成的肿瘤细胞出现DNA剪切。图15是注射米非司酮后无caspase-1-ES细胞形成的肿瘤细胞存活。图16是caspase-1-ES细胞分化为多巴胺能神经元。图17是米非司酮处理6天后分化的caspase-1-ES细胞无明显变化。图18是米非司酮处理2-6天后分化的caspase-1-ES细胞无明显变化。图19无论有无米非司酮，分化的canspase-1-ES细胞都未出现DNA剪切。图20是米非司酮处理使caspase-1-ES细胞内caspase-1 plO表达增加。图21是在米非司酮处理后分化的MAP2+/TH+的caspase-l-ES细胞仍然存活。图22是MAP2+或TH+克隆比例不受米非司酮影响。图23是未分化的野生型和caspase-1-ES细胞均为0ct_4+，而分化的 caspase-1-ES细胞中混有0ct_4+细胞。图24是注射米非司酮延长了移植未分化caspase-1-ES细胞的小鼠生存期(n=4)。图25是野生型ES细胞移植后无论有无米非司酮均在脑内形成肿瘤，而移植分化和未分化caspase-1-ES细胞只有注射乙醇的小鼠脑内形成肿瘤。图沈是野生型ES细胞和caspase-1-ES细胞溶剂组均可形成肿瘤。图27是无论是否注射米非司酮，SRY+/TH7MAP2+细胞都能在移植了分化的 caspase-1-ES细胞小鼠脑内存活。图28是米非司酮诱导的caspase-Ι高表达对分化和未分化的caspase-1-ES细胞产生不同的影响。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1由米非司酮诱导的caspase-Ι表达清除了胚胎干细胞形成的肿瘤一、实验目的
Caspase-Ι属于炎症半胱天冬酶之一，激活后可导致炎症细胞死亡。在体内过表达也能导致肿瘤细胞死亡。Caspase-Ι激活后能诱导质膜形成细孔使水进入细胞，引起渗透性溶解；导致前炎症细胞内容物以及IL-I β和IL-18等caspase-Ι相关细胞因子的释放；还会激活某种未知的核苷酸内切酶剪切DNA。因此我们选择这个基因作为杀伤基因。通过在ES细胞中引入GeneSwitch技术平台，构建一个米非司酮调控的caspase-1 表达系统，并观察用米非司酮处理后在体外和体内情况下caspase-Ι高表达对未分化ES细胞和生成的肿瘤细胞的影响。二、材料与方法
1.主要的试剂与材料
BSA,5X 蛋白上样缓冲液、4XTris-HCL/SDS(pH6. 8)、4XTris_HCL/SDS(pH 8. 8)、潮霉素、DMSO, MTT (上海生工生物工程公司)，兔抗caspase-Ι抗体(德国Santa Cruz公司)，ExTaq DNA聚合酶、医用X光胶片(日本TAKARA公司)，鼠抗β-actin抗体(美国Sigma公司)， 脂质体2000转染试剂盒、Superscript III cDNA反转录试剂盒、Trizol RNA抽提剂、青霉素/链霉素、热灭活无内毒素的胎牛血清(FBS)、米非司酮、GeneSwitch试剂盒、0.05%胰酶、GMEM、L-Glutamine、丙酮酸钠、非必需氨基酸、Knockout Serum Replacement^-巯基乙醇(细胞培养用)、ES细胞专用FBS (美国hvitrogen公司)，细胞凋亡检测试剂盒(江苏海门碧云天公司)，DAB试剂盒(美国Vector公司)，SuperSignal West detection试剂盒(美国PIERCE公司)，RIPA裂解液(上海博彩公司)，Immobilon PVDF膜(美国Millipore公司)， 细胞培养板(Corning)(上海博蕴公司)，裸鼠(中国科学院上海实验动物中心)，细胞培养箱 (德国HERA公司)，酶标仪(美国Phenix Research公司)，倒置荧光显微镜(IX 81)(日本 Olympus公司)，PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像仪、Western垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)， Zeocin (上海普飞公司)，Matrigel (美国BD公司)。细胞培养
小鼠ES细胞CGR8的培养和稳定转染细胞株的筛选
小鼠ES细胞(19-30代)，培养液成分为GMEM，含10%ES细胞专用FBS，1%丙酮酸钠，1% 非必需氨基酸，1%青霉素链霉素，1%谷氨酰胺和1%。2-巯基乙醇，以新鲜加入的1/10000的 LIF (107U/ml)保持CGR8的未分化状态。细胞培养皿以0. 2%明胶包被30分钟，细胞传代用0. 05%胰酶消化3分钟。稳定转染细胞株的筛选步骤为将CGR8接种于明胶包被的3. 5cm培养皿中，细胞生长至30%面积的时候，将所需质粒以Lipofectamine 2000转染入细胞，培养48小时后加入相应的抗生素进行筛选。pSwitch质粒稳转株用hygromycin (750 μ g/ml)，pGene质粒稳转株用kosin (80 μ g/ml)筛选两周后将细胞消化至单细胞，将100-500个细胞接种入IOcm培养皿中，待单个细胞培养一周后挑单克隆并进行扩增，最后以RT-PCR和western blot的方法进行鉴定。质粒构建
