专利名称：H22肝癌细胞自噬小体在制备肝癌治疗性疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于肝癌疫苗研制技术领域，具体涉及H22肝癌细胞自噬小体在制备肝癌治疗性疫苗中的应用。
背景技术：
肝癌(HCC)是恶性程度极高、且预后极差的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。 治愈性切除手术或肝移植是目前肝癌病人首选的治疗方法，但由于肝癌的肝内多发病灶、 肝外转移及供体缺乏等因素，新诊断出的肝癌病人只有10% 15%可采取手术治疗。临床资料显示，大部分肝癌病人对化疗、放疗等治疗不敏感，因此，肝癌的临床治疗迫切需要新的方法和手段。肿瘤生物治疗作为一种新的肝癌治疗策略，具有特异性强、毒副作用小等优点，越来越受到人们重视。其中，以树突状细胞(DC)为载体的肝癌疫苗目前已成为肝癌生物治疗的研究热点。在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是DC在数量和功能的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展。目前，基于 DC的肿瘤疫苗被认为是最有效的肿瘤疫苗之一，已开展大量基础研究和临床试验。DC疫苗功能的实现主要取决于两部分因素，一是DC的有效抗原提呈作用；二是负载有效的抗原， 抗原信息得以充分表达。然而，研究试验中存在许多问题有待解决，包括DC来源、制备过程、DC的抗原负载、用量、使用频度、免疫途径和次数，以及如何更好的募集肿瘤抗原等成为目前关注的热点。pAPC交叉递呈的抗原多肽是诱导特异性效应细胞的物质基础、而肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽是效应细胞有效识别并杀伤肿瘤细胞的靶点。一方面，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的短寿蛋白(平均半衰期约为10分钟)；另一方面，PAPC交叉递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的长寿蛋白(经自噬途径降解)，两者间可能存在着不对称现象，因此，解决上述的不对称性是肿瘤免疫需要解决的课题。如何充分利用肿瘤细胞产生的全部抗原信息，诱导能更有效识别肿瘤细胞的特异性效应细胞是目前以“长寿蛋白”为基础的肿瘤疫苗所面临的难题。自噬(autophagy)是普遍存在的细胞生物学现象，是指胞浆组分及细胞器被包裹形成自噬小体(autophagosome)，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，最终实现胞内物质降解的过程。大量研究结果显示采用自噬抑制剂(3-AM、wortmarmin)、siRNA技术下调自噬相关基因(AtgU)等方法抑制肿瘤细胞的自噬，则明显降低DC交叉提呈肿瘤抗原的免疫效果；反之，采用自噬诱导剂(rapamyCin、NH4CL)、饥饿等方法诱导肿瘤细胞产生细胞自噬，则明显增强DC交叉提呈的免疫效果。
发明内容
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本发明所要解决的技术问题，是提供H22/BNL两种肝癌细胞自噬小体在制备肝癌治疗性疫苗中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下H22/BNL肝癌细胞自噬小体DRibbles在制备肝癌治疗性疫苗中的应用。其中，所述的H22/BNL肝癌细胞自噬小体DRibbles按如下步骤制备得到(1)H22/BNL肝癌细胞的培养复苏冻存H22/BNL细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (V/V)胎牛血清、100U/ ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，重悬细胞至1 X IO6个/ml，并将其移入500ml细胞培养瓶中，在37°C、5% (V/V) CO2的恒温培养箱中培养，每1 2天换液一次，常规0. 