呼吸道合胞病毒抗原组合物和方法

专利名称：呼吸道合胞病毒抗原组合物和方法
技术领域：
本公开内容涉及用于预防呼吸道合胞病毒感染的组合物和方法，特别是包含抗原表位的多层膜组合物。
背景技术：
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是造成全世界婴幼儿严重下呼吸道疾病的最重要原因，也威胁着老年人和免疫缺陷患者。在美国，RSV感染每年导致多至126，000个婴儿住院治疗，以及多至60，000个老年人住院治疗。因为自然RSV感染不诱发持久的长期免疫，所以患者在一生中均可以被 相同或不同的病毒株再感染。RSV与继发感染如中耳炎相关，其可使得幼儿在之后易于患哮喘相关疾病。在经过40多年的努力以后，依旧没有安全有效的RSV疫苗。在二十世纪六十年代最早尝试开发出的福尔马林灭活明帆沉淀RSV (formalin-1nactivatedalum-precipitated RSV,FI_RSV)疫苗实际上表现出易于使被接种的儿童在随后的自然感染中患上更加严重的疾病甚至是死亡。尚未全面表征出该应答的准确机制，但是其似乎依赖于使免疫应答向以细胞因子和趋化因子途径之不恰当活化为特征的炎性Th2优势表型(Th2_dominant phenotype)偏移。考虑到RSV疾病对经济的影响(2004年在美国估计为每年近700百万美元)以及RSV感染婴儿、老人和免疫缺陷患者可造成的威胁生命的并发症，开发安全有效的RSV疫苗极为重要。需要适于刺激针对RSV之免疫应答的改进的抗原组合物。

发明内容
在一个实施方案中，组合物包含来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位，其中第一多肽表位和第二多肽表位与一种或更多种聚电解质共价相连，其中所述一种或更多种聚电解质在一个或更多个多层膜中，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，其中聚电解质包括分子量大于1，000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，其中来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位存在于同一多层膜或不同的多层膜中。在另一实施方案中，组合物包含来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位，其中第一多肽表位和第二多肽表位为一个或更多个多层膜的形式，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，其中多层膜的至少一种聚电解质包含经设计的多肽，其中经设计的多肽带有足以与带相反电荷的表面稳定结合的电荷，其中经设计的多肽包含来自RSV的第一多肽表位、来自RSV的第二多肽表位或二者，其中不是经设计的多肽的聚电解质包括分子量大于1，000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，其中来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位存在于同一多层膜或不同的多层膜中。组合物包含与一种或更多种聚电解质共价连接的RSV-G多肽表位，其中所述一种或更多种聚电解质在一个或更多个多层膜中，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，其中聚电解质包括分子量大于1，000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料。


图1 :完整ACT-2044(SEQ ID NO 8)的MH6+6电荷态的放大FT-1CR质谱图。全氧化肽的预期单同位素m/z = 1015. 43，实测值=1015.6008。该结果与ACT-2044中两个分子内~硫键完全相符。图2 ACT-2086 (SEQ ID NO : 13)的 FT-1CR 质谱图。MH9+9 单同位素峰的 m/z 为867. 1571，对应于7795. 344amu的单同位素质量，其非常接近于7795. 33amu的单同位素质量计算值。该结果完全与ACT-2086中两个二硫键的存在符合。图3 :在每一 ELBL成层步骤后测量的纳米颗粒的表面(;)电势。未包被颗粒(EP)具有正4值。包被单层PGA得到负4值。