用Trizol抽提小鼠脾脏总RNA，紫外分光仪检测RNA浓度，然后将Img RNA反转录成 cDNA,以此 cDNA 作为模版；引物序列正义链5，-CGAGGTACCATGGCTGACAAGATCCTGA-3，( SEQ ID N0. 1)，反义链5，-CAGGCCGCTTAATGTCCCGGGAAGAG-3，(SEQ ID NO. 2)。进行 PCR 反应扩增caspase-Ι的全长cDNA，程序为变性94°C 30秒，退火56°C 30秒，延长72°C 2分钟，35 个循环，最后延长10分钟。将PCR产物克隆入pUcm-T vector中，通过测序分析对构建的 caspase-lcDNA (SEQ ID NO. 3)与数据库序列(NM_001043585)进行比较。以 Kpn I 和 Not I两个酶切位点分别对caspase-1 cDNA和pGene载体进行双酶切，酶切产物以Solution I 连接后转化入大肠杆菌，测序鉴定正确后进行后续的转染等实验。分析
用MTT法对细胞活力进行分析。细胞接种于96孔板1天后加药。米非司酮溶于乙醇， 储存液浓度为10μΜ。使用时加入培养液，终浓度为ΙΟηΜ，对照组加入同体积乙醇，隔天换液。2-6天后弃去培养液，每孔加入0. 5mg/ml的MTT PBS溶液100 μ 1，37°C孵育3小时，弃去上清，加入DMSO溶解沉淀。用酶标仪读取570nM吸光率。米非司酮组的数据分别除以对照组的数据得到细胞存活的百分比。的提取
6细胞经处理1天后弃去培养液，PBS洗1次，6孔细胞培养板每孔加入200 μ 1 TRIzol 试剂，置室温5分钟，吸取裂解液入1. 5ml离心管，每管加氯仿200 μ 1，摇振，室温放置2_3 分钟。4°C离心，12000gX 5分钟，小心吸取上层水相，移至另一离心管。加入异丙醇500 μ 1， 室温静置10分钟。4°C离心，12000gX10分钟，弃去异丙醇；加入75%乙醇1ml，摇振，洗涤沉淀，4°C离心，IOOOOgX5分钟，弃去乙醇，晾干。每管加入适量去RNase的水，取1 μ 用分光光度计测0拟60Λ80比值，计算RNA纯度和浓度，用于反转录。反转录
取上述提取的RNA各1 μ g，行两步法进行逆转录，加入Oligo dT 1μ 1，再加入无RNase 水至终体积为13. 5 μ 1，650C反应5分钟；之后分别加入5 X RT缓冲液4 μ 1，dNTP 0. 5 μ 1， RNasin 1 μ 1，M-MLV逆转录酶1 μ 1，37°C反应60分钟，cDNA于_80°C冰箱保存。做PCR时取逆转录产物1 μ 1作为模板。引物序列正义链5，-CGAGGTACCATGGCTGACAAGATCCTGA-3， (SEQ ID NO. 1)，反义链5’ -CAGGCCGCTTAATGTCCCGGGAAGAG-3，(SEQ ID NO. 2)。检测基因表达
反应体系为20 μ 1，参照TAKARA公司的Ex Taq说明书进行，引物序列同前，PCR条件同前，25个循环。移植
体重18-22g雌性裸鼠20只，分为4组，每组5只。用0. 05%胰酶将ES细胞消化下来，吹达成单个细胞，用70 μ m滤网过滤。用PBS洗涤离心两次，计数。将IX IO6个ES细胞悬浮在ΙΟΟμΙ matrigel，注射到裸鼠右肋皮下。注射1 2周后肿瘤出现，为了估算米非司酮对体内肿瘤消除的作用，隔天用游标卡尺测量皮下肿瘤的长和宽，体积公式为体积 =1/2X长X宽2。当肿瘤体积达到200mm3时，每天皮下注射lmg/kg体重的米非司酮或等体积的乙醇。注射药物3周后引颈处死小鼠，肿瘤组织剪碎后用ES培养液培养2周，观察有无细胞系形成。免疫印迹分析 7.1蛋白样品的准备
ES细胞经药物处理后，PBS洗1次，加入冰RIPA(1%PMSF)裂解液裂解。使用细胞刮刮下细胞并收集到离心管，移液器吹打30次/ml，冰上静置30分钟。4°C，20000gX30分钟离心，收集上清，-80°C保存。药物注射2天后，小鼠引颈处死，取少量皮下肿瘤组织，称取重量，按15 μ 1/ μ g力口入RIPA裂解液，用超声破碎仪破碎。4°C，20000gX30分钟离心，收集上清，-80°C保存。电泳、转膜及封闭
配置1 分离胶和5%浓缩胶，配置跑胶缓冲液，配制方法见7. 3。取蛋白样品与上样缓冲液混和，100°C水浴煮沸5分钟，离心，上样。先80V电泳20分钟，再120V下电泳 1小时左右(以溴酚蓝条带电泳至分离胶近底边即可)。准备PVDF膜，用甲醇浸泡1分钟使膜活化，后与SDS-PAGE电泳胶一起浸泡在转膜缓冲液中10分钟使其平衡。制作转膜“三明治”，顺序依次为负极面(黑色面)-纤维垫-3层滤纸-分离胶-PVDF膜-3层滤纸-纤维垫-正极面(红色面)。250mA转膜，转膜45分钟。结束后取出膜，做标记，丽春红染色1分钟观察蛋白转膜情况。洗膜缓冲液洗后，配置5%脱脂奶粉或5%BSA，室温封闭PVDF膜1小时。
抗体孵育
