专利名称：内质蛋白的抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体领域，具体涉及特异性结合内质蛋白的完全人源性抗体(fullyhuman antibody)。
背景技术：
黑素瘤是攻击性的、频繁转移性肿瘤，其源自黑素细胞或黑素细胞相关的痣细胞("Cellular and Molecular Immunology"(1991) (eds.) Abbas A. K. , Lechtman, A.H. , Pober, J. S. ;ff. B. Saunders Company, Philadelphia:第 340-341 页)。黑素瘤占全部皮肤癌症的大约3%，在全世界妇女中黑素瘤的增加未被除肺癌外的任何其他的新生物所超过("Cellular and Molecular Immunology^(1991)(eds. ) Abbas, A. K. , Lechtiman, A.H. , Pober, J.S. ;ff. B. Saunders Company Philadelphia:第 340-342 页;Kirkwood andAgarwala(1993)Principles and Practice of0ncology7:1-16)。甚至当黑素瘤表面上局限于皮肤时，也有最高达30%的患者将发生全身转移，大多数将死亡(Kirkwood andAgarwala(1993)Principles and Practice of 0ncology7:1-16)。治疗黑素瘤的经典方式包括手术、辐射和化学疗法。在过去的十年中，免疫疗法和其他分子方法已经作为新的且有前景的治疗黑素瘤方法浮现出来。黑素瘤沉积物存在淋巴细胞，提供了有力证据表明在人体中存在癌症免疫反应。当被分离后，这些淋巴细胞能够以主要组织相容性复合体(MHC)-限制方式识别特异性的自身肿瘤抗原和同种异体的黑素瘤(Itoh et al. (1986)，CancerRes. 46:3011-3017;Muul et al. (1987),J.1mmuno1. 138:989-995) ;Topalianet a1. ( 1 9 8 9)J.1mmunol. 142 : 3714-3725;Darrow et a1. ( 1 989)J.1mmunol. 142:3329-3335;Horn et al. (1991)J. Tmmunother. 10:153-164;Kawakami etal. (1992) J.1mmunol. 148:638-643;Horn et al. (1993)J.1mmunother. 13:18-30;0'Neilet al. (1993) J.1mmunol. 151:1410-1418)。转移性黑素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在体外可识别共有的抗原，包括黑素细胞-黑素瘤系特异性组织抗原(Kawakami etal. (1993)J.1mmunother. 14:88-93;Anichini et al. (1993)J. Exp. Med. 177:989-998)。许多黑素瘤患者产生针对这些肿瘤的细胞和体液免疫反应以及黑素瘤表达MHC抗原和肿瘤相关抗原(TAA)的事实，暗示鉴定和表征额外的黑素瘤抗原对于免疫治疗黑素瘤患者将是重要的。但是，还需要新的方式来治疗黑素瘤和其他癌症。
发明内容
本文公开了特异性结合内质蛋白(Grp94)的分离的单克隆抗体以及这些抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中这些抗体是完全人源性抗体。这些抗体对人内质蛋白有高亲和力并可以用于治疗和/或诊断癌症。在一个实例中，所述单克隆抗体是scFv。在某些实施方案中，所公开的抗体可用于检测表达内质蛋白的肿瘤，例如黑素瘤、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。在其他实施方案中，所公开的抗体可用于治疗肿瘤，例如黑素瘤、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。本文还公开了编码这些抗体的重组核酸、包括这些核酸的表达载体和用这些表达载体转化过的宿主细胞。上述的以及其他的特征和优势通过以下几个实施方案的详细描述会更清楚，详细描述参照附图进行。
图1a.用人黑素瘤细胞系丽1158淘选噬菌体展示scFv文库。所述噬菌体展示scFv文库含有大量的有不同特异性的噬菌体展示scFv片段。将所述文库加入到含有WMl 158黑素瘤细胞悬液的管中。然后洗涤所述管以移除未结合的噬菌体，在高PH下洗脱结合的噬菌体并在细菌宿主大肠 杆菌TGl中扩增。然后进行三轮淘选，用培养的人LG2B淋巴样细胞吸收所分离的克隆以移除结合到人黑素瘤细胞和淋巴样细胞共有的抗原(Ag)的噬菌体。然后用WMl 158细胞通过ELISA (酶联免疫吸附测定)对所分离的噬菌体进行反应性筛选。图1b.通过用WMl 158细胞淘选噬菌体展示抗体文库而分离的scFv W9与所述黑素瘤细胞系丽1158和所述B淋巴样细胞系LG2的差异反应性。将丽1158细胞铺于96孔板并与scFv W9在室温孵育2小时。使用c-myc特异性mAb (单克隆抗体)9E10和HRP-链酶亲和素检测scFv的结合。识别无关抗原和LG2细胞的scFvll9被用作阴性对照。scFvW9特异性地与WMl 158细胞系反应。图2. scFv W9与多种类型人细胞系的反应性。6种黑素瘤细胞系、4种乳癌细胞系、头颈部鳞状细胞癌细胞系、3种胰腺癌细胞系、膀胱癌细胞系、肺癌细胞系、上皮癌细胞系、结肠癌细胞系、肾癌细胞系、前列腺癌细胞系和卵巢癌细胞系被铺于96孔板并与scFvW9在室温孵育2小时。使用c-myc特异性mAb9E10和HRP-链酶亲和素检测scFv的结合。scFv W9与所有黑素瘤细胞系、2种乳癌细胞系、头颈部鳞状细胞癌细胞系、胰腺癌细胞系、膀胱癌细胞系、肺癌细胞系、上皮癌细胞系、肾癌细胞系、卵巢癌细胞系和神经胶质瘤细胞系都有反应。图3a和3b.内质蛋白被鉴定为scFv W9识别的抗原。WM1158黑素瘤细胞裂解物与scFv W9进行免疫沉淀。使用I类HLA-特异性mAbTP25. 99和HMW-MAA特异性scFvC21作为对照。在还原性的10%SDS-PAGE上分辨所述沉淀物中的蛋白质并用考马斯蓝染色。94-KDa是所述W9沉淀所特有的(A)。从T24 (膀胱癌)、SUM149 (乳癌)和SLR21 (肾癌)细胞系的裂解物获得了相同的结果。