随后用经设计的肽ACT-2031、多肽PGA和PLL、或经设计的肽ACT-2044进行的成层步骤造成;电势交替正或负移，表明成功的ELBL步骤。图4:通过足垫注射用纳米颗粒ACT-1042 (SEQ ID NO 8 ； RSV-G164^191)免疫BALB/c小鼠三次；获取血清并且用ELISA进行测定。血清识别RSV-G CX3C构象表位肽ACT-2044(SEQ ID NO 8)。图5 :通过足垫注射用纳米颗粒 ACT-1042(SEQ ID NO 8 ;RSV_G164_191)免疫 BALB/c小鼠三次；获取血清并且用ELISA进行测定。血清不识别同一肽通过半胱氨酸残基加帽来线性化的形式(ACT-2054 ；SEQ ID NO 9)。图6 :通过足垫注射用纳米颗粒 ACT-1042(SEQ ID NO 8 ;RSV_G164_191)免疫 BALB/c小鼠三次；获取血清并且用ELISA进行测定。血清也识别天然RSV-G蛋白。图7 :通过足垫注射用纳米颗粒 ACT-1042(SEQ ID NO 8 ；RSV-G164^191)免疫 BALB/c小鼠三次；获取血清并且在测量RSV-G与CX3CR1趋化因子受体结合之抑制的生物化学结合测定中进行检测。由ACT-1042引起的抗体应答的生物活性通过RSV-G与趋化因子受体结合的抑制来确定。 图8 :通过足垫注射用纳米颗粒 ACT-1042(SEQ ID NO :8 ;RSV_G164_191)免疫 BALB/c小鼠三次；获取血清并且在细胞迁移实验中进行测定。由ACT-1042引起的抗体应答的生物活性通过人PBMC向经纯化RSV-G迁移的抑制来确定。图9 :通过 s. c.、1. p.、1. n.和足垫施用用 ACT_1023(SEQ ID NO :12 ；RSV-M281_98)免疫后的RSV-M2特异性T细胞应答。在免疫后14天从小鼠体内获取脾细胞，在IL-4或正^^￡115 01'板中用1 ￥-]\12肽4(1'-2019(5￡0 ID NO 7)再刺激。结果显示在单个未处理或免疫动物中每IO6细胞抗原特异性T细胞的数量。
图10 :多价RSV纳米颗粒混合疫苗的免疫原性。在第0天和第21天免疫BALB/c小鼠(5只/组，5至6周龄)。针对RSV-G的抗体应答在第28天采集血清，用ELISA测量RSV-G特异性IgG抗体效价。数据为每组5只小鼠的平均值土SD。图11 :多价RSV纳米颗粒混合疫苗的免疫原性。在第0天和第21天免疫BALB/c小鼠(5只/组，5至6周龄)。针对RSV-M2的T细胞应答在第28天获取脾细胞，在IFN y或IL-4ELISP0T板中用RSV-M2(ACT-2031 ；SEQ ID NO :12)再刺激。数据为每组5只小鼠的平均值土 SD。图12 :通过RSV纳米颗粒免疫诱导体内CTL活性。如所示免疫BALB/c小鼠，在7天后通过1.v.注射用ACT-2031 (RSV-M2 ;SEQ ID NO :12)脉冲(pulse)并且标记有高剂量荧光示踪剂CFSE的同基因脾细胞(蓝色峰)与标记有低剂量CFSE并且无靶标肽的同基因脾细胞(红色峰)的混合物来进行攻击。次日，利用流式细胞术分析免疫小鼠的脾，以检测具有不同标记的供体靶细胞的存活。各柱图示出来自处理组中单个免疫小鼠的结果。图13 :通过RSV纳米颗粒免疫诱导体内CTL活性。结果示出图12中被特异性杀死的RSV-M2标记靶细胞的百分比，其通过比较柱状图中每个峰的相对细胞数来计算。图14和15示出在利用单表位和多表位构建物的RSV颗粒免疫后的初始后(14)和加强后(15)的抗体应答。图16是图14和15所示结果的柱状图。图17示出了用活RSV攻击被含有RSV-G、RSV_M2或其组合之RSV纳米颗粒免疫的小鼠的结果。数据以噬斑测定和qPCR测定示出。图18 :通过RSV纳米颗粒免疫诱导体内CTL活性。如所示免疫BALB/c小鼠，在7天后通过1. V.注射用ACT-2031 (RSV-M2 ；SEQ ID NO :12)脉冲且标记有高剂量荧光示踪剂CFSE的同基因脾细胞(蓝色峰)与标记有低剂量荧光示踪剂CFSE且无靶标肽的同基因脾细胞(红色峰)的混合物来进行攻击。次日，利用流式细胞术分析免疫小鼠的脾脏，来检测具有不同标记的供体靶细胞的存活。各柱图示出来自处理组中单个免疫小鼠的结果。图19 :通过RSV纳米颗粒免疫诱导体内CTL活性。结果示出图18中被特异性杀死的RSV-M2标记靶细胞的百分比，其通过比较柱状图各峰中细胞的相对数来计算。图20和21 =RSV-G特异性抗体应答。在第0天和第21天免疫BALB/c小鼠。利用ELISA测量加强后血清中RSV-G特异性IgG抗体的效价。(20) OD值，I 50稀释的各血清。混合物(cocktail) = ACT-1023+1042。水平条代表组中各值的平均数。(21)在连续滴定中每组5种血清的平均。通过以下具体实施方式