封闭后，用5%脱脂奶粉(鼠抗β -actin抗体，1 :4000)或5%BSA(兔抗caspase-1抗体， 1 :500)封闭液配置一抗孵育液，加于膜上，4°C孵育过夜。洗膜缓冲液漂洗3X15分钟，用辣根过氧化酶二抗室温孵育2小时(山羊抗兔IgG，或山羊抗小鼠IgG，1:2000)。洗膜缓冲液漂洗3X 15分钟，挂角晾干，加入SuperSignal ECL荧光显示剂，暗室曝光，曝光时间视荧光强度而定。显影、定影后冲片晾干。图形用扫描仪(BIORAD GS-800)读取，以Quantity one软件分析荧光强度。部分液体的配制
跑胶缓冲液25mmol/l Tris-base, 0. 2mol/l 甘氨酸，0. 1%SDS ； 转膜缓冲液:25mmol/l Tris-base, 0. 2mol/l 甘氨酸，20% 甲醇； 洗膜缓冲液0. 242% Tris base, 0. 8% NaCl ；用 IN HCl 调 pH 为 7. 6，用前加 0. 的 Tween-20 ；
封闭液5%脱脂奶粉或5%BSA，用洗膜缓冲液配制。剪切检测
用PBS洗涤4%PFA固定的细胞爬片或冰冻切片，用0. l%Triton-100 PBS溶液冰浴 2分钟，PBS洗涤，用0. 3%过氧化氢甲醇溶液室温孵育20分钟，PBS洗涤。加生物素标记液，37 °C孵育60分钟，PBS洗涤，加标记反应终止液，室温孵育10分钟，PBS洗涤。加 Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30分钟，PBS洗涤。加DAB显色液显色5分钟，PBS洗涤。苏木素复染10秒，流水冲洗，脱水，树脂封片。染色
肿瘤组织用PFA固定后石蜡包埋，切片厚度5 μ m。脱蜡后苏木素孵育5分钟，流水冲洗返蓝，伊红孵育1分钟，水洗，脱水，树脂封片。肿瘤细胞培养
药物注射3周后，移植caspase-1-ES细胞的小鼠引颈处死。取少量皮下肿瘤组织，加入ES细胞培养液培养1周。统计
其他数据采用方差分析和双尾t检验，以P<0. 05为显著差异。所有数据以均数士标准方差表示(Means 士 SD)。三、实验结果
1.基于胚胎干细胞的GeneSwitch平台
GeneSwitch平台的调节原理如图1所示，其建立基于两次稳定转染细胞株的筛选， 第一次筛选将调节载体pSwitch瞬时转染入小鼠ES细胞CGR8中，在用抗生素潮霉素以 80 μ g/ml的浓度筛选两周后，挑取单克隆进行鉴定。我们通过将pGene-GFP载体瞬时转染入pSwitch-ES稳定转染细胞株中，利用诱导剂米非司酮处理1天后，在荧光显微镜下观察其对GFP蛋白诱导的强度。从图2中可以看出，随着加入的米非司酮的浓度增加，细胞内 GFP的诱导表达明显增加。根据本实验室和其他实验室的试验结果，米非司酮对ES细胞的分化不产生影响。在米非司酮诱导下caspase-Ι高表达的稳定转染细胞株caspase-l-ES的建立利用建立的GeneSwtich可诱导表达平台，我们将pGene-caspase-Ι质粒稳定转染到pSwitch-ES稳定转染细胞株中，用zeosin进行第二次稳定转染的筛选。我们运用western 免疫印迹分析和RT-PCR的方法检测caspase-Ι的表达情况，对挑取的单克隆细胞进行鉴定，得到caspase-1-ES细胞系。所述的caspase-1-ES细胞系的保藏号为CCTCC C201193。 RT-PCR的结果显示，米非司酮诱导的caspase-Ι表达呈剂量依赖。当米非司酮终浓度高于 0. InM时，caspase-Ι基因的表达增加6_7倍，终浓度为0. OOlnM时，caspase-Ι基因的表达仅增加30%(图3)。caspase-1-ES细胞用乙醇或米非司酮处理1天后收集作为样本进行实验。RT-PCR结果显示米非司酮在极低浓度(0. 1 nM & 10 nM)诱导caspase-1 mRNA高表达 (ρ<0· 01)，更低浓度的米非司酮放大作用则变小了 (0. 001 ηΜ; ρ<0· 05)。*表示ρ<0. 05，** 表示ρ<0·01 (与米非司酮0 nM相比)。从图4中可以看出，western免疫印迹分析的结果显示米非司酮可以显著诱导 caspase-1 plO的高表达，而野生型ES细胞不受影响。无论是否加入米非司酮，野生型 (CGR8)ES细胞均未检测到caspase-1 plO (n=3)。caspase-1前体经过蛋白水解后生成有功能的caspase-Ι亚基p20和plO。所以我们用Western blot检测caspase-1 plO的水平来代表在野生型和caspase-1-ES细胞内caspase-1激活的水平。用乙醇或米非司酮(10 nM)处理ES细胞1天后收集细胞进行检测。在野生型ES细胞内无论有无米非司酮均未检测到caspase-Ι。没有米非司酮时caspase-1-ES细胞内可检测到少量的caspase-Ι本底表达，而米非司酮处理可使caspase-1 plO表达显著增加(p<0. 01 )。#表示p<0. 01. WTjf 生型。米非司酮诱导的caspase-Ι高表达导致caspase-1-ES细胞死亡