从所述SDS凝胶切离所述特异性条带并通过质谱分析。在94-KDa条带中鉴别到的人蛋白为内质蛋白。图4.碳水化合物在scFv W9识别的决定簇的表达中的作用。将C0L038细胞在存在0. 5 ii g/ml衣霉素的情况下培养72小时。在只加入DMSO的培养基中孵育细胞并使用所述mAb TP25. 99作为对照。通过ELISA检验细胞与scFv W9的结合。细胞与scFv W9在4°C孵育2小时。使用mAb9E10和HRP-山羊抗小鼠IgG抗体检测scFv的结合。在450nm处读出吸光度，衣霉素处理诱导了 scFv W9与C0L038细胞的结合的强烈下降。因此，碳水化合物在scFv W9识别的决定簇的表达中起作用。图5a和5b. scFv W9对重组犬内质蛋白(Grp94)的反应性的特异性。将与人内质蛋白(Grp94)在氨基酸序列上显示98. 5%同源性的重组犬内质蛋白(Grp94)以20 y g/孔固定在96孔板中，并与scFv W9在室温孵育2小时。使用mAb9E10和HRP-山羊抗小鼠IgG抗体检测scFv的结合。在450nm处读出吸光度。scFvll9和BSA用作阴性对照。scFvW9识别在细胞I吴上表达的内质蛋白决定族。图6.重组犬内质蛋白(Grp94)对scFv W9与C0L038细胞结合的剂量依赖的抑制。两倍稀释的重组犬内质蛋白(Grp94)与scFv W9预孵育。将所述混合物加入到接种有C0L038细胞的96孔板。使用mAb9E10和HRP-山羊抗小鼠IgG抗体检测scFv的结合。在450nm处读出吸光度。B 2m用作对照。重组犬Grp94特异性抑制scFv W9与C0L038细胞
的结合。 图7a和7b.用内质蛋白(Grp94) cDNA转染293细胞对scFv W9结合的影响。用3u g Grp94HSP90BIcDNA克隆通过电穿孔转染293细胞。将细胞与scFv W9和mAb9E10孵育，然后与FITC-山羊抗小鼠IgG抗体孵育。通过流式细胞仪分析细胞。PCMV6-XL4载体被用作对照。未转染的细胞用作对照。电穿孔增加了 scFv W9的结合。被scFv识别的抗原的表达通过热休克调节。图8a和8b.用内质蛋白(Grp94) shRNA转导F0-1细胞对scFv W9结合的影响。用内质蛋白(Grp94) shRNA和对照shRNA(ABCB5)转导FO-1细胞。将细胞与scFv W9和mAb9E10孵育，然后与FITC-山羊抗小鼠IgG抗体孵育。然后通过流式细胞仪分析细胞。与对照shRNA相比，内质蛋白(Grp94) shRNA抑制scFv W9的结合。图9.碳水化合物在mAb W9识别的表位的表达中的作用。将人胰脏腺癌MIAPaCa-2 (5 X IO5)与或不与 2 y I 的 a -2 (3，6，8. 9)-神经氨酸酶在 50 u I RPMI1640 培养基中在5%C02恒温箱中于37°C下孵育24小时。然后将所述处理的细胞用mAb W9染色并通过流式细胞仪分析。用mAb TP25. 99处理的细胞作对照。图10.在人胰脏腺癌MIAPaCa-2癌起始细胞上被mAb W9识别的细胞外内质蛋白(Grp94)表位的表达。将人胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞与ALDEFLU0R孵育以检测ALDH活性(测试组)并用mAb W9染色。与ALDEFLUOR+DAEB抑制剂孵育并用mAb W9染色的细胞用作参考(对照)。人Ig(HIg)被用作对照。标明了癌起始细胞一被鉴定为ALDHfcight的细胞一的百分数。图11.通过mAb W9对手术移除的人胰脏腺癌癌灶进行免疫组织化学染色。用mAbW9 (I U g/ml)染色手术移除的人胰脏腺癌癌灶和来自同一患者的正常胰腺组织的冷冻切片。(X200)。图12.使用mAb W9对人基底型(basal)乳癌MDA_MB_231和人黑素瘤异种移植物MV3上的内质蛋白(Grp94)表达的IHC染色分析。用mAb W9 (5 u g/ml)染色福尔马林固定且石蜡包埋的人基底型乳癌MDA-MB-231细胞、人管腔型(luminal)乳癌MCF-7细胞和人黑素瘤异种移植物MV3 (X200)。用mAb W9进行的免疫组织化学染色显示MDA-MB-231细胞和MV3异种移植物被mAb W9 (5 u g/ml)强烈地染色。在MCF-7细胞中没有检测到染色。图13. mAb W9显著地抑制表达内质蛋白(Grp94)的肿瘤细胞的生长。将人癌细胞(I X IO4/孔)接种于96孔板(加入1%FCS的RPMI1640)并用mAb W9 (5 u g/ml)处理72小时。人Ig(HIg)用作对照。然后通过MTT测定检验细胞。结果表示为生长抑制百分数％。*p 值〈O. 05 ;**p 值〈O. 01。图14.癌细胞中mAb W9抗体诱导的细胞凋亡。分别使人MV3 (黑素瘤)细胞和MIAPaCa-2 (胰脏腺癌)细胞(4X105/ml)饥饿24小时和3小时，然后与mAb W9 (50 u g/ml)在含有1. 5%FCS的RPMI1640培养基中孵育。6小时后，调查细胞中膜联蛋白V/PI染色的凋亡细胞的百分数。通过流式细胞仪分析细胞。人Ig(HIg)用作阴性对照。图15.在人黑素瘤M21细胞中mAb W9抗体对裂解的PARP的诱导。将人黑素瘤M21 细胞(4 X105/ml)与 mAb W9 (5 u g/ml)在含有1. 5%FCS 的 RPMI1640 培养基中孵育 72小时。通过蛋白质印迹(Western blot)分析检验细胞裂解物中的裂解的PARP。P -肌动蛋白用作上样对照。mAb W9强烈地增加了裂解的PARP的表达。图16.在人黑素瘤MV3细胞中mAb W9抗体对裂解的胱天蛋白酶_3 (caspase-3)的诱导。使人黑素瘤MV3细胞(4X105/ml)饥饿24小时，然后与mAb W9 (50 u g/ml)在含有1. 5%FCS的RPMI1640培养基中孵育。通过Western blot检验细胞裂解物中的裂解的胱天蛋白酶-3。￠-肌动蛋白用作上样对照。用IMAGJ 软件测定结果条带的密度，与