25% (g/mL)胰蛋白酶消化传代；Q)H22/BNL肝癌细胞的处理待步骤(1)培养后的细胞贴壁良好，密度适中后(所述的密度适中是以细胞单层均勻铺满培养板底部约80-90%的面积确定)，加入雷帕霉素(Rapamycin)、万珂(Velcade) 和氯化铵(NH4CL)，雷帕霉素、万珂和氯化铵的加入量分别为1 OOnmo 1 /L、200nmo 1 /L和 30mmol/L,干预H22肝癌细胞16小时，诱导自噬小体DRibbles ；(3)提取 DRibbles 将步骤(2)诱导后的细胞经离心得到沉淀，即为自噬小体一DRilAles。其中，步骤(3)中，提取DRibbles具体包含如下步骤(3a)将细胞及培养液倒入50ml离心管中，低速离心1200rpm，IOmin ；(3b)将步骤(3a)离心后的上清倒入圆底超速50ml离心管，高速离心12000rpm， 30min,4°C ；(3c)将步骤(3a)离心后的沉淀的细胞用PBS重悬，低速离心1200rpm，IOminJf 低速离心后的上清再次倒入另一圆底超速50ml离心管中，高速离心12000rpm，30min，4°C;(3d)将步骤(3b)和(3c)两次高速离心后得到的沉淀用PBS重悬，合并，12000rpm 高速离心30min，4°C ；(3e)弃步骤(3d)得到的上清，沉淀即为自噬小体DRibbles，将沉淀用Iml PBS重悬后分装，冻存于_20°C，备用。有益效果本发明与现有技术相比具有如下优势1.快速获取大量自噬小体(DRitDbles)。本技术采用3种药物联合应用处理H22/ BNL两种肝癌细胞，诱导自噬小体的大量产生，然后以分步高速离心的方法从细胞培养上清中提取到H22/BNL肝癌细胞的DRilAles。2.本技术还涉及了自噬小体的鉴定，对其相关生物学活性进行检测。通过电子显微镜方法，可以观察到典型的双层膜结构，直径在IOOnm IOOOnm之间，符合自噬小体的特征，提示有效地募集了自噬小体。3.本技术利用尾静脉联合输注Flt3L和GM-CSF表达质粒可以有效诱导小鼠树突状细胞的扩增，其亚型更为丰富并具有很强的抗原递呈能力。4. DRibbles作为一种新型交叉提呈的抗原载体，免疫小鼠，能够在体内抑制小鼠肿瘤的生长。
图1为电镜观察DRibbles形态(X 80000)。图2药物处理后DRibbles中LC3含量的变化。图3不同抗原刺激Dribble (H22)预免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-的水平。图4DRit3bleS再刺激DRibbles (H22)预免疫小鼠以及PBS免疫小鼠淋巴细胞分泌 IFN-的水平。图5小鼠H22细胞皮下移植瘤模型的建立。其中，1. H22细胞接种3天后；2. H22 细胞接种10天后。图6DRit3ble (H22)疫苗免疫小鼠后H22皮下肿瘤生长情况。图7抗原刺激Dribble (BNL)预免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平。其中， Α、抗原刺激淋巴结细胞分泌IFN- γ的水平；B、抗原刺激⑶8+Τ细胞组分泌IFN- γ的水平； C、抗原刺激⑶4+Τ细胞组分泌IFN-γ的水平；D、抗原刺激⑶4+Τ细胞组分泌IL-4的水平。图8不同剂量BNL细胞皮下注射第15天后的小鼠皮下瘤生长情况。图9DRit3bleS (BNL)疫苗免疫小鼠后BNL皮下肿瘤生长情况。图IODribbles (BNL)疫苗免疫组和PBS组小鼠肿瘤组织的病理切片。其中，A =PBS 组小鼠肿瘤组织(100X)，肿瘤细胞为多边形和卵圆形，大小，形态不一，核大，深染，核仁明显，核分裂相易见，周围可见疏松结缔组织，未见明显炎细胞浸润，可见大量血管血供丰富； B :DC/DRibbles疫苗免疫组肿瘤组织(100X)，肿瘤细胞形态及排列同上，周围可见疏松结缔组织包绕，结缔组织内可见少量炎细胞；C :DC/DRibbles疫苗免疫组肿瘤组织Q00X)， 炎细胞类型有中性粒细胞，单核巨噬细胞和淋巴细胞。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 :H22/BNL肝癌细胞自噬小体DRibbles的制备。