、附图和所附权利要求，本领域技术人员将理解并领会上述及其他特征。详述本文公开的是包含来自RSV的多肽表位的多层膜，其中多层膜在给宿主施用后能够引起宿主体内的免疫应答。在一个实施方案中，多层膜包含两种来自RSV的多肽表位，特别是引发特异性T细胞应答(如细胞毒性T细胞应答)的表位和引发特异性抗体应答的表位。在该实施方案中，本发明人出乎意料地发现与仅施用一种成分相比，将引发特异性T细胞应答的表位与引发特异性抗体应答的表位进行组合使得以T细胞应答测量的免疫效力出乎意料地增强。特别地，与仅含RSV-M2表位的多层膜相比，采用一个或更多个多层膜形式的RSV-G (特异性抗体应答)和RSV-M2 (特异性T细胞应答)表位的组合引起显著增强的T细胞应答。特别地，多层膜包含带相反电荷的聚电解质的交替层，其中一个聚电解质层包含共价连接有至少一种来自RSV之多肽表位的聚电解质。第一和第二 RSV多肽表位可以连接在相同或不同的聚电解质上，和/或可以存在于同一多层膜或不同的多层膜中。在一个实施方案中，第一和第二 RSV多肽表位共价连接在相同聚电解质上，因此位于相同多层膜中。在另一实施方案中，第一和第二 RSV多肽表位共价连接在不同的聚电解质上,但成层于同一多层膜内。而在另一实施方案中，第一和第二 RSV多肽共价连接在不同的聚电解质上,但是成层于不同的多层膜内(其随后在施用前混合)。在一个实施方案中，多层膜包含带相反电荷的聚电解质的交替层，其中一个聚电解质层为包含至少一种来自RSV之多肽表位的经设计的多肽。第一和第二 RSV多肽表位可以存在于相同或不同的经设计的多肽中，和/或可以存在于同一多层膜或不同的多层膜中。在一个实施方案中，第一和第二 RSV多肽表位存在于相同的经设计的多肽中，因此位于相同多层膜中。在另一实施方案中，第一和第二 RSV多肽表位存在于不同的经设计的多肽中，但成层于同一多层膜内。而在另一实施方案中，第一和第二 RSV多肽表位存在于不同的经设计的多肽中，但是成层于不同的多层膜内(其随后在施用前混合)。在一个实施方案中，RSV多肽表位来自RSV-G蛋白。RSV-G(粘附)蛋白与很多失常相关，包括CC和CXC趋化因子mRNA表达的改变以及Th2细胞因子应答的改变，其似乎帮助产生不恰当的免疫结果和增强的疾病。RSV-G蛋白的富含半胱氨酸的中央保守区在氨基酸182至186位包含CX3C趋化因子基序，其与CXXXC趋化分子(fractalkine) (CX3CL1)受体CX3CR1结合。RSV-G对CX3CL1的模拟促进RSV感染并干扰针对病毒的正常适应性免疫应答。利用跨RSV-G CX3C基序的肽进行主动免疫保护小鼠免受RSV感染和肺部炎症。迄今，还未将这些RSV-G肽开发成安全有效的疫苗。

在另一实施方案中，RSV多肽表位来自RSV-F或RSV-M2蛋白。除了 RSV-G蛋白外，RSV-F(融合)蛋白和RSV-M2(基质)蛋白也是可行的疫苗候选物。开发仅含一种主要抗原决定簇的单价RSV疫苗的尝试因不能完全形成针对感染和炎性疾病的保护而受到阻碍，提示多价方法可能更成功。实际上，利用引起抗体和CD8+T细胞应答二者的多价疫苗免疫小鼠导致Th2的降低和Thl/CD8应答的提高，其与针对病毒感染的更强保护和更少的炎性肺病相关。这些结果提示理想的RSV疫苗设计应包含来自两种或更多种病毒蛋白质的表位，并且能引发抗体和分泌IFNy的⑶8+T细胞二者。在另一实施方案中，多层膜包含来自RSV的多肽表位，其中多肽表位来自RSV-G蛋白(特异性抗体应答)。出乎意料地发现用包含RSV-GCX3C表位的纳米颗粒免疫小鼠保护其免受活RSV的攻击。有趣的是，RSV-M2表位不提供针对活RSV攻击的保护，与单独的RSV-G相比，RSV-G和RSV-M2组合疫苗不提供增强的保护。不受理论的约束，认为在这些实验中所使用的高浓度纳米颗粒可能掩盖了组合纳米颗粒的潜在益处。在一个实施方案中，多层膜沉积(deposit)在核心颗粒上,例如CaCO3纳米颗粒、胶乳颗粒或铁颗粒。具有直径为5纳米(nm)至50微米(y m)左右的大小的颗粒尤其有用。也可以使用由其他材料制作的颗粒作为核心，前提是它们是生物相容的，具有可控制的大小分布，并且具有足以结合聚电解质肽的表面电荷(无论正或负)。