为了观察米非司酮对caspase-1-ES细胞活力的影响，我们做了 MTT分析。对米非司酮诱导caspase-1-ES细胞死亡的数量是呈剂量依赖和时间依赖的。米非司酮对野生型ES细胞没有影响。加入米非司酮(10 nM)2天后，caspase-1-ES细胞数量显著下降。随着时间推移，细胞数量迅速下降，6天后全部死亡。虽然6天后撤去了米非司酮，继续培养2天后也未观察到存活的细胞。(图5和6)。然而，没有米非司酮时caspase-1-ES细胞增殖速度比野生型慢。#表示p<0.01 (与野生型溶剂组比较)，##表示ρ<0.01 (与caspase-1-ES溶剂组比较)。用0.1 nM和10 nM米非司酮处理2天后，caspase-1-ES细胞数量明显减少， 而0.001 nM米非司酮的效果小得多(图7)，**表示p<0. 01，***表示p<0. 001 (与米非司酮OnM相比)。由此可见，米非司酮诱导的caspase-Ι高表达导致caspase-1-ES细胞死亡。 因此，我们选用10 nM终浓度米非司酮。激活的caspase-Ι通过剪切DNA诱导caspase-1-ES细胞死亡
为了了解米非司酮导致caspase-1-ES细胞死亡的机制，我们做了 TUNEL染色。用米非司酮处理1天后的caspase-1-ES细胞出现了 DNA剪切的现象(图8)。加上之前的实验结果证明米非司酮导致caspase-1-ES细胞死亡的机制是米非司酮诱导caspase-Ι高表达，引发 DNA的损伤。注射米非司酮组3周内肿瘤体积不断缩小
为了测试米非司酮在体内是否同样能引起caspase-1-ES肿瘤细胞死亡，1 X 106未分化的野生型或caspase-1-ES细胞悬浮在matrigel中，注射到裸鼠右肋皮下。作为阴性对照，左肋皮下注射了 matrigel，未见肿瘤生成。隔天用游标卡尺测量肿瘤大小。当肿瘤体积达到约200cm3时每天皮下注射米非司酮。(1 mg/kg)或乙醇。每天一次注射3周直到小鼠被处死(n=5)。不注射米非司酮移植了 caspase-1-ES细胞的小鼠生成了大个的皮下肿瘤。而注射米非司酮3周后肿瘤体积明显缩小。3周后米非司酮组肿瘤体积明显小于对照组(图9)。根据对肿瘤大小的连续观察，米非司酮注射后8天caspase-1-ES肿瘤体积显著缩小，而注射乙醇的小鼠体内caspase-1-ES细胞形成的肿瘤仍然继续生长(p<0. 01)。 随着时间的推移米非司酮组和溶剂组肿瘤体积差距越来越大，3周后缩小至治疗开始时的一半(图10)。野生型ES细胞形成的肿瘤不受米非司酮影响，而它的生长速度显著快于 caspase-1-ES细胞形成的肿瘤。无论是否注射米非司酮2周后肿瘤体积能增长5倍。** 表示p<0. 01 (与野生型溶剂组相比)。#表示p<0. 05，##表示p<0. 01 (与caspase-1-ES溶剂组相比)。细胞在体内形成畸胎瘤
移植caspase-1-ES细胞的对照组小鼠注射3周后被处死，肿瘤组织固定后做成石蜡切片。HE染色显示肿瘤组织内包含三胚层来源的组织结构。角化珠属于外胚层。脂肪组织属于中胚层。纤毛上皮属于内胚层。证实caspase-1-ES细胞能形成畸胎瘤(图11)。这证明转入GeneSwitch系统和caspase-1基因对该ES细胞的全能性没有影响，为下一步分化研究打下了基础。在米非司酮诱导下，caspase-1-ES细胞形成的肿瘤细胞死亡
移植caspase-1-ES细胞的小鼠注射米非司酮或乙醇3周后被处死。HE染色显示经米非司酮处理3周后，注射乙醇3周后多能干细胞形成的肿瘤持续生长。caspase-1-ES肿瘤组织内组织结构已消失，取而代之的是纤维组织。而溶剂组仍可见干细胞形成的畸胎瘤结构(图12)。在米非司酮诱导下，caspase-Ι在caspase-l-ES细胞形成的肿瘤里高表达注射米非司酮2天后取出肿瘤组织，用western免疫印迹分析casapase-1 plO的表达
量。如图13所示，在米非司酮诱导下，caspase-Ι在caspase-1-ES细胞形成的肿瘤里表达增加至8倍。结合各组肿瘤体积的变化，可以证实米非司酮组caspase-1-ES肿瘤体积较小是由于caspase-Ι的高表达。野生型ES细胞形成的肿瘤内未检测到caspase-1 plO的表达。**表示p<0. 01 (与caspase-1-ES溶剂组相比)。激活的caspase-Ι通过剪切DNA诱导caspase-1-ES形成的肿瘤细胞死亡
为了了解米非司酮诱导caspase-Ι过表达导致肿瘤细胞死亡的机制，我们做了 TUNEL 染色。注射米非司酮2天后的caspase-1-ES肿瘤细胞出现了 DNA剪切的现象(图14)。考虑到之前的实验结果，这证明米非司酮在体内导致caspase-1-ES肿瘤细胞死亡的机制是米非司酮诱导caspase-Ι过表达，引发DNA的损伤。用米非司酮处理3周的caspase-1-ES肿瘤组织不能培养产生肿瘤细胞系