1、H22/BNL肝癌细胞的培养取冻存在液氮中的H22/BNL细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (V/V)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养液，重悬细胞至1 X IO6个/ml，并将其移入500ml细胞培养瓶中，在37°C、5% (V/V) CO2的恒温培养箱中培养，每1 2天换液一次， 常规0. 25%胰蛋白酶消化传代；2、H22/BNL肝癌细胞的处理待步骤(1)培养后的细胞贴壁良好，密度适中后，加入雷帕霉素 (Rapamycin) 100nmol/L、万珂(Velcade) 200nmol/L、氯化铵(NH4CL) 30mmol/L 组合处理 16 小时，诱导自噬小体一DRilAles。并设置对照组(只加入培养基)。3、提取 DRibbles 诱导后的细胞经离心得到沉淀，即为自噬小体DRilAles。具体包含如下步骤(a)将细胞及培养液倒入50ml离心管中，低速离心1200rpm，IOmin ；(b)将步骤(3a)离心后的上清倒入圆底超速50ml离心管，高速离心12000rpm，30min,4°C ；(c)将步骤(3a)离心后的沉淀的细胞用PBS重悬，低速离心1200rpm，lOmin，将低速离心后的上清再次倒入另一圆底超速50ml离心管中，高速离心12000rpm，30min，4°C ；(d)将步骤(3b)和(3c)两次高速离心后得到的沉淀用PBS重悬，合并，12000rpm 高速离心30min，4°C ；(e)弃步骤(3d)得到的上清，沉淀即为自噬小体DRibbles，将沉淀用Iml PBS重悬后分装，冻存于-20°C，备用。(f)将低速离心时得到的细胞沉淀用PBS重悬分装，反复冻融后得到细胞裂解物， 使细胞彻底裂解，将产物冻存于_20°C，备用。实施例2 透射电子显微镜鉴定DRibbles的形态。将提取好的DRibbles高速离心使其压缩紧密，弃上清，沉淀用2. 5% (V/V)戊二醛固定，送电镜室进行处理，上镜观察DRibbles的形态。如图1所示电镜下可见含膜结构的小体，平均直径约为200-300nm(箭头所指)，证实有效募集了 H22肝癌细胞的自噬小体。实施例3 =DRibbles总蛋白含量测定(Bradford法)。1)完全溶解蛋白标准品，取25 μ 1用PBS稀释至100 μ 1 ；2)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μ 1分别加到96孔板中，加PBS补足到 20μ 1 ；3)提前将待测DRibble反复冻融，离心取上清，加适量体积样本到96孔板中，加 PBS补足到20 μ 1 ；4)各孔加入200 μ LG250染色液，室温放置3_5分钟；5)用酶标仪测定Α595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度；6)用软件ElisaCalc绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度，结果大约为左右。实施例4 =Western blot检测细胞裂解物和DRibble中标记蛋白一LC3的表达LC3-I为胞浆型蛋白，参与了自噬小体的形成并以LC3-II的形式锚定于自噬小体的双层膜上，因而，LC3-II已被公认为自噬小体的特征性标记物。1)制备分离胶和浓缩胶配方如下A分离胶(15%)制备
ddH200.8ml
30% Arc1.75ml
1.5M Tris-Hcl (pH 8.8)0.9ml
10%SDS35 μ
10%APS35 μ
TEMED1.5 μ
总体积3.5 ml。B浓缩胶(5% )的制备
6ddH201.05ml
30% Arc0.25ml
1.0M Tris-Hcl(pH6.8)0.19ml
10%SDS15 nl
10%APS15 nl
TEMED1.5 \il
