专利名称：遗传性疾病的预防/改善剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防/改善剂，其特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物。
背景技术：
肌营养不良是肌纤维的破坏/变性(肌坏死)与再生反复发生，从而使肌肉萎缩和肌肉无力随之发展的遗传性肌肉疾病的总称，其中，进行性肌营养不良是众所周知的。属于进行性肌营养不良之一的杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy:DMD)在肌营养不良中最为普遍，其因X染色体上的肌营养不良蛋白基因的突变而发病(参照非专利文献I)。由于幼年时期发病的进行性肌肉萎缩，DMD患者通常会在20岁左右因心力衰竭或呼吸器官衰竭而死亡。肌营养不良蛋白质(以下也简单表示为“肌营养不良蛋白”。)存在于肌细胞的细胞膜的内侧，通过将由肌动蛋白-肌球蛋白引起的肌肉收缩所产生的机械性能量以良好的平衡传递至细胞膜、周围的结缔组织、腱等，并进行调节，以不施加过度的冲击，由此发挥保护肌细胞结构的作用。在DMD患者的情况下，由于其肌营养不良蛋白基因的突变，肌纤维中完全不存在或仅存在极少量肌营养不良蛋白，因此会因肌肉收缩而导致肌细胞的细胞膜破损，从而使比通常量更多的钙离子流入肌纤维中。过量的钙会使诱发钙蛋白酶、蛋白酶等的破坏肌肉或诱发细胞凋亡 的酶活化，其结果导致成纤维细胞被活化而出现纤维化，组织形成瘢痕，肌细胞难以再生，肌肉萎缩逐渐发展。另一方面,属于进行性肌营养不良之一的贝克氏型肌营养不良(Beckermusculardystrophy:BMD)也是因肌营养不良蛋白基因的突变而发病的，其发病时间通常为成年，症状的发展也比DMD缓慢。虽然DMD和BMD均因肌营养不良蛋白基因的突变而发病，但其症状的程度、发展速度不同。DMD和BMD的这个差别可通过读码框规则来说明。对于肌营养不良蛋白mRNA而言,产生提前终止密码子(premature termination codon:PTC)的突变(无义突变)通常会引起重度的DMD表现型(杜氏)，而维持了肌营养不良蛋白mRNA原有读码框的突变(整码突变，in-frame mutation)则会成为症状更轻的BMD表现型(贝克氏型)(参照非专利文献2)。但是，令人意外的是，报告有:虽然若干轻症BMD患者的肌营养不良蛋白基因上具有无义突变，但通过使包含该无义突变的外显子跳跃，会产生新型的读码框内的肌营养不良蛋白mRNA(参照非专利文献:Γ6)。由于跳跃而缺失部分外显子的该肌营养不良蛋白mRNA编码所得的肌营养不良蛋白(截短型肌营养不良蛋白)比正常的肌营养不良蛋白短，但在某种程度上残存保持肌细胞结构的功能，因此肌营养不良的症状比较轻，另夕卜，肌肉萎缩的发展速度也变慢。从根本上治疗肌营养不良的方法尚未确立，以往，除了功能训练、用于预防关节挛缩的伸展之外，只不过针对心力衰竭/呼吸障碍进行对症治疗。但是，近年来，本发明人等、其它研究人等开发了针对DMD的新治疗方法，备受期待。该治疗方法是通过使用肌营养不良蛋白mRNA的反义寡核苷酸(AON)诱发外显子跳跃，实现从DMD表现型向BMD表现型的转换，从而使症状减轻的方法(非专利文献3)。为了在DMD患者的细胞中诱发外显子跳跃，对于任意剪接部位或剪接促进元件设计了几种不同的AON。这些AON可以修复肌营养不良蛋白mRNA的读码框。例如，通过外显子19的外显子剪接增强子(ESE)的Α0Ν，可观察到前述DMD患者细胞中产生外显子19的跳跃、生成截短型肌营养不良蛋白(参照非专利文献3飞)。另外，外显子51的AON也多用于患者细胞，现在，这些AON还处于临床研究阶段(参照非专利文献6 8)。然而，AON存在必须定期进行肌肉注射或静脉注射、对患者而言比较麻烦的问题、或大量制备需要高额费用的问题。此外，对作为肌营养不良模型小鼠的mdx小鼠进行AON处理时，骨骼肌中的肌营养不良蛋白的表达在某种程度上得以恢复，但心脏中的肌营养不良蛋白的表达难以恢复(非专利文献9)。因此，临床上非常期待用于调节外显子跳跃的低分子。报告有作为低分子的非氨基糖苷类无义突变抑制基因化合物的PTC124(注册商标)(3-[5-(2-氟代苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基]苯甲酸)能够治疗具有无义突变的部分DMD患者(非专利文献10、11)，现在，在美国等正在进行2b期的临床试验。PTC124是通过在核糖体翻译时连读(read-through)提前终止密码子(PTC)的方式进行诱发，从而在某种程度上恢复具有全长功能的肌营养不良蛋白的表达的治疗药，但对其它依赖基因无义突变的mRNA分解机理的影响尚未明确。然而，本发明人等确认TG003(后述通式(I)中，R1和R2为甲基、R3为甲氧基的化合物)可作为Cdc-1ike激酶(Clk)特异性激酶抑制剂。TG003是在体外和体内两种情况下均对剪接产生影响的化合物(参照非专利文献12和13)，本发明人等在相关专利申请(参照专利文献I)中记载了:TG003具有介由SR蛋白质的磷酸化反应来调节替代剪接的作用、可利用所述作用来进行癌症等疾病的预防、治疗。但是，迄今为止，TG003可促进肌营养不良蛋白基因的外显子的跳跃尚属未知。现有技术文献_9] 专利文献 专利文献1:美国专利申请公开第20050171026号说明书非专利文献非专利文献1:Cell (1988) 53，219-228.