肌动蛋白条带的密度进行归一化，显示在各自的条带下面。mAb W9强烈地增加了裂解的胱天蛋白酶-3的表达。在以HIg处理的细胞中没有检测到效果。图17.由mAb W9介导的对人黑素瘤MV3细胞的细胞依赖性裂解。将人黑素瘤MV3细胞用50iiCi的51Cr标记并以0.4X IO6个细胞/ml的密度重悬，与mAb W9 (50,10,2 u g/ml)在96孔组织培养-U型底-测定板中混合。人Ig(HIg)用作对照。在4°C孵育30分钟后，加入PBMC (40:1E:T)并在CO2恒温箱中于37 °C下孵育4小时。通过在Packard T0PC0UNT Microplate Scintillation Counter微板闪烁计数器中计数无细胞的上清测定51Cr的释放。图18.由mAb W9介导的人黑素瘤MV3细胞的补体依赖的裂解。将人黑素瘤MV3细胞用50 u Ci的51Cr标记并以I X IO6个细胞/ml的密度重悬。将所述靶细胞与mAb W9 (50、10、2 ii g/ml)在存在人血清补体的情况下孵育。人Ig(HIg)用作对照。在CO2恒温箱37°C孵育 2 小时后，通过在 Packard TopCount Microplate Scintillation Counter 微板闪烁计数器中计数无细胞的上清测定51Cr的释放。图19.mAb W9对人胰脏腺癌MIAPaCa-2癌起始细胞体外增殖的抑制。将人胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞与mAb W9 (25 y g/ml)在37°C孵育48小时。然后收获细胞并用AiDFmOR 染色(测试组)。用AO>EFlJJG_ +daeb染色的细胞用作参考(对照组)。人Ig(HIg)用作对照。标明了癌起始细胞一被 鉴定为ALDHtoight的细胞一的百分数。图20. mAb W9对胰腺MIAPaCa-2和PANCl细胞中信号途径RAS-MEK-ERK和FAK的抑制。将所述人胰腺MIAPaCa-2和PANCl细胞以每孔l.OX IO5个的浓度接种在6孔板的含5%FCS的RPMI1640培养基中，与所述W9上清或者所述对照上清或者不作处理在37°C孵育48 小时。用抗 RAS、C-Raf、磷酸化(p)-ERKI/2、ERKI/2、(p) -FAK(Tyr397)、FAK、P -连环蛋白、p-AKT(Ser473)和AKT的mAb通过蛋白质印迹检验细胞裂解物。钙联接蛋白和P _肌动蛋白用作上样对照。图21. mAb W9对人黑素瘤M21细胞中信号途径的抑制。将所述人黑素瘤M21细胞以每孔1. OX IO5个细胞的浓度接种在6孔板的含5%FCS的RPMI1640培养基中，与mAbW9 (5 u g/ml)孵育72 小时。用抗磷酸化(p)-AKT、Be1-2、C-Raf、(p)-ERKI/2、PKC a、@ -连环蛋白mAb通过蛋白质印迹检验细胞裂解物。人Ig(HIg)和PBS用作阴性对照。I丐联接蛋白用作上样对照。图22. mAb W9对人黑素瘤MV3细胞中信号途径的抑制。将人黑素瘤MV3细胞与mAbW9在37°C在RPMI1640中孵育6小时。然后制备细胞裂解物并用抗RAS、Met、p_Met、P -连环蛋白、Ras、C-RAF、p-AKT和p_ERKl/2、Thr202/Tyr204通过蛋白质印迹检验。P -肌动蛋白用作上样对照。与HIg孵育的细胞用作对照。图23.在用mAb W9处理的小鼠中已建立的肺转移的减少。静脉注射MV3黑素瘤细胞(每只小鼠1. 4X IO8个细胞)。15天后每48小时用mAb W9 (每只小鼠100 y g,静脉注射)处理小鼠。在第25天，处死小鼠，取肺，用福尔马林固定并用H&E染色以分析肿瘤区域。所示出的值为每组的平均肿瘤面积。**指示P值〈O. 01。图24.化学治疗剂对UACC-257黑素瘤细胞的内质蛋白(Grp94)表达的增强。将人黑素瘤 UACC-257 细胞(2 X105/ml)在含有 10%FCS、5_FU (300 y M)、顺钼(IOuM)和紫杉醇(20nM)的RPMI1640培养基中 孵育48小时。收获细胞，用mAb W9染色并通过流式细胞仪分析。未处理的细胞用作对照。示出了染色细胞的百分数和平均荧光强度(MFI)。图25a和25b. mAb W9与5-FU和环巴胺(cyclopamine)的组合对人胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞增殖的抑制。将人胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞(每孔2. 5 X IO3个细胞)接种在96孔板(加入5%FCS的RPMI1640培养基)，在37°C下和5%C02气氛中，用mAb W9 (5 u g/ml)与 5-FU(10iiM) (A.)，或mAb W9 (5 u g/ml)与环巴胺(20 u M) (B.)的组合处理 1、2、3 天。然后通过MTT测定检验细胞。540nm处的0. D.值指示活细胞。图26. mAb W9与5_FU和环巴胺的组合对人胰脏腺癌MIAPaCa-2癌起始细胞体外增殖的抑制。将人胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞与mAb W9 (25 y g/ml)、环巴胺(20 y M)和5-FU(IOiiM)在37°C孵育48小时。然后用含或不含DEAB抑制剂的ALDEFLU0R染色细胞，以鉴定ALDHblright细胞。抗I类HLA mAb TP25.99用作对照。标明了癌起始细胞——被鉴定为ALDHfcight的细胞一的百分数。图27. mAb W9与5_FU和环巴胺的组合对胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞凋亡的诱导。使人胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞(4X105/ml)饥饿3小时，然后与mAb W9 (10 y g/ml)、环巴胺(20 u M)和5-FU(10 u M)在含有1. 5%FCS的RPMI1640培养基中孵育。24小时后，调查细胞中膜联蛋白V/PI染色的凋亡细胞的百分数。通过流式细胞仪分析细胞。HIg用作阴性对照。图28a和28b. mAb W9与辐射和环巴胺的组合对人胰脏腺癌MIAPaCa-2癌起始细胞体外增殖的抑制。以20Gy的剂量辐射人胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞(4X 105/ml)(图A)，并与mAb W9 (10 u g/ml)和环巴胺(20 y M)在37°C孵育72小时。然后用含或不含DEAB抑制剂的ALDEFLUOR染色细胞，以鉴定ALDHtoight细胞。未受辐射的细胞用作对照(图B)。标明了癌起始细胞一被鉴定为ALDHfcight的细胞一的百分数。 