总体积1.5 ml。2) SDS-PAGE 电泳待浓缩胶凝固后，用去离子水冲洗梳孔。根据蛋白定量结果调整上样量，细胞裂解物每孔约12 μ 1，加入5X SDS样品加样缓冲液3 μ 1混勻，100°C煮沸5min, 12000rpm离心 5min后弃沉渣取上清准备上样。加入蛋白分子量标准，在上、下槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，开始电泳，恒压80V，待样本进入分离胶后，加大电压至120V，待溴酚蓝移动至胶板底部时终止电泳。3)转膜转膜开始前约半小时，将转移装置浸泡于预冷的转移缓冲液中，待电泳结束后，取下胶板，根据目的蛋白分子量切下相应大小的胶，浸泡于转移缓冲液中，根据胶的大小剪出适当大小的PVDF膜，浸泡于甲醇溶液中，待膜浸透后移至转移缓冲液中继续浸泡20min，制备“三明治”。恒流250mA电转移60min。4)封闭用0. 05% TBST浸泡洗涤PVDF膜5min后，置于含3%牛血清白蛋白TBST中室温慢摇封闭1小时5) 一抗孵育TBSTl 1000稀释抗-LC3兔抗鼠单克隆抗体，4°C过夜。次日TBST洗涤3次，每次洗涤10分钟，摇床振动幅度120转/分钟6) 二抗孵育及显影TBST 1 5000稀释HRP标记的羊抗兔IgG抗体，室温，摇床孵育1小时；TBST洗涤3次，每次洗涤10分钟，摇床振动幅度120rpm ；以ECL超敏发光底物曝光显影。如图2所示药物处理后DRibbles中自噬特征性标记物LC3-II的表达远远高于未处理组。提示自噬诱导剂雷帕霉素虽促进了自噬小体的生成，但由于自噬小体与溶酶体融合的降解途径未被阻断，自噬小体的降解未受抑制，因而DRibbles中自噬小体的总量无明显增加；而采用NH4Cl处理细胞抑制了溶酶体的酸化，阻止了溶酶体对自噬小体的降解， 因而从NH4Cl处理组募集到的DRibbles富含自噬小体。推测采用万珂、雷帕霉素及NH4Cl 处理H22/BNL细胞可以更有效地募集自噬小体。实施例5 小鼠DC的获取以及DC摄取DRibbles。1.小鼠体内DC的诱导采用尾静脉快速注射法，于实验的第1天给小鼠注射Flt3-L质粒，剂量为2 6 μ g/只，10天后，按照相同方法及剂量注射GM-CSF质粒，5天后收获小鼠脾脏；同时输注 PBS为对照小鼠。
2.小鼠DC的获取1.断颈处死小鼠，浸泡于75%酒精当中，于无菌手术台固定小鼠；2.无菌取出小鼠脾脏，将其置于平皿中，浸泡于PBS ；3.小鼠脾脏经磨砂玻片碾磨法获得单细胞悬液，用200目无菌不锈钢滤网过滤至 50ml离心管；4.加满 PBS, IOOOrpm 离心 IOmin ；5.离心后弃上清，加入5 IOml红细胞裂解液裂解红细胞，静置5min ；6.用PBS洗涤1次并调整计数单核细胞个数；7.用无血清RPMI-1640培养液重悬，将细胞浓度调至2X107ml，加入细胞冻存液于液氮中冻存。3.小鼠DC的鉴定1.另取脾细胞用BSA-PBS调整细胞浓度至1 X IO6个/ml，分至各Enpendoff 管；2. 2000rpm,离心IOmin ；弃上清，加入500 μ 1封闭液，室温下封闭30min ；3.用洗涤液(1% BSA-PBS)洗涤1遍；4.设6组分别加入荧光标记抗体1)不加任何抗体；2) CDl Ic-APC ；3)CDllc-APC+CDlIb-FITC ；4)CDllc-APC+CDllb-FITC+B220-PE ；5)CDllc-APC+CDllb-FITC+CD8-PE ；6)CDllc-APC+CDllb-FITC+NKl. I-PE ；各抗体各加入1μ 1，4°C，避光30min。5.用洗涤液洗涤2遍，去除多余的抗体，加入适量PBS重悬细胞进行流式细胞仪检测，CellQuest Plot软件分析结果。4.体内诱导DC吞噬DRilAles的检测CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异结合的基团，是一种良好的细胞标记物。CFSE不可逆地与细胞内氨基结合偶连到蛋白质上，作为细胞标记物它可以稳定存在于细胞核中且不会引起细胞凋亡或死亡。利用流式细胞仪488nm激发光和荧光 1 (FLl)检测通道可对其进行分析。本实验利用其可与细胞内蛋白结合的特性，用CFSE标记DRibbles，将标记后的DRibbles与小鼠DC共孵育，并通过PE-CDllc染色DC，检测DC中 CFSE的平均荧光强度，从而了解DC吞噬DRibbles的情况。具体操作步骤如下1. CFSE储存液的配制通过计算将25mg的CFSE用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配置成浓度为5mM的储存液；2.将制备好的用PBS重悬，每用PBS重悬，每ml悬液中加入2μ 1 5mM的CFSE，使其终浓度为10 μ M，置于37°C染色10-15min，在此期间轻轻摇晃2次；3.停止染色，加入5倍体积的预冷的PBS，置冰上5min ；4. 4°C,12000rpm, lOmin，离心收集沉淀；5.用PBS洗涤2次，12000rpm，IOmin,去除残留未结合的CFSE ；