实例包括由例如以下的材料制作的纳米颗粒和微颗粒聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、壳聚糖、透明质酸、明胶或其组合。核心颗粒还可以由被认为不适于在人类使用的材料制作，前提是它们可在膜制作后被溶解并且与多层膜分离。模板核心物质的例子包括有机聚合物如胶乳或无机材料如硅石。聚电解质多层膜是由带相反电荷的聚电解质的交替层构成的薄膜(例如，几纳米至微米厚)。这些膜可以通过在合适底物上通过层层组装(layer-by-layer assembly)形成。在静电层层自组装(“ELBL”)中，聚电解质结合的物理基础是静电引力。因为在连续膜沉积时膜表面电荷密度的符号转变，所以膜的构建是可行的。ELBL膜方法的通用性和相对简便性允许很多不同类型的聚电解质沉积在很多不同类型的表面上。多肽多层膜是聚电解质多层膜的亚类型，其包含至少一层这样的层，所述层包含带电多肽(在本文称作经设计的多肽)。与由其他聚合物制作的膜相比，多肽多层膜的主要优点是其生物相容性。ELBL膜也可以用于封装(encapsulation)。多肽膜和微囊的应用包括,例如纳米反应器、生物传感器、人造细胞和药物递送运载体。术语“聚电解质”包括分子量大于1，000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子和聚阴离子材料。合适的聚阳离子材料包括例如多肽和聚胺。聚胺包括例如多肽如聚L-赖氨酸(PLL)或聚L-鸟氨酸、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N- 二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N- 二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯氯)(poly (N,N,N-trimethylaminoa crylate chloride))、聚(甲基丙烯酸胺基丙基三甲基氯化铵)、壳聚糖以及包含一种或更多种上述聚阳离子材料的组合。合适的聚阴离子材料包括例如多肽如聚L-谷氨酸(PGA)和聚L-天冬氨酸、核酸如DNA和RNA、藻酸盐、角叉菜胶(carrageenan)、帚叉藻胶(furcellaran)、果胶、黄原胶、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸葡聚糖、聚(甲基)丙烯酸、氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多糖和交联羧甲纤维素(croscarmelose),包含悬垂(pendant)羧基的共聚物和合成聚合物，以及包含一种或更多种上述聚阴离子材料的组合。在一个实施方案中，RSV表位和聚电解质具有相同的电荷符号。在一个实施方案中，膜的一个或更多个聚电解质层(任选地包括包含RSV表位的聚电解质)为经设计的多肽。在一个实施方案中，适于静电层层沉积的多肽的设计原理在美国专利公开No. 2005/0069950中说明，其关于多肽多层膜的教导通过引用并入本文。简单来说，主要设计考虑为多肽的长度和电荷。静电是最重要的设计考虑，因为它是ELBL的基础。没有合适的电荷性质，多肽可能无法基本溶解在PH4至10的水溶液中，也无法容易地用于通过ELBL制造多层膜。其他设计考虑包括多肽的物理结构、由多肽形成的膜的物理稳定性，以及膜和组分多肽的生物相容性和生物活性。经设计的多肽是指带有的电荷足以与带相反电荷的表面稳定结合的多肽，S卩，可以沉积成多层膜的层的多肽，其中形成膜的驱动力是静电作用。短期稳定膜是指形成后在PBS中于37°C孵育24小时后保留其一半以上成分的膜。在一些具体实施方案中，经设计的多肽的长度为至少15个氨基酸，在pH 7. 0多肽每残基的静电荷的大小大于或等于0.1、0. 2、0. 3、0. 4或0. 5。在pH 7.0下带正电荷(碱性)的天然氨基酸为精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、鸟氨酸(Orn)和赖氨酸(Lys)。在pH 7.0下带负电荷(酸性)的天然氨基酸为谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)。也可以使用带相反电荷的氨基酸残基的混合，只要电荷的总的净比率满足特定标准。