图29. mAb W9与辐射和环巴胺的组合对胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞凋亡的诱导。以20Gy的剂量辐射人胰脏腺癌MiaPaCa-2细胞(4X 105/ml)，并与mAb W9 (20 u g/ml)和环巴胺(20yM)孵育。8小时后，检验细胞中膜联蛋白V/PI染色的凋亡细胞的百分数。通过流式细胞仪分析细胞。未受辐射的细胞和人Ig(HIg)用作对照。图30. mAb W9与5_FU和环巴胺的组合对人胰脏腺癌MIAPaCa_2细胞中信号途径的抑制。将人胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞与mAb W9、环巴胺(20 y M)和5_FU(10iiM)在37°C孵育2天(图D)。然后制备细胞裂解物并用抗RAS、C-Raf、磷酸化(p)-MEK(Ser217/221)、MEK、pERK(Thr202/Tyr204)、ERK、p_AKT(Ser473)、AKT 的 mAb 通过蛋白质印迹测试。钙联接蛋白用作上样对照。用单独的mAb W9 (图A)，用mAb W9和环巴胺(图B)以及用mAb W9和5-FU (图C)孵育的细胞用作对照。图31. mAb W9与辐射和环巴胺的组合对人胰脏腺癌MIAPaCa_2细胞中信号途径的抑制。以20Gy的剂量辐射人胰脏腺癌MIAPaCa-2细胞，并与mAb W9 (10 u g/ml)和环巴胺(20 u M)在37°C孵育48小时。然后制备细胞裂解物并用抗RAS、磷酸化(p)-ERK(Thr202/Tyr204)、ERK、p-AKT(Ser473)、AKT、SHh、GLIl的mAb通过蛋白质印迹测试。钙联接蛋白用作上样对照，钙联接蛋白和￠-肌动蛋白用作上样对照。序列表在随附的序列表中使用37C. F. R.1. 822定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码示出了核酸和氨基酸序列。每条核酸序列仅示出一条链，但是应认为通过任何对所示链的引用而将其互补链包括在内。所述序列表已作为ASCII文本文件[Sequence_Listing , txt, Junel5, 2011, 19. 4KB]提交，其以引用的方式纳入本文。SEQ ID NO:1是特异性结合内质蛋白的抗体重链的氨基酸序列。SEQ ID N0:2是特异性结合内质蛋白的抗体轻链的氨基酸序列。SEQ ID N0:3是编码特异性结合内质蛋白的抗体重链的核酸序列。SEQ ID N0:4是特异性结合内质蛋白的抗体轻链的核酸序列。SEQ ID N0:5是人内质蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:6是编码人内质蛋白的核酸序列。SEQ ID N0:7和8是内质蛋白多肽的氨基酸序列。
具体实施例方式I 缩写5-FU :氟尿嘧啶ADCC :抗体依赖的细胞介导的细胞毒性Ag :抗原ALDHbright :醛脱氢酶(bright)膜联蛋白V :膜联蛋白A5￠-连环蛋白钙粘蛋白相关的蛋白
B-Raf 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶B-RafCDC :补体介导的细胞毒性⑶R :互补决定区C-Raf =RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸_蛋白激酶DEAB :4- (二乙氨基)苯甲醛DMEM :达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基ER:内质网ERKI/2 :细胞外信号调节的激酶1/2FAK :粘着斑激酶 FBS :胎牛血清FR :框架区GLIl :神经胶质瘤-相关的癌基因同系物IGrp :葡萄糖调节的蛋白Gy :戈瑞(焦耳/千克)HRP :辣根过氧化物酶Ig:免疫球蛋白mAb :单克隆抗体MEK:促分裂原活化蛋白激酶激酶Met C-Met0. D.:光密度PBS :磷酸缓冲盐水p-ERKI/2 :磷酸化的细胞外信号调节的激酶1/2p-FAK :磷酸化的粘着斑激酶P1:碘化丙啶RAS:大鼠肉瘤scFv VH和\两者的单链可变区SHH :皮卡丘素(Sonic hedgehog homolog)Vh :重链可变区Vl :轻链可变区I1.术语除非另有说明，根据惯例用法使用技术术语。分子生物学常见术语的定义可以见于 Benjamin Lewin, Genes V,published by Oxford University Press,1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of MolecularBiology, published by Blackwell Science Ltd.，1994(ISBN0-632-02182-9);和RobertA. Meyers(ed. ), Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference, published by VCH Publishers,Inc.，1995 (ISBN1-56081-569-8)。为帮助理解本公开内容的各个实施方案，提供了如下的具体术语解释抗体至少包括可特异性识别并特异性结合抗原(例如内质蛋白或其片段)表位的轻链或重链免疫球蛋白可变区域的多肽配体。抗体由重链和轻链组成，所述重链和轻链每个均具有可变区域，称作重链可变区(Vh)和轻链可变区(')。一起地，所述Vh区和'区负责结合被抗体识别的抗原。抗体包括完整免疫球蛋白和变体。可特异性结合抗原例如内质蛋白的抗体的功能片段(抗原结合片段)在本领域是已知的，例如可特异性结合靶抗原的Fab片段、Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫化物稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合，同时在dsFv中，所述链已被突变以引入二硫键来稳定所述链的缔合。所述术语还包括基因工程形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异缀合抗体(例如双特异性抗体)。还见于，Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995(Pierce Chemical Co. , Rockford, IL);Kuby, J.