6.用PBS重悬，取少量滴于96孔板中，在荧光显微镜下观察是否标记成功；7.如果标记成功，取适量标记后的与DC共孵育，1与DC共孵育，12小时后收集细胞；8. 1200rpm，10min，洗涤3次细胞，将未被DC摄取的游离的DRibbles去除掉；9.用PE-⑶Ilc抗体对细胞进行染色(流式细胞样本制作详见幻，上机检测⑶Ilc+ 细胞中CFSE荧光阳性细胞的比例。实施例6DRit3bleS(H2》免疫小鼠的特异性免疫应答研究。1.小鼠效应性淋巴细胞的制备1)将小鼠置于小型动物麻醉机中，异氟烷全身吸入式麻醉；2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠，以无菌手术器械剪开小鼠腹部皮肤，找到两侧腹股沟淋巴结；3)第1天一组每侧淋巴结注射201三种药物诱导的Dribbles (H22)，无菌手术缝线缝合伤口 ；另一组皮下2点注射三种药物诱导的DRibbles (每侧100 μ 1)；对照组注射 PBS ；4)第2、3天皮下2点注射DRibbles (每侧100 μ 1)进行免疫；对照组注射PBS ；5)第7天皮下2点注射DRibbles (每侧100 μ 1)进行增强免疫；对照组注射 PBS ；6)第15天将小鼠处死，于75%乙醇中浸泡5min，无菌手术取出小鼠的脾脏和淋巴结，制备单细胞悬液，用1640完全培养液重悬，调整至2 XlO6Ail，培养于M孔板中。2. DRilAles、灭活肿瘤细胞以及细胞裂解液与小鼠效应淋巴细胞体外共孵育，检测效应性淋巴细胞的增殖活性设A. DRibbles刺激组蛋白总浓度设30，10，3，0 μ g/ml 4个浓度;B. H22(丝裂霉素处理)刺激组蛋白总浓度设30，10, 3,0 μ g/ml 4个浓度；C. H22细胞裂解液组蛋白总浓度设30，10，3，0 μ g/ml 4个浓度；D.阴性对照组1640培养液；将各组抗原与效应性脾细胞共同培养于M孔板中；每孔2X 106/ml个脾细胞。收集72小时的培养上清，ELISA法检测上清中IFN-的含量。同时，设对照组小鼠(未经免疫)A. DRibbles刺激组蛋白总浓度设30，10，3，0 μ g/ml 4个浓度；B. H22(丝裂霉素处理)刺激组蛋白总浓度设30，10, 3,0 μ g/ml 4个浓度；C. H22细胞裂解液组蛋白总浓度设30，10，3，0 μ g/ml 4个浓度；D.阴性对照组1640培养液。步骤同前。3.用H22细胞来源的DRibbles和致死性处理的H22细胞以及肿瘤细胞裂解液体外刺激DRibble预免疫小鼠的淋巴细胞，7 后收集细胞培养上清，ELISA检测特异性淋巴细胞产生IFN-的情况。同时，用PBS免疫的小鼠作为对照，进行相同处理，从而分析Dribble 在细胞特异性免疫应答中的作用(细胞因子ELISA检测试剂盒购自e-Bioscience)。操作步骤如下1)按说明书要求稀释捕获抗体(capture antibody)，以1001/孔量包被96孔板，
9封板，4度过夜；2)弃去孔中液体，洗涤液洗5次(每孔> 2501)，每次洗涤时间约1分钟，吸水纸上扣干；3)将5X的稀释液稀释至IX，每孔加入2001，封闭，室温放置1小时；4)弃去孔中液体，洗涤液洗5次(每孔> 2501)，每次洗涤时间约1分钟，吸水纸上扣干；5)用IX的稀释液按要求稀释标准品，按需要每孔加入1001，做倍比稀释，以绘制标准曲线。每孔加入1001样本，封板，室温孵育2小时；6)弃去孔中液体，洗涤液洗5次(每孔> 2501)，每次洗涤时间约1分钟，吸水纸上扣干；7)每孔加入1001检测抗体(用IX稀释液稀释按要求稀释)，封板，室温孵育1 小时；8)弃去孔中液体，洗涤液洗5次(每孔> 2501)，每次洗涤时间约1分钟，吸水纸上扣干；9)每孔加入1001 HRP标记的亲和素(用IX稀释液稀释按要求稀释)，封板，室温孵育半小时；10)在弃去孔中液体前先加入洗涤液放置1-2分钟，其余同步骤2，本次洗涤次数为7次；11)每孔加入1001显色液，室温孵育15分钟；12)每孔加入501终止液；波长450nm处读数。