在一个实施方案中，经设计的多肽不是同聚物。在另一实施方案中，经设计的多肽无支链。一个设计考虑是多肽ELBL膜稳定性的控制。离子键、氢键、范德华相互作用和疏水相互作用促进多层膜的稳定。此外，在同一层或相邻层内多肽含巯基氨基酸之间形成的共价二硫键可以增加结构强度。含巯基氨基酸包括半胱氨酸和高半胱氨酸，这些残基可以容易地整合入合成的经设计多肽中。此外，可以利用文献中充分描述的方法将巯基整合进聚电解质同聚物如聚L-赖氨酸或聚L-谷氨酸中。通过改变氧化电势，含巯基氨基酸可被用于“锁”(结合在一起)和“解锁”多层多肽膜的层。此外，在经设计的多肽中整合含巯基氨基酸使得通过在分子间形成二硫键来在薄膜制造中使用相对短的肽。在一个实施方案中，在还原剂的存在下通过ELBL组装经设计的含巯基多肽(无论是化学合成的还是在宿主生物中产生的)以防止过早形成二硫键。在膜组装之后，去除还原剂并且加入氧化剂。在氧化剂的存在下巯基间形成二硫键，由此在硫醇基存在处将层内和层间的多肽“锁”在一起。合适的还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)、2_巯基乙醇(BME)、还原型谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)以及多于一种这些化学物的组合。合适的氧化剂包括氧化型谷胱甘肽、叔丁基过氧化氢(卜8即)、硫柳汞、二酰胺、5，5' -二硫代-双(2-硝基-苯甲酸)(DTNB)、4，4' - 二硫代二吡啶、溴酸钠、过氧化氢、连四硫酸钠、porphyrindin、sodiumorthoiodosobenzoate以及多于一种这些化学物的组合。作为二硫键的代替物，也可以使用产生其他共价键的化学成分来稳定ELBL膜。对于由多肽构成的膜，产生酰胺键的化学成分尤其有用。在合适偶联剂的存在下，酸性氨基酸(侧链包含羧酸基团的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸)将与侧链包含胺基的氨基酸(例如赖氨酸和鸟氨酸)反应形成酰胺键。在生物条件下酰胺键比二硫键更稳定，并且酰胺键不进行交换反应(exchange reaction)。可以使用很多试剂来活化多肽侧链以进行酰胺结合。碳二亚胺试剂(如水溶性1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC))在弱酸性pH下与天冬氨酸或谷氨酸反应形成中间产物，所述中间产物与胺基不可逆反应形成酰胺键。经常向反应中加入添加剂如N-羟基琥珀酰亚胺以加快形成酰胺的速率和效率。反应之后，通过离心和抽吸从纳米颗粒或微颗粒中除去可溶性试剂。其他偶联剂的例子包括二异丙基碳二亚胺、HBTU, HATU, HCTU, TBTU和PyBOP。其他添加剂的例子包括磺基-N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑和1-羟基-7-氮杂-苯并三唑。可以通过调节偶联剂的化学计量、反应时间或反应温度来控制酰胺交联的程度，并且可以通过例如傅里叶变换红外光谱(FT-1R)对其进行监测。共价交联的ELBL膜具有期望的性质，例如增加的稳定性。较高的稳定性允许在纳米颗粒、微颗粒、纳米囊、或微囊的制造中使用更加严酷的条件。严酷条件的例子包括高温、低温、制冷温度、高离心速度、高盐缓冲液、高pH缓冲液、低pH缓冲液、过滤和长期储存。制作聚电解质多层膜的一种方法包括在基底上沉积带相反电荷的化学物质的多个层。在一个实施方案中，至少一个层包含经设计的多肽。连续沉积的聚电解质具有相反的静电荷。在一个实施方案中，聚电解质的沉积包括将基底暴露于包含聚电解质的水溶液，其pH使聚电解质带有适于ELBL的静电荷。在另一些实施方案中，聚电解质在基底上的沉积通过连续喷洒带相反电荷的多肽的溶液来实现。而在另一些实施方案中，在基底上的沉积通过同时喷洒带相反电荷的聚电解质的溶液来实现。在形成多层膜的ELBL方法中，相邻层的相反电荷为组装提供驱动力。相对层中聚电解质是否带有相同的净线性电荷密度并不关键，只要相对层带有相反电荷即可。一种通过沉积作用进行的标准模组装程序包括在聚离子电离的PH(即，pH4-10)下形成聚离子的水溶液，提供具有表面电荷的基底，将基底交替浸没在带电的聚电解质溶液中。任选地，在交替层的沉积之间洗涤基底。本领域一般技术人员可以容易确定适于聚电解质沉积的聚电解质浓度。一个示例性浓度为0.1至10mg/mL。对于典型的非多肽聚电解质如聚(丙烯酸)和聚(烯丙胺盐酸