,Immunology, 3rd Ed. , ff. H. Freeman & Co. , New York, 1997。功能性片段还称为“抗原结合”片段，因为它们特异性结合所述靶抗原，例如人内质蛋白。一般地，天然产生的免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，lambda( A )和kappa( k )。有5种决定抗体分子功能活性的主要的重链类别(或同种型)IgM, IgD, IgG, IgA和IgE。每个重链和轻链含有恒定区和可变区，(所述区也称为“域”)。组合地，所述重链和轻链的可变区特异性结合抗原。轻链和重链的可变区含有被3个高变区(也称为“互补决定区”或“⑶R”)间隔的“框架”区。框架区和⑶R的范围已经确定(参见，Kabat etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Healthand Human Services, 1991,在此以引用的方式纳入本文)。现在Kabat数据库是在线维护的，⑶R序列可以确定，例如参见IMGT/V-QUEST程序版本3. 2. 18. , March29, 2011，可从因特网和 fcochet，X. et al. , Nucl. Acids Res. 36，W503-508，2008 获得。不同轻链或重链的框架区的序列在同一物种例如人内是相对保守的。抗体的框架区一所述组成的轻链和重链的结合框架区——用于在三维空间中安铬并排列所述CDR。
⑶R主要负责结合抗原表位。每条链的⑶R —般称为⑶R1XDR2和⑶R3，从N-末端开始顺序编号，并且一般还通过所述具体的⑶R所在的链来鉴定。因此，VH⑶R3位于具有该结构的抗体的重链可变区，然而' CDRl是来自具有该结构的抗体的轻链可变区的CDRl。结合内质蛋白的抗体通常具有特异性的Vh区和\区序列，因此也具有特异性的⑶R序列。有不同特异性的抗体(即对不同抗原有不同结合位点)具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间的CDR不同，但是在所述CDR内只有有限数量的氨基酸位铬直接参与抗原结合。CDR内的这些位铬被称为特异性决定残基(SDR)。111”或“^’是指免疫球蛋白重链的可变区，包括？￥、80 ￥、(18 ￥或？&&的可变区。“八”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或其中转染有单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造杂合的抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化的单克隆抗体。“嵌合抗体”具有来自一个物种例如人的框架残基和来自另一物种的CDR (通常赋予抗原结合)，例如特异性结合内质蛋白的鼠抗体。“人”抗体(也称为“完全人源性”抗体)是包括人框架区和人免疫球蛋白的全部⑶R的抗体。在一个实例中，所述框架和所述CDR是源自于相同的人重链和/或轻链氨基酸序列。但是，可以设计来自一个人抗体的框架以包括来自不同的人抗体的CDR。“人源化”的免疫球蛋白是包括人框架区和一个或多个来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方案中，在一个人源化免疫球蛋白中，全部CDR均是来自于供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但是如果它们存在，则它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即具有至少约85-90% (例如约95%或更高)的同一性。因此，可能除所述⑶R之外，人源化免疫球蛋白的所有部分均与天然人免疫球蛋白序列的对应部分基本相同的。“人源化”抗体是包括人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体结合的抗原与提供CDR的供体抗体结合的抗原相同。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可能有有限数量的氨基酸被取自供体框架的氨基酸取代。人源化的或其他的单克隆抗体可以具有对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本没有影响的额外的保守性氨基酸取代。人源化免疫球蛋白可以通过基因工程的方式构建(例如参见，美国专利No. 5，585，089)。抗原在动物中可以刺激抗体产生或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到动物内的组合物。抗原与特异性体液或细胞免疫产物反应，包括由异源性免疫原诱导的那些。一种示例性的抗原是内质蛋白。术语“抗原”包括全部相关的抗原表位。“表位”或“抗原决定簇”是指与B细胞和/或T细胞反应的抗原上的位点。表位可以由连续的氨基酸或由通过蛋白质三级折叠紧靠的非连续的氨基酸而形成。由连续的氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时一般会保留，然而通过三级折叠形成的表位在以变性溶剂处理时一般会丢失。在单一空间构象中表位一般包括至少3个，更通常至少5个或8-10个氨基酸。测定表位空间构象的方法包括，例如X-射线结晶学和二维核磁共振。抗原可以是组 织特异性抗原或疾病特异性抗原。这些术语不是排他的，因为组织特异性抗原也可以是疾病特异性抗原。组织特异性抗原在有限数量的组织例如单一组织中表达。组织特异性抗原的具体非限制性实例为黑素瘤特异性抗原或神经胶质瘤、乳、肺、前列腺、肾或膀胱特异性抗原。疾病特异性抗原在疾病过程例如黑素瘤或其他类型的癌症的同时表达。疾病特异性抗原的具体非限制性实例为其表达与肿瘤形成相关或者是肿瘤形成的预兆的抗原，所述肿瘤例如黑素瘤和/或神经胶质瘤和/或其他类型的癌症(例如内质蛋白)。疾病特异性抗原可以是被T细胞或B细胞识别的抗原。扩增核酸分子(例如DNA或RNA分子)的扩增是指可增加样本内核酸分子拷贝数的技术的使用。扩增的一个实例是聚合酶链式反应，在其中从受试者收集的生物样品与一对寡核苷酸引物，在允许所述引物与所述样品中核酸模板杂交的条件下接触。所述引物在适合的条件下延伸，从所述模板分离，然后再退火、延伸、分离以增加所述核酸的拷贝数。所述扩增的产物可以使用标准技术通过电泳、限制性核酸内切酶切割带型、寡核苷酸杂交或连接、和/或核酸测序来表征，扩增的其他实例包括美国专利No. 