结果提示图3，在DRibble的刺激浓度为30、10、3、0 ( μ g/ml)时，检测到的IFN-g 的分泌分别为369、270J84、52(pg/ml)；明显高于其他抗原(如灭活肿瘤细胞和细胞裂解液)刺激淋巴细胞产生的IFN-，ρ < 0.01o图4，PBS对照组小鼠的脾淋巴细胞接受相同剂量的DRitDble刺激时，几乎没有检测到IFN-的分泌，与实验组对比差异显著，ρ < 0.01o DRibbles作为抗原的载体，体外刺激免疫小鼠的淋巴细胞产生IFN-的能力远远强于致死性处理的肿瘤细胞以及肿瘤细胞裂解液等，并且这种免疫应答是细胞特异性免疫应答。实施例7 小鼠肝癌(Η22)皮下移植瘤模型的建立。1. Η22细胞的复苏及体外培养取冻存在液氮中的Η22细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (V/V)胎牛血清、 100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养液，重悬细胞至1 X IO6个/ml，并将其移入 500ml细胞培养瓶中，在37°C、5% (V/V)CO2的恒温培养箱中培养，每1 2天换液一次，常规0.25% (W/V)胰蛋白酶消化传代。2.腹腔接种传代Balb/c小鼠腹腔进行增殖传代。经过8_10天的时间，小鼠腹腔长出大量腹水，此时将小鼠颈椎脱臼法处死，小心抽取小鼠腹腔内腹水置入离心管内。用PBS缓冲液对离心管内的腹水肿瘤细胞进行清洗，离心，红细胞裂解液裂解红细胞，加PBS缓冲液稀释，取出1 滴稀释后的细胞溶液于显微镜下观察，并计数，用PBS缓冲液调配瘤细胞浓度至IO7个/mL 3.肿瘤模型的建立
将经腹腔传代的小鼠H22肿瘤细胞按每只小鼠IX IO6个/1001通过皮下注射接种于小鼠的左前腋窝下。瘤体长出后，每三天测量小鼠肿瘤长径及短径大小。计算所得小鼠肿瘤肿块面积S，计算公式S = LlX L2;其中Ll为肿块长径(mm)、L2为短径(mm)。结果显示小鼠肝癌细胞皮下移植瘤模型的建立成功(图5)。实施例8Drit3bleS(H22)疫苗对肝癌肿瘤的治疗作用。1.淋巴结或皮下注射DRibbles疫苗对Balb/c小鼠进行免疫，2周后皮下加强免疫。1)将小鼠置于小型动物麻醉机中，异氟烷全身吸入式麻醉；2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠，以无菌手术器械剪开小鼠腹部皮肤，找到两侧腹股沟淋巴结；3) 一组每侧淋巴结注射三种药物诱导的DRibbles201，无菌手术缝线缝合伤口 ； 另一组皮下2点注射三种药物诱导的DRibbles (每侧1001)；对照组注射PBS ；4)淋巴结注射2周后，皮下2点注射DRibbles (每侧1001)进行增强免疫；对照组注射PBS ；5)皮下注射1周后，在小鼠皮下建立H22移植瘤；观察肿瘤的生长情况，测量肿瘤的大小，记录小鼠的生存率。结果显示在皮下注射H22第3-5天，各组小鼠注射部位均不同程度观察到有皮下肿瘤的出现，观察情况如下A组(PBS对照组)4只小鼠在第5天有3只出现皮下肿瘤；B 组(DRilAle淋巴结注射组)只有1只出现皮下肿瘤；C组(DRilAle皮下注射组):4只中有2只出现皮下肿瘤。观察发现，随着时间的进展到第8天左右，A组各小鼠均长出皮下肿瘤，B组仍然只有1只小鼠长出皮下瘤，C组也是均长出皮下瘤，但是平均肿瘤面积明显小于 A组。观察到第15天左右，A组的4只小鼠中有1只出现肿瘤消失的现象，但同时，其余小鼠肿瘤继续生长；B组中的另外2只小鼠也出现皮下肿瘤的生长；C组总体来说变化不大， 肿瘤呈缩小趋势。于注射后第5天起开始进行肿瘤直径的测量，每3-5天测量并记录(图 6)。实施例9DRit3bleS (BNL)免疫小鼠的特异性免疫应答研究。1.