将米非司酮组和对照组的caspase-1-ES肿瘤组织剪碎，用ES细胞培养液培养。对照组很容易建立肿瘤细胞系，而米非司酮组不能建立细胞系(图15)。这说明米非司酮处理3 周后，肿瘤细胞的确已经全部死亡。Caspase-Ι是哺乳动物程序性细胞死亡相关基因，将它转入体内将激活某种未知的核苷酸内切酶剪切DNA，从而导致肿瘤细胞死亡。我们将caspase-Ι插入Geneswitch系统建立一个米非司酮调控的表达系统，从而建立在米非司酮诱导下高表达caspase-Ι的ES 细胞。体外实验显示，加入米非司酮后caspase-Ι高表达，同时发生DNA损伤，随后未分化的caspase-1-ES细胞大量死亡。体内实验亦显示，注射米非司酮后，caspase-Ι高表达，同时发生DNA损伤，随后caspase-1-ES细胞形成的肿瘤细胞死亡。由此可见，本发明已经达到第一个目标当移植的ES细胞形成肿瘤时可被清除。实施例2由米非司酮诱导的caspase-Ι表达清除了脑内胚胎干细胞形成的肿瘤而不清除移植的多巴胺能神经元
一、实验目的
研究利用受米非司酮调控的caspase-1-ES细胞系在消除ES细胞形成的肿瘤细胞同时保留ES细胞分化形成的多巴胺能神经元。二、材料与方法
1.主要的试剂与材料
兔抗Oct-4抗体(美国Cell Signaling公司)，兔抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体、鼠抗 nestin抗体(美国Chemicon公司)，鼠抗SRY抗体(英国Abcam公司)，鼠抗MAP2抗体、鼠抗微管相关蛋白2 (MAP 2)抗体(美国Sigma公司)，山羊抗MAP2抗体(德国Santa Cruz公司)，Prolong gold ant i fade reagent、Alpha-MEM 培养液、Alexa Fluor 350 驴抗山羊抗体(美国hvitrogen公司)，激光共聚焦显微镜(LCM510)(德国Zeiss公司)，PA6细胞系(日本Riken细胞库)，立体定位仪(美国Benchmark公司)，Cy2标记山羊抗兔抗体、Cy3标记山羊抗小鼠抗体(美国Jackson ImmunoResearch公司)。细胞培养
2.1骨髓基质细胞PA6细胞培养
液氮中取出PA6细胞冻存管，置于37°C水浴中快速复温，转入含等体积完全培养液的离心管(alpha-MEM，10% FBS,青霉素/链霉素50U/ml )，1200rpm离心5分钟，去除上清，沉淀重悬于完全培养液，移液器吹散，以hl04/Cm2接种于直径IOcm细胞培养皿。置于5%C02， 37°C恒温细胞培养箱内培养3-5天，期间换液一次，待细胞贴壁长致80-90%面积时用PBS 洗两次，换分化培养液，一天后即为PA6条件培养液。分化培养液成分为GMEM，含10%血清替代品(Knockout Serum Replacement, KSR)，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%青霉素链霉素，1%谷氨酰胺和1%。2-巯基乙醇。细胞消化传代时先以PBS洗两次，再以0. 05%胰酶消化5分钟进行传代。细胞的培养和分化
ES细胞培养同第一部分，略。ES细胞向多巴胺能神经元分化的步骤如下将ES细胞以3X105/ml的浓度接种于6 cm细菌培养皿中悬浮培养4天形成类胚体(Embryoid Body, EB),期间于第二天更换培养液，培养液成分不含LIF。将EB吸入15 ml离心管沉淀15分钟后，弃去上清并以PBS重悬EB，再沉淀15分钟，弃去上清，最后以PA6条件培养液重悬，接种于5%matrigel包被细胞培养皿。隔天换液。分析(参照实施例1) 4.移植
体重18-22g雌性裸鼠20只，分为4组，每组4只。用0. 05%胰酶将ES细胞或诱导分化4天的细胞消化下来，吹打成单个细胞，用70 μ m滤网过滤。用PBS洗涤离心两次，计数。 按1Χ105/μ1的浓度将细胞悬浮在培养液中，注射到裸鼠脑内。裸鼠用0.1ml 10%水合氯醛麻醉，固定在立体定位仪上。碘酒消毒，割开头部皮肤，用30%过氧化氢溶解骨膜暴露手
1术区域，在手术位置钻孔。注射位置以前囟为0点，向前1.0，向右2.0，向下3.0。现用微量进样器吸取细胞，记录初始坐标，以每分钟下降1. 0的速度进入大脑，到达指定位置后以每分钟1 μ 1的速度注射，注射完毕后留针2分钟，以同样速度退出大脑。用青霉素/链霉素双抗溶液处理伤口并缝合。注射2周后每天皮下注射lmg/kg体重的米非司酮或等体积的乙醇，记录小鼠死亡情况。注射药物10周后过量麻醉小鼠，用PBS和4%PFA进行全身灌注，取出大脑组织用PFA继续固定2天，用15%和30%蔗糖沉糖过夜，OCT包埋，冰冻切片， 厚度为10 μ m。免疫印迹分析
5.1蛋白样品的准备(参照实施例1)
5.2 SDS-PAGE电泳、转膜及封闭(参照实施例1) 5.3.抗体孵育(参照实施例1)
6.免疫荧光染色
接种在爬片上的细胞经4%PFA固定30分钟，PBS洗3 X 5分钟，用3%BSA封闭30分钟， 之后加一抗4 V孵育过夜。一抗包括兔抗Oct-4抗体(1 200 )，兔抗TH抗体(1 500 )，鼠抗 MAP2抗体(1 2000 )，鼠抗nest in抗体(1 500 )鼠抗SRY，抗体(1 200 )和山羊抗MAP2抗体 (1:20)。去一抗孵育液，PBS洗3X5分钟，加入Cy2标记山羊抗兔抗体(1:500)，Cy3标记山羊抗小鼠抗体(1:500)和Alexa Fluor 350驴抗山羊抗体(1 200)的二抗混和，室温下避光孵育2小时。去二抗孵育液，PBS洗3X5分钟，晾干，加抗荧光淬灭剂封片，用激光显微镜显像。剪切检测(参照实施例1) 8.统计