5，744，311公开的链铬换扩增；美国专利No. 6，033，881公开的无转录等温扩增；W090/01069公开的修复链反应扩增；EP-A-320308公开的连接酶链反应扩增；美国专利No. 5，427，930公开的填隙连接酶链反应扩增；和美国专利No. 6，025，134公开的NASBA RNA无转录扩增。动物活的多细胞脊椎生物，一个包括例如哺乳动物和鸟类的种类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物，包括非人的灵长类。类似地，术语“受试者”包括人以及兽医的受试者。结合亲和力抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，亲和力是通过由Frankelet al. , Mol.1mmunol. , 16:101-106, 1979描述的Scatchard方法的修改方法来计算的。在另一个实施方案中，结合亲和力是通过抗原/抗体离解速率测量的。在另一个实施方案中，高的结合亲和力是通过竞争性放射免疫测定来测量的。在另一个实施方案中，结合亲和力是通过ELISA测量的。抗体以高亲和力“特异性结合”抗原例如内质蛋白，并且不会明显地结合其他无关抗原。乳癌乳房组织的良性或恶性瘤病症。乳癌最常见的类型是导管癌。原位导管癌是导管的非侵袭性的瘤病症。小叶癌不是侵袭性的疾病，但其是可能发展癌的指示。乳房的浸润癌(恶性)可分为几个阶段(1、IIA、IIB、IIIA、IIIB和IV)。化学治疗剂在可由异常细胞生长表征的疾病治疗中有治疗用途的任何化学试剂。这样的疾病包括肿瘤、瘤(neoplasm)和癌症以及通过增生性生长而表征的疾病例如银屑病。在某些实施方案中，化学治疗剂是用于治疗乳癌、黑素瘤和/或神经胶质瘤的试剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是放射性化合物。本领域技术人员可以容易地鉴定可用的化学治疗剂(例如参见Slapak and Kufe, Principles ofCancer Therapy, Chapter86in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14thedition;Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17in Abeloff, Clinical 0ncology2nded. , 0 2000Churchill Livingstone, Inc;Baltzer L,Berkery R(eds): OncologyPocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed.St.Louis, Mosby-Year Book,1995;FischerDS,Knobf MF, Durivage HJ(eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed.St.Louis, Mosby-Year Book, 1993)。联合化疗是给予受试者多于一种试剂以治疗癌症，例如将特异性结合内质蛋白的抗体与放射性或化学化合物联合给予受试者。嵌合抗体包括源于两种不同抗体一一般属于不同物种一的序列的抗体。最典型地，嵌合抗体包括人和鼠抗体结构域，通常人恒定区和鼠可变区、鼠CDR和/或鼠SDR。
cDNA (互补DNA):缺少内部的非编码部分(内含子)以及决定转录的调节序列的一段DNA。实验室中通过从细胞中提取的信使RNA的反转录来合成cDNA。化学治疗剂在可由异常细胞生长表征的疾病治疗中有治疗用途的试剂(例如抗瘤试剂)。这样的疾病包括肿瘤、瘤和癌症以及通过增生性生长而表征的疾病例如银屑病。在一个实施方案中，化学治疗剂是用于治疗瘤例如实体瘤的试剂。化学治疗剂可以是蛋白质或非蛋白质试剂，例如小分子药物、抗体、肽、蛋白质和免疫调节剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是放射性分子。本领域技术人员可以容易地鉴定化学治疗剂(例如参见 Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter86in Harrison'sPrinciples of Internal Medicine, 14th edition;Perry et al. , Chemotherapy, Ch. 17inAbeloff,Clinical Oncology2nd ed. , 2000Churchill Livingstone, Inc;BaltzerL,Berkery R(eds) : Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St.Louis,Mosby-Year Book, 1995;Fischer DS,Knobf MF, Durivage HJ(eds):The CancerChemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993)。保守性变体“保守性”氨基酸取代是基本不影响或降低抗体特异性结合内质蛋白的亲和力的那些取代。例如，特异性结合内质蛋白的人抗体可以包括最多约I个、最多约2个、最多约5个、最多约10个或最多约15个的保守性取代并且特异性结合原始的内质蛋白多肽。术语保守性变化还包括取代的氨基酸代替未被取代的原来的氨基酸的用途，条件是抗体特异性结合内质蛋白。非保守性取代是那些减少结合到内质蛋白的活性的取代。提供功能相似的氨基酸的保守性氨基酸取代表是本领域普通技术人员已知的。如下6组是被认为互相是保守性取代的氨基酸的实例1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。互补决定区(CDR):共同限定天然Ig结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。Ig的轻链和重链各有3个⑶R，分别命名为L-⑶Rl、L-⑶R2、L-⑶R3和H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3。接触以直接物理联系放铬；包括固体和液体形式。细胞毒性分子例如免疫毒素对意在被靶向的细胞的毒性，与生物体的其余细胞相反。