小鼠效应性淋巴细胞的制备1)将小鼠置于小型动物麻醉机中，异氟烷全身吸入式麻醉；2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠，以无菌手术器械剪开小鼠腹部皮肤，找到两侧腹股沟淋巴结；3)第1天一组每侧淋巴结注射201三种药物诱导的Dribbles(BNL)，无菌手术缝线缝合伤口 ；另一组皮下2点注射三种药物诱导的DRibbles (每侧100 μ 1)；对照组注射 PBS ；4)第2、3天皮下2点注射DRibbles (每侧100 μ 1)进行免疫；对照组注射PBS ；5)第7天皮下2点注射DRibbles (每侧100 μ 1)进行增强免疫；对照组注射 PBS ；6)第15天将小鼠处死，于75%乙醇中浸泡5min，无菌手术取出小鼠的脾脏和淋巴结，制备单细胞悬液，用1640完全培养液重悬，调整至2 XlO6Ail，培养于M孔板中。2. Dribbles/PBS与小鼠效应淋巴细胞体外共孵育，检测效应性淋巴细胞的特异性免疫应答设A. DRibbles刺激组(蛋白总浓度3 μ g/ml)；B.阴性对照组PBS;将各组抗原与效应性脾细胞共同培养于M孔板中；每孔2X 106/ml个脾细胞。收集72小时的培养上清，ELISA法检测上清中IFN-的含量。同时，设对照组小鼠(未经免疫)A. DRibbles 刺激组(蛋白总浓度 3 μ g/ml)；B.阴性对照组PBS。步骤同前。3. Dribbles/PBS与小鼠效应CD8+T淋巴细胞体外共孵育，检测效应性CD8+T淋巴细胞的特异性免疫应答磁珠分离1.(本实施例)中小鼠的脾脏细胞中的CD8+T细胞设A. DRibbles刺激组(蛋白总浓度3 μ g/ml)；B.阴性对照组PBS;将各组抗原与效应性⑶8+T细胞共同培养于M孔板中；每孔2 X 106/ml个脾细胞。收集72小时的培养上清，ELISA法检测上清中IFN-的含量。同时，设对照组小鼠(未经免疫)A. DRibbles 刺激组(蛋白总浓度 3 μ g/ml)；B.阴性对照组PBS。步骤同前。4. Dribbles/PBS与小鼠效应CD4+T淋巴细胞体外共孵育，检测效应性CD4+T淋巴细胞的特异性免疫应答磁珠分离1.(本实施例)中小鼠的脾脏细胞中的CD4+T细胞设A. DRibbles刺激组(蛋白总浓度3 μ g/ml)；B.阴性对照组PBS;将各组抗原与效应性⑶8+T细胞共同培养于M孔板中；每孔2 X 106/ml个脾细胞。收集72小时的培养上清，ELISA法检测上清中IFN-和it的含量。同时，设对照组小鼠(未经免疫)A. DRibbles 刺激组(蛋白总浓度 3 μ g/ml)；B.阴性对照组PBS。步骤同前。结果显示采用淋巴结注射方法将DRibbles(BNL)免疫小鼠，采用DRibbles体外再刺激DRibbles预免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞，结果显示(如图7A) =DRibbles再刺激预免疫小鼠脾细胞产生IFN-Y明显高于对照组小鼠脾细胞以及实验组(CM) ；IFN-γ检测显示(如图7B，C，D) =DRibbles(BNL)免疫小鼠不仅诱导了特异性⑶8+T细胞应答、同时诱导了特异性CD4+T细胞应答。实施例10 小鼠肝癌(BNL)皮下移植瘤模型的建立。1. BNL细胞的复苏及体外培养取冻存在液氮中的BNL细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (V/V)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养液，重悬细胞至1 X IO6个/ml，并将其移入 500ml细胞培养瓶中，在37°C、5% (V/V)C02的恒温培养箱中培养，每1 2天换液一次，常规0.25% (W/V)胰蛋白酶消化传代。2.肿瘤模型的建立将经体外传代的小鼠BNL肿瘤细胞按IXlO6个/150μ 1、2X106个/150μ 1、 5Χ106Α/150μ1*1Χ107Α/150μ1的剂量通过皮下注射接种于小鼠的左侧腹部。3天以后，观察到2Χ106Α/150μ1、5Χ106Α/150μ1和IX IO7个/150 μ 1的剂量有皮下瘤体长出，每三天测量小鼠肿瘤长径及短径大小，计算所得小鼠肿瘤肿块面积S (如图8)，计算公式S = LlXL2 ；其中Ll为肿块长径(mm)、L2为短径(mm)。结果显示小鼠肝癌细胞(BNL)皮下移植瘤模型的建立成功(图8)。