盐)，典型的层厚度为约3至约
权利要求
1.组合物，其包含来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位，其中所述第一和第二多肽表位与一种或更多种聚电解质共价连接，其中所述一种或更多种聚电解质在一个或更多个多层膜中，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，以及其中所述聚电解质包括分子量大于1，000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，以及其中所述来自RSV的第一多肽表位和所述来自RSV的第二多肽表位存在于同一多层膜或不同的多层膜中。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多层膜的至少一种聚电解质包含经设计的多肽，其中所述经设计的多肽具有足以与带相反电荷之表面稳定结合的电荷。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述经设计的多肽的长度为至少15个氨基酸，并且在中性PH下每残基的静电荷大于或等于O. 1，并且其中所述经设计的多肽包含所述来自RSV的第一多肽表位、所述来自RSV的第二多肽表位或二者。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位与所述来自RSV的第二多肽表位存在于单一聚电解质中并且在同一多层膜中。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位与所述来自RSV的第二多肽表位存在于不同的聚电解质中。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中包含所述来自RSV的第一多肽表位的第一聚电解质与包含所述来自RSV的第二多肽表位的第二聚电解质存在于同一多层膜中。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中包含所述来自RSV的第一多肽表位的第一聚电解质存在于第一多层膜中，以及包含所述来自RSV的第二多肽表位的聚电解质存在于第二多层膜中。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位引起特异性细胞毒性或辅助T细胞应答，以及所述来自RSV的第二多肽表位引起特异性抗体应答。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位为RSV-M2蛋白表位，以及所述来自RSV的第二多肽表位为RSV-G蛋白表位。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位包含SEQID NO:7,以及所述来自RSV的第二多肽表位包含SEQ IDNO :4。
11.根据权利要求8所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位为RSV-F蛋白表位，以及所述来自RSV的第二多肽表位为RSV-G蛋白表位。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述膜沉积在核心颗粒上。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多层膜为中空囊的形式。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述多层膜的两层或更多层共价交联。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述多层膜的两层或更多层通过酰胺键共价交联。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述多层膜的两层或更多层通过二硫键共价交联。