相反地，在一个实施方案中，术语“毒性”是指免疫毒素对意图被所述免疫毒素的靶向部分打靶的那些细胞除外的细胞的毒性，术语“动物毒性”是指免疫毒素对动物的毒性，这是通过免疫毒素对意图被免疫毒素打靶的细胞除外的细胞的毒性而实现的。简并变体编码内质蛋白多肽的多核苷酸,其包括由于遗传密码的简并性产生的序列。有20种天然氨基酸，其大多数被多于一个密码子编码。因此，所有简并核酸序列被包括在本公开内容内，只要由所述核酸序列编码的内质蛋白多肽的氨基酸序列没有改变。诊断鉴定病理状况例如但不限于黑素瘤、卵巢癌、乳癌或神经胶质瘤的存在或性质。诊断方法在其灵敏度和特异性上不同。诊断测定的“灵敏度”是测试呈阳性的患病个体的百分数(真阳性的百分数)。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中假阳性率定义为测试呈阳性但没有疾病的那些个体的比例。虽然某一具体的诊断方法可能不能提供对病症的明确诊断，如果所述方法提供有助于诊断的阳性指示就足够了。“预后性症状”是病理状况例如癌症或转移发展(例如严重度)的可能性。效应分子意在对嵌合分子靶向的细胞产生合乎需要的效果的嵌合分子的部分。效应分子也称为效应部分(EM)、治疗性试剂或诊断试剂或类似的术语。治疗性试剂包括化合物例如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂质、碳水化合物或重组病毒。核酸治疗性和诊断的部分包括反义核酸、与单链或双链DNA共价交联的衍生寡核苷酸、和三链形成寡核苷酸。或者，连接到靶向部分例如抗内质蛋白抗体的的分子可以是包裹系统例如脂质体或微团，所述脂质体或微团含有治疗性组合物例如药物、核酸(例如反义核酸)或可以被保护以免直接暴露于循环系统的另一个治疗性部分。制备附着于抗体的脂质体的方法是本领域技术人员已知的(例如参见美国专利No. 4，957，735 ;和 Connor etal.，Pharm. Ther. 28:341-365，1985)。诊断试剂或部分包括放射性同位素和其他可检测标记。可用于此目的的可检测标记也是本领域已知的，包括放射性同位素例如 35S、nC、13N、150、18F、19F、99mTc、1311、3H、14C、15N、9°Y、99Tc、mIn 和 1251、荧光团、化学发光试剂和酶。表位抗原决定簇。这些是分子上具体的化学基团或肽序列，其具有抗原性，即其能诱发特异性免疫反应。抗体特异性结合多肽上具体的抗原表位。表位可以从连续的氨基酸或从通过蛋白质三级折叠紧靠的非连续的氨基酸而形成。由连续的氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时一般会保留，然而通过三级折叠形成的表位在以变性溶剂处理时一般会丢失。在单一空间构象中表位一般包括至少3个，更通常至少5个或8-10个氨基酸。测定表位空间构象的方法包括，例如X-射线结晶学和二维核磁共振。参见,例如Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)。表位可以是糖基化的。因此，抗体可以特异性结合糖基化形式(或非糖基化形式)的蛋白质。内质蛋白一种还被称为葡萄糖调节的蛋白(Grp)94(Grp94)的蛋白质，其是热休克蛋白90(Hsp90)家族的内质网(ER)驻留成员。在体内，hsp90和内质蛋白与客户蛋白质相互作用，并发挥作用以保护它们免遭泛素依赖性蛋白酶体降解。虽然所述内质蛋白在所有细胞类型中组成型表达，但是在包括低葡萄糖水平、低细胞外pH、突变蛋白表达和病毒感染在内的多种应激条件下，其表达被上调。热休克蛋白具有细胞保护功能，并直接或间接地调节细胞凋亡。已经证实在包括肝细胞癌、结肠直肠癌和肺癌细胞在内的肿瘤细胞中内质蛋白的细胞表面表达增加，并且内质蛋白对某些肿瘤细胞具有抗凋亡效果。此外，当慢性乙肝病毒(HBV)感染进展到肝硬化和肝细胞癌(HCC)时，观察到内质蛋白的水平增加。已经研究了Hsp90和内质蛋白的抑制剂(例如格尔德霉素(GA)和其低毒衍生物17-AAG)在癌症治疗中的效力。示例性的编码内质蛋白(Grp94)的核酸包括但不限于GENBANK 登录号No. NM_003299、No. BC066656(智人)；No. NM_011631 (小鼠)；No. NM_001045763:(热带非洲爪蟾(Silurana)) ;No. NM_214103 (野猪)；No. NM_98210 (斑马鱼)；No. NM_001012197 (褐鼠);No.NM_001134101:苏门答 腊猩猩；No. NM_001003327 (家犬)热休克蛋白9OkDa ^ (GrpM) ；No. NM_204289 (原鸡)。表达调控序列调节与其可操作地连接的异源核酸序列表达的核酸序列。当表达调控序列控制并调节核酸序列的转录(对其翻译的控制和调节视情况而定)时，表达调控序列与所述核酸序列是可操作地连接的。因此，表达调控序列可以包括适当的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白编码基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子剪接信号、使mRNA正确翻译的对所述基因正确读码框的维护、以及终止密码子。术语“调控序列”意图包括其存在可以影响表达的最少的组分，并且还可以包括其存在有利的额外组分，例如前导序列和融合伴侣序列。表达调控序列可以包括启动子。启动子是足以指导转录的最小序列。还包括那些足以使启动子依赖的基因表达具有可控的细胞类型特异性、组织特异性、或者可被外部信号或试剂诱导的启动子元件，所述元件可以位于所述基因的5’或3’区域。组成型的和可诱导的启动子都包括在内(参见例如 Bitter et al. , Methods in Enzymologyl53:516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用可诱导的启动子例如细菌曬菌体\的pL、plac、ptrp、ptac (ptrp-lac杂合启动子)等。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒后期启动子；牛痘病毒7. 5K启动子)。通过重组DNA或合成技术产生的启动子也可以用于使核酸序列转录。表达调控序列调节与其可操作地连接的异源核酸序列表达的核酸序列。当表达调控序列控制并调节核酸序列的转录(对其翻译的控制和调节视情况而定)时，表达调控序列与所述核酸序列是可操作地连接的。