非专利文献2 =Genomics (1988) 2，90-95.
非专利文献3 =Pediatr Res (2006) 59，690-694.
非专利文献4:Biochem Biophys Res Commun (1996) 226, 445-449.
非专利文献5 J Clin Invest (1995) 95，515-520.
非专利文献6:Lancet neurology (2009) 8, 873-875.
非专利文献7:The New England journal of medicine (2007) 357，2677-2686.
非专利文献8:Lancet neurology (2009) 8, 918-928.
非专利文献9 =Nature medicine (2006) 12, 175-177.
非专利文献10:J Clin Pharmacol (2007)47，430-444.
非专利文献11 =Nature (2007) 447, 87-91.
非专利 文献 12:The Journal of biologicalchemistry(2004)279，24246-24252.
非专利文献13:Genes Cells (2008) 13，233-244.
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种预防/改善剂，其特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物。本发明人等在针对400名以上的肌营养不良患者分析其肌营养不良蛋白基因的突变时，发现了外显子31中具有根据背景技术中记载的读码框规则预测会成为重度DMD表现型的无义突变，但其症状却是BMD型的患者。对所述患者的肌营养不良蛋白基因的mRNA进行分析时，明确了:外显子31的该无义突变会诱发外显子31的跳跃，由此部分生成用于编码功能性截短型肌营养不良蛋白的成熟mRNA。因此，本发明人等探求促进外显子跳跃的低分子化合物，发现了:作为Clk特异性抑制剂的TG003依赖于用量地促进内在性肌营养不良蛋白基因的外显子31、外显子27的跳跃，能够增强患者的细胞中的功能性截短型肌营养不良蛋白的产生，从而完成了本发明。S卩，本发明涉及以下预防/改善剂:⑴一种预防/改善剂，其特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物；(2)上述(I)所述的预防/改善剂，其特征在于，前述化合物为具有剪接调节作用的化合物；(3)上述(I)或
(2)所述的预防/改善剂，其特征在于，前述化合物为具有诱发/促进包含突变的外显子的跳跃的效果的化合物；(4)上述(I)至(3)中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，前述化合物为Cdc-1ike激酶抑制化合物；(5)上述(4)所述的预防/改善剂，其特征在于，前述Cdc-1ike激酶抑制化合物为通式(I)所示的化合物，[化学式I]
权利要求
1.种预防/改善剂，其特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物。
2.据权利要求1所述的预防/改善剂，其特征在于，所述化合物为具有剪接调节作用的化合物。
3.据权利要求1或2所述的预防/改善剂，其特征在于，所述化合物为具有诱发/促进包含突变的外显子的跳跃的效果的化合物。
4.据权利要求1至3中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，所述化合物为Cdc-1ike激酶抑制化合物。
5.据权利要求4所述的预防/改善剂，其特征在于，所述Cdc-1ike激酶抑制化合物为通式(I)所示的化合物， [化学式I]
6.据权利要求1至5中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，所述突变为无义突变。
7.据权利要求6所述的预防/改善剂，其特征在于，所述无义突变为抑制所述基因的外显子剪接增强子活性、和/或、使所述基因的外显子剪接沉默子活性提升的无义突变。
8.据权利要求1至7中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，所述基因为肌营养不良蛋白基因，所述功能性截短型蛋白质为功能性截短型肌营养不良蛋白质，所述遗传性疾病为杜氏肌营养不良。
9.据权利要求8所述的预防/改善剂，其特征在于，所述肌营养不良蛋白基因的外显子为肌营养不良蛋白基因的外显子31或外显子27。
10.据权利要求9所述的预防/改善剂，其特征在于，所述肌营养不良蛋白基因的外显子31的突变为序列号I的多聚核苷酸序列的核苷酸编号4303中的鸟嘌呤向胸腺嘧啶的无义突变，外显子27的突变为序列号I的多聚核苷酸序列的核苷酸编号3613中的鸟嘌呤缺失的移码突变。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂。本发明使用的预防/改善剂的特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物。
文档编号A61P21/04GK103096928SQ20118003032
公开日2013年5月8日 申请日期2011年6月27日 优先权日2010年6月28日
发明者萩原正敏, 松尾雅文, 片冈直行, 西田笃史 申请人:萩原正敏, 松尾雅文