17.组合物，其包含来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位，其中所述第一多肽表位和第二多肽表位为一个或更多个多层膜的形式，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，并且其中所述多层膜的至少一种聚电解质包含经设计的多肽，其中所述经设计的多肽带有足以与带相反电荷之表面稳定结合的电荷，以及其中所述经设计的多肽包含所述来自RSV的第一多肽表位、所述来自RSV的第二多肽表位或二者，其中不是经设计之多肽的聚电解质包括分子量大于1，000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，以及其中所述来自RSV的第一多肽表位和所述来自RSV的第二多肽表位存在于同一多层膜或不同的多层膜中。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述经设计的多肽的长度至少为15个氨基酸，并且在中性pH下每残基的静电荷大于或等于O.1。
19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位与所述来自RSV的第二多肽表位存在于单一经设计的多肽中并且在同一多层膜中。
20.根据权利要求17所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位与所述来自RSV的第二多肽表位存在于不同的经设计的多肽中。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中包含所述来自RSV的第一多肽表位的第一经设计的多肽与包含所述来自RSV的第二多肽表位的第二经设计的多肽存在于同一多层膜中。
22.根据权利要求20所述的方法，其中包含所述来自RSV的第一多肽表位的第一经设计的多肽存在于第一多层膜中，以及包含所述来自RSV的第二多肽表位的第二经设计的多肽存在于第二多层膜中。
23.根据权利要求17所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位引起特异性细胞毒性或辅助T细胞应答，以及所述来自RSV的第二多肽表位引起特异性抗体应答。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位为RSV-M2蛋白表位，以及所述来自RSV的第二多肽表位为RSV-G蛋白表位。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位包含SEQIDNO :7，以及所述来自RSV的第二多肽表位包含SEQ IDNO :4。
26.根据权利要求17所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位为RSV-F蛋白表位，以及所述来自RSV的第二多肽表位为RSV-G蛋白表位。
27.根据权利要求17所述的组合物，其中所述膜沉积在核心颗粒上。
28.根据权利要求17所述的组合物，其中所述多层膜为中空囊的形式。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述多层膜的两层或更多层共价交联。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述多层膜的两层或更多层通过酰胺键共价 交联。
31.根据权利要求29所述的组合物，其中所述多层膜的两层或更多层通过二硫键共价交联。
32.组合物，其包含与一种或更多种聚电解质共价连接的RSV-G多肽表位，其中所述一种或更多种聚电解质在一个或更多个多层膜内，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，以及其中所述聚电解质包括分子量大于1，000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述RSV-G多肽表位包含SEQID NO :4。
34.向需要针对RSV进行免疫的个体施用权利要求1至33中任一项所述组合物的方法。
全文摘要
包含来自RSV之多肽表位的多层膜。所述多层膜在向宿主施用后能够在宿主体内引起免疫应答。所述多层膜包含至少一种经设计的肽，所述经设计的肽包含一种或更多种来自RSV的多肽表位。特别地，所述多层膜包含两种来自RSV的多肽表位，例如引起特异性T细胞应答如细胞毒性T细胞应答的表位，以及引起特异性抗体应答的表位。
文档编号A61K39/155GK103037898SQ201180033742
公开日2013年4月10日 申请日期2011年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者托马斯·J·鲍威尔, 詹姆斯·戈勒姆·博伊德 申请人:人工细胞科技公司