生存分析使用Kaplan - Meier法及卡方检验。其他数据采用方差分析和双尾t检验， 以P<0. 05为显著差异。所有数据以均数士标准方差表示(Means 士 SD)。三、实验结果
1. ES细胞向多巴胺能神经元分化的技术平台
ES细胞向多巴胺能神经元分化的主要方法有五步诱导法和基质细胞(PA6)共培养法两种，其中五步诱导法时间较长(需20天以上)，期间需要数种细胞因子的诱导，成本较高， 且效率较低(10%左右)。因此我们采用了诱导时间更短(14天左右)，效率更高(10-30%)， 且成本较低的细胞共培养的方法。通过将ES细胞形成EB，而后用PA6条件培养液培养EB， 隔天换液，可分化为MAP2+/TH+的多巴胺能神经元(图16)。caspase-1-ES细胞在petri培养皿中悬浮培养4天形成EB，然后EB在PA6条件培养液中贴壁分化。分化10天后出现了 MAP2+/TH+的细胞，即多巴胺能神经元。标尺长度50 μπι。用ΡΑ6条件培养液还能避免收集细胞时有ΡΑ6细胞混入，更加适合细胞移植。加入米非司酮对分化的caspase-1-ES细胞数量没有显著影响
EB用ΡΑ6条件培养液分化10天后加入米非司酮处理6天。图17显示米非司酮处理 6天后分化的野生型和caspase-1-ES细胞形态无显著变化。为了了解米非司酮对分化的 caspase-1-ES细胞数量的影响，我们做了 MTT分析。图18显示米非司酮处理2_6天对分化的野生型和caspase-1-ES细胞数量没有显著影响。显然米非司酮的诱导对未分化成熟和分化成熟的caspase-1-ES细胞效果不同。
用米非司酮处理的分化的caspase-1-ES细胞未出现DNA损伤
用PA6条件培养液分化10天后加入米非司酮，2天后进行TUNEL染色。图19显示用米非司酮处理的分化的caspase-1-ES细胞未出现DNA损伤，这进一步证实米非司酮的诱导对分化的caspase-1-ES细胞没有作用。标尺长度10 μ m。在米非司酮诱导下分化的caspase-1-ES细胞内caspase-Ι的表达显著增加为了了解米非司酮诱导一caspase-Ι高表达一DNA损伤一细胞死亡的过程中哪一步
中断了，我们用western免疫印迹分析了功能亚基caspase-1 plO的表达。图20显示在分化的caspase-1-ES细胞内caspase-1 plO的表达显著增加。而分化的野生型细胞未检出caspase-1 plO。*表示p<0. 05 (与caspase-1-ES溶剂组相比)。也就是说在分化的 caspase-1-ES细胞里，caspase-Ι的高表达没有导致DNA的剪切以及细胞死亡。米非司酮处理后caspase-1-ES细胞分化成的多巴胺能神经元仍然存活
用PA6条件培养液培养caspase-1-ES细胞10天后加入米非司酮，4天后进行染色。图 21显示有MAP2/TH阳性细胞(即多巴胺能神经元)存活(标尺长度50 μ m)，且MAP2+/TH+克隆比例不受米非司酮影响(图22，(标尺长度500 μ m))。从上所述，我们认为caspase-Ι过表达选择性地引起未分化aspase-1-ES细胞死亡，但对多巴胺能神经元和其他分化的细胞无效。移植细胞中有大量神经前体细胞
为了验证米非司酮在脑内能否清除caspase-1-ES细胞形成的肿瘤，同时分化产生的多巴胺能神经元也能存活，我们把未分化和诱导过的ES细胞移植到裸鼠纹状体。未分化的野生型和caspase-1-ES细胞均为0ct_4+。caspase-1-ES细胞用PA6条件培养液培养4天后产生大量nestin+细胞，即神经前体细胞。但其中也混有少量0ct-4+细胞，显示有形成肿瘤的可能性(图23)。为了检验caspase-1-ES细胞在体内能否分化为多巴胺能神经元并存活，我们移植了 1 X IO5个细胞到雌性裸鼠纹状体。EB形成后用PA6条件培养液培养4天产生用于移植的分化的caspase-1-ES细胞。用于移植的未分化的野生型和caspase-l-ES 细胞均为Oct-4+。分化的caspase-1-ES细胞多为nestin+，显示其为神经前体细胞。大多数分化的caspase-1-ES细胞为nestin+，一个细胞为0ct_4+。少量0ct_4+细胞显示有未分化的caspase-1-ES细胞混入移植细胞，可能会产生肿瘤。标尺长度10 μ m。细胞移植后米非司酮组均未出现肿瘤，对照组均出现肿瘤
将细胞移植到裸鼠脑内2周后开始皮下注射米非司酮，注射剂量同前。2周时间足够让神经前体细胞在脑内分化为多巴胺能神经元。表1显示经米非司酮处理后，无论诱导过的或未分化的caspase-1-ES细胞都不能形成肿瘤，而溶剂组则有肿瘤形成。野生型ES细胞无论有无米非司酮都会形成肿瘤。 表1接受细胞移植后小鼠脑内形成肿瘤