实施例11 取实施例10中构建的小鼠肝癌细胞(BNL)皮下移植瘤模型，随机分为治疗组和对照组(每组10只)。1)将小鼠置于小型动物麻醉机中，异氟烷全身吸入式麻醉；2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠，以无菌手术器械剪开小鼠腹部皮肤，找到两侧腹股沟淋巴结；3)第1天治疗组每只小鼠每侧淋巴结注射201三种药物诱导的Dribbles，无菌手术缝线缝合伤口 ；对照组注射PBS ；4)第2天治疗组和对照组小鼠都进行皮下注射0X865)第3，6天，皮下2点注射DRibbles (每侧1001)进行增强免疫；对照组注射PBS ；6)观察肿瘤的生长情况，测量肿瘤的大小，记录小鼠的生存率。结果显示在皮下注射BNL细胞第3天，小鼠注射部位均不同程度观察到有皮下肿瘤的出现。在第6天时，进行第一次免疫(免疫第1天)。观察至第20天，治疗组小鼠的肿瘤大小已小于对照组，并且出现一定的减小趋势。观察至第30天，治疗组小鼠的肿瘤成生长趋势，但此时已明显小于对照组肿瘤大小。(如图9A. B)治疗组和对照组小鼠肿瘤的病理切片显示PBS对照组的肿瘤能观察到大量血管，说明血供丰富，肿瘤细胞为多边形和卵圆形，核大，深染，核仁明显，核分裂相易见，未见明显炎细胞浸润。与此同时，治疗组的肿瘤周围可见疏松结缔组织包绕，结缔组织内可见少量炎细胞，(如图10A.B)。
1权利要求
1.H22肝癌细胞自噬小体DRibbles在制备肝癌治疗性疫苗中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的H22肝癌细胞自噬小体DRibbles 按如下步骤制备得到(1)H22肝癌细胞的培养复苏冻存H22细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，重悬细胞至1 X IO6个/ml，并将其移入500ml细胞培养瓶中，在37°C、5% (V/V)C02的恒温培养箱中培养，每1 2天换液一次，常规0. 25%胰蛋白酶消化传代；O) H22肝癌细胞的处理待步骤(1)培养后的细胞贴壁良好，密度适中后，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，雷帕霉素、万珂和氯化铵的加入量分别为100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干预H22肝癌细胞 16小时，诱导自噬小体DRibbles ；(3)提取 DRibbles 将步骤(2)诱导后的细胞经离心得到沉淀，即为自噬小体DRibbles。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，提取DRibbles具体包含如下步骤(3a)将细胞及培养液倒入50ml离心管中，低速离心1200rpm，IOmin ；(3b)将步骤(3a)离心后的上清倒入圆底超速50ml离心管，高速离心12000rpm， 30min,4°C ；(3c)将步骤(3a)离心后的沉淀的细胞用PBS重悬，低速离心1200rpm，lOmin，将低速离心后的上清再次倒入另一圆底超速50ml离心管中，高速离心12000rpm，30min，4°C ；(3d)将步骤(3b)和(3c)两次高速离心后得到的沉淀用PBS重悬，合并，12000rpm高速离心 30min，4°C ；(3e)弃步骤(3d)得到的上清，沉淀即为自噬小体DRibbles，将沉淀用Iml PBS重悬后分装，冻存于_20°C，备用。
全文摘要
本发明公开了H22肝癌细胞自噬小体DRibbles在制备肝癌治疗性疫苗中的应用。肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。研制肝癌疫苗将能够有效的预发肝癌的发生。发明人的多年研究结果显示肿瘤细胞的自噬小体是肿瘤抗原交叉递呈的有效载体之一。本发明包括用人肝癌细胞中提取自噬小体——DRibbles的核心技术，并证实其能够有效的诱导机体抗肿瘤免疫应答，具有良好的生物治疗前景。
文档编号A61K39/00GK102430118SQ201110440169
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者曹萌, 王立新 申请人:东南大学