移植细胞种类治疗形成肿瘤比例(n=4)未分化野生型溶剂100%未分化野生型米非司酮100%未分化 Caspase-I-ES溶剂75%未分化 Caspase-I-ES米非司酮0%分化 Caspase-I-ES溶剂25%分化 Caspase-I-ES米非司酮0%
13分化和未分化的细胞被消化成单细胞悬浮在培养液中，并移植到小鼠右脑纹状体。移植2周后开始对小鼠注射药物。我们接着观察了小鼠8周。无论有无米非司酮，所有移植了野生型ES细胞的小鼠都产生了肿瘤。不注射米非司酮的小鼠中有25%移植分化的 caspase-1-ES细胞小鼠产生肿瘤，75%移植未分化的caspase-1-ES细胞小鼠产生肿瘤。 反之，在注射米非司酮的小鼠中均未产生肿瘤。注射米非司酮延长了移植未分化caspase-1-ES细胞小鼠生存期
注射米非司酮后移植未分化caspase-1-ES细胞小鼠均生存到70天被处死，而注射乙醇的小鼠有75%死于58-67天。图M显示米非司酮延长了移植未分化caspase-1-ES细胞小鼠生存期。我们观察了小鼠接受移植后存活的情况。无论有无米非司酮，移植未分化野生型ES细胞的小鼠均死于肿瘤。脑内产生肿瘤的小鼠均在67天内死去，其余小鼠均生存到 70天后被处死。米非司酮延长了移植未分化caspase-1-ES细胞小鼠生存期(x2=4.213， P<0. 05)。注射米非司酮后我们观察了小鼠8周，移植分化和未分化caspase-1-ES细胞的小鼠无一死亡。接受移植的小鼠死于脑内肿瘤
移植后67天内死亡小鼠解剖后肉眼可见脑内肿瘤，均占据右侧(即细胞移植侧)颅腔。 70天后处死小鼠解剖后肉眼均未见脑内肿瘤。野生型ES细胞移植后无论有无米非司酮均在脑内形成肿瘤，解剖可见肿瘤占据了右侧颅腔。而移植分化和未分化caspase-1-ES细胞只有注射乙醇的小鼠脑内形成肿瘤，米非司酮组均未形成肿瘤(图25)。死于脑内肿瘤的小鼠在死前约一周均显亢奋，不停跳跃，不思饮食。3-4日后出现运动障碍，不能饮食，消瘦。 数日后不能主动翻身，即判定死亡。结合解剖结果与症状判断，小鼠应死于脑内肿瘤。肿瘤组织均来源于移植细胞
HE染色证实裸鼠脑内肿瘤均来源于移植细胞，而活着的小鼠脑内均未发现肿瘤组织(图沈)。组织切片显示脑内肿瘤来源于野生型ES细胞，注射乙醇的分化和未分化 caspase-1-ES细胞。注射米非司酮的分化和未分化caspase-l-ES细胞未形成肿瘤。标尺长度50 μπι。综上所述，米非司酮在脑内也能预防caspase-1-ES干细胞形成的肿瘤。诱导的caspase-1-ES细胞在小鼠脑内分化为多巴胺能神经元，且不被米非司酮清除我们对移植了分化的caspase-1-ES细胞的小鼠进行了鉴定。SRY基因存在于Y染色体上，是性别决定基因，且在小鼠TH阳性神经元内表达。因此我们用SRY，TH和ΜΑΡ2抗体检测了这些小鼠的脑组织切片，观察移植细胞的存活和分化情况。图27显示无论是米非司酮组还是对照组，小鼠脑内均有SRY/TH/MAP2阳性的细胞。与体外实验的结果相同，分化的caspase-1-ES细胞移植到小鼠脑内会分化为多巴胺能神经元，且不被米非司酮清除。但 caspase-1-ES细胞形成的肿瘤不能存活。为了了解在体内米非司酮对雄性移植细胞分化和存活的影响，我们检测了 SRY，TH和ΜΑΡ2在雌性移植小鼠脑内的表达。Y染色体连锁雄性决定基因SRY在雄性啮齿类TH+神经元内表达。在高倍镜下观察三染的脑片，无论米非司酮组或溶剂组小鼠均可见一些SRY7TH+/MAP2+细胞。箭头表示SRY7TH+/MAP2+的caspase-1-ES 细胞。标尺长度10 μπι。四、结论
ES细胞分化为多巴胺能神经元的方法有许多种，目前常用的有五步诱导法以及基质细胞共培养法。这两种方法是目前国际上最常用的方法，本发明采用了基质细胞PA6共培养的方法，并对此方法进行了一定改进。本发明将ES细胞先形成EB，而后用PA6条件培养液培养。与其它研究者直接将ES细胞接种在PA6上相比较，本发明的方法一方面可以得到更多的移植细胞，另一方面使PA6细胞不可能混入移植细胞。肿瘤是ES细胞移植常见的风险，这是有移植细胞中混入的的幼稚细胞造成的。本发明的结果也显示，移植混入0ct-4+细胞的分化caspase-1-ES细胞有25%概率产生肿瘤。 本发明构建了一个在米非司酮诱导下高表达caspase-Ι的ES细胞系只在致瘤的状态下导致干细胞死亡。结果显示，在体外caspase-Ι高表达导致未分化的caspase-l-ES细胞死亡。 皮下和颅内的肿瘤也能被小剂量的米非司酮清除。然而，在体外caspase-Ι高表达对分化成熟的caspase-1-ES细胞没有明显影响。在脑内，米非司酮诱导caspase-Ι高表达也不会影响多巴胺能神经元的存活。由于分化成熟的细胞能存活，这种疗法不仅能用来清除已发现的肿瘤，还能用来预防潜在的肿瘤形成。在本发明中，我们发现在小鼠脑内caspase-Ι的激活不杀伤分化的多巴胺能神经元，但对未分化的caspase-1-ES细胞会引起DNA损伤和细胞死亡(图28)。本发明通过在ES细胞中引入GeneSwitch技术平台，构建一个米非司酮调控的 caspase-Ι表达系统，建立了 caspase-l-ES细胞系。移植该细胞后在米非司酮的诱导下， caspase-1-ES细胞分化的多巴胺能神经元能存活同时形成的肿瘤细胞死亡。本发明首次将caspase-Ι转入ES细胞，且不影响该细胞分化潜能。首次在ES 细胞内高表达caspase-1，证实caspase-1激活后通过引发DNA损伤导致体外未分化的 caspase-1-ES细胞死亡。在皮下和脑内，caspase-Ι激活后也导致caspase-1-ES细胞形成的肿瘤细胞死亡。这种方法有助于降低ES细胞移植成瘤的风险。本发明首次发现在分化的ES细胞内高表达caspase-Ι对细胞无显著影响。在体外，caspase-Ι高表达对分化的caspase-1-ES细胞数量无显著影响，对多巴胺能神经元的比例亦无显著影响。在脑内，caspase-Ι高表达在清除形成的肿瘤细胞时并未清除移植细胞分化的多巴胺能神经元。这有助于维持ES治疗的疗效。综上所述，本发明建立的caspase-1-ES细胞系既提高了胚胎干细胞移植的安全性又保留了治疗帕金森病的效果。此外，本方法也可用于降低ES细胞治疗其他特定细胞缺乏疾病时形成畸胎瘤的风险。所述的caspase-1-ES细胞系可以在干细胞移植中广泛应用。用于治疗神经系统疾病如脑瘫、脊髓损伤、运动神经元病、帕金森病、脑出血、脑梗塞后遗症、脑外伤后遗症等；用于治疗免疫系统疾病如糖尿病、皮肌炎、肌无力、血管病变、硬化病、白血病等；用于治疗其他疾病如肝病、肝硬化、股骨头坏死等。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种米非司酮诱导的caspase-1-ES细胞系，其特征在于，所述的caspase-1-ES细胞系的保藏号为CCTCC C201193。
2.一种米非司酮诱导的caspase-1-ES细胞系的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤a、pSwitch质粒线性化后用Lipofectamine2000转染入CGR8细胞，用Hygromycin筛选出pSwitch稳转株；b、PCR反应扩增caspase-Ι的全长cDNA；C、对caspase-1 cDNA和pGene载体进行双酶切，酶切产物以Solution I连接后转化入大肠杆菌；d、从大肠杆菌中抽提质粒，线性化后用Lipofectamine2000转染入pSwitch稳转株， 用kosin筛选稳转株；e、挑单克隆进行扩增，用RT-PCR和westernblot鉴定。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤b中caspase-Ι的全长 cDNA序列如SEQ ID N0. 3所述。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤b中PCR反应扩增 caspase-Ι的全长cDNA所用的引物序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所述。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的ES细胞为小鼠ES细胞。
6.根据权利要求1所述的caspase-1-ES细胞系在制备治疗帕金森病药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的caspase-1-ES细胞系在干细胞移植中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的caspase-1-ES细胞系在干细胞移植中的应用是指caspase-1-ES细胞系在制备治疗可以采用干细胞移植来治疗的疾病药物中的应用，所述的可以采用干细胞移植来治疗的疾病是指脑瘫、脊髓损伤、运动神经元病、 脑出血、脑梗塞后遗症、脑外伤后遗症、糖尿病、皮肌炎、肌无力、血管病变、硬化病、白血病、 肝病、肝硬化、股骨头坏死。
全文摘要
本发明涉及一种米非司酮诱导的caspase-1-ES细胞系，所述的caspase-1-ES细胞系的保藏号为CCTCCC201193。本发明还提供这种细胞系的制备方法和应用。本发明优点在于首次将caspase-1转入ES细胞，且不影响该细胞分化潜能。首次在ES细胞内高表达caspase-1，证实caspase-1激活后通过引发DNA损伤导致体外未分化的caspase-1-ES细胞死亡，降低ES细胞移植成瘤的风险；首次发现在分化的ES细胞内高表达caspase-1对细胞无显著影响，有助于维持ES细胞治疗的疗效；既提高了胚胎干细胞移植的安全性又保留治疗帕金森病和其他神经疾病的效果，可以在干细胞移植中广泛应用。
文档编号A61P25/16GK102424818SQ20111037334
公开日2012年4月25日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者乐卫东, 杨德华, 王颐 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院