因此，表达调控序列可以包括适当的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白编码基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子剪接信号、使mRNA正确翻译的对所述基因正确读码框的维护以及终止密码子。术语“调控序列”意图包括其存在可以影响表达的最少的组分，并且还可以包括其存在有利的额外组分，例如前导序列和融合伴侣序列。表达调控序列可以包括启动子。启动子是足以指导转录的最小序列。还包括那些足以使启动子依赖的基因表达具有可控的细胞类型特异性、组织特异性、或者可被外部信号或试剂诱导的启动子元件，所述元件可以位于所述基因的5’或3’区域。组成型的和可诱导的启动子都包括在内(参见例如 Bitter et al. , Methods in Enzymologyl53:516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用可诱导的启动子例如细菌曬菌体\的pL、plac、ptrp、ptac (ptrp-lac杂合启动子)等。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒后期启动子；牛痘病毒7. 5K启动子)。通过重组DNA或合成技术产生的启动子也可以用于使核酸序列转录。表达由核酸到蛋白质的翻译。蛋白质可以表达并留在细胞内，称为细胞表面I吴的组分，或者被分泌到细胞外基质或介质中。框架区插入⑶R之间的氨基酸序列。框架区包括轻链可变框架区和重链可变框架区。框架区用来使CDR保持适当的方向以结合抗原。神经胶质瘤在任何发育阶段都由神经胶质组成的肿瘤。神经胶质瘤包括脑和脊髓的所有内在的瘤，例 如星形细胞瘤、室管膜瘤和少突神经胶质瘤。“低级别”神经胶质瘤是分化良好的(非退行发育);这些是良性的，意味着患者有更好的预后。“高级别”神经胶质瘤是未分化的或退行发育的；这些是恶性的，有更坏的预后。糖基化碳水化合物共价附着到蛋白质例如抗原。糖基化包括N-连接的糖基化、0-连接的糖基化和C-连接的糖基化。HAMA (人抗鼠抗体)反应人受试者中对已经给予其的鼠抗体可变区和恒定区的免疫反应。重复的抗体给药可能导致所述抗体从患者血清中清除的速率增加，还可能引起患者的过敏反应。宿主细胞载体可在其中增殖并表达其DNA的细胞。所述细胞可以是原核的或真核的。该术语还包括任何受试者宿主细胞的子代。应该理解不是所有子代都与亲代细胞相同，因为在复制期间可能有突变发生。但是，当使用术语“宿主细胞”时，这样的子代被包括在内。免疫反应免疫系统的细胞例如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激的反应。在一个实施方案中，所述反应对具体抗原是特异性的(“抗原特异性反应”)。在一个实施方案中，免疫反应是T细胞反应,例如CD4+反应或CD8+反应。在另一个实施方案中，所述反应是B细胞反应，导致特异性抗体的产生。
免疫缀合物效应分子与特异性结合目标抗原(例如人内质蛋白)的抗体或其功能片段的共价连接。所述效应分子可以是可检测标记、免疫毒素、细胞因子或趋化因子。毒素的具体非限制性实例包括但不限于相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE，例如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或其修饰的毒素，或其他直接或间接抑制细胞生长或杀死细胞的有毒试剂。例如，PE和DT是高毒化合物，一般通过肝脏毒性引起死亡。但是，通过移除所述PE和DT毒素的天然靶向组分(例如PE的域Ia和DT的B链)并将其用另外的靶向组分例如抗体代替，所述PE和DT可以被修饰为可用作免疫毒素的形式。“嵌合分子”是缀合(偶联)到效应分子的靶向部分例如配体或抗体。所述术语“缀合”或“连接”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子。在一个实施方案中，抗体被接合到效应分子。在另一个实施方案中，接合到效应分子的抗体进一步被接合到脂质或其他分子形成蛋白质或肽以增加其在体内的半衰期。所述连接可以通过化学或重组的方式。在一个实施方案中，所述连接是化学的，其中所述抗体部分和所述效应分子之间的反应产生在所述两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。肽接头(短肽序列)可以可选地被包括在所述抗体和所述效应分子之间。因为免疫缀合物起初是由两个有独立功能的分子例如抗体和效应分子制备的，所以它们有时也称为“嵌合分子”。本文使用的所述术语“嵌合分子”因此是指缀合(偶联)到效应分子的靶向部分例如配体或抗体。免疫原性肽一种肽， 其包括等位基因特异性基序或其他序列例如N-末端重复以使得所述肽可结合MHC分子并诱导针对抗原(所述免疫原性肽从其中得到)的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应或B细胞反应(例如抗体产生)。在一个实施方案中，使用本领域已知的序列基序或其他方法例如神经网络或多项式测定来鉴定免疫原性肽。一般地，使用算法来确定肽的“结合阈值”以选择那些具有某些分数的肽，所述分数给予其以特定亲和力结合的高概率并且在该分数时其是免疫原性的。所述算法基于具体位铬的具体氨基酸对MHC结合的影响、具体位铬的具体氨基酸对抗体结合的影响或在含有基序的肽中具体的取代对结合的影响。在免疫原性肽的序列中，“保守性残基”是在肽中的具体位铬以显著高于随机分布预期的频率出现的残基。在一个实施方案中，保守性残基是所述MHC结构可以提供与所述免疫原性肽接触的点的地方。在一个具体非限制性实例中，免疫原性多肽包括内质蛋白的区域或其片段，其中所述多肽在表达所述全长内质蛋白多肽的宿主细胞的细胞表面表达。免疫原性组合物一种包括多肽例如内质蛋白多肽的组合物，其可诱导针对表达内质蛋白多肽的细胞的可测量CTL反应，或诱导针对内质蛋白多肽的可测量的B细胞反应(例如抗体的产生)。免疫原性组合物还可以诱导细胞因子产生。其还指分离的编码内质蛋白多肽的核酸，其可用于表达所述内质蛋白多肽(因此可用于激发针对该多肽的免疫反应)。对体外使用，免疫原性组合物可由所分离的蛋白质或肽表位组成。对体内使用，所述免疫原性组合物一般包括在可药用载体和/或其他试剂中的所述蛋白质或免疫原性肽。通过本领域认可的测定，可以容易地测试任何具体的肽例如内质蛋白多肽或编码所述多肽的核酸诱导CTL或B细胞反应的能力。免疫原性组合物可以包括佐剂，其对本领域技术人员是已知的。免疫反应条件包括参考的条件，该条件允许针对具体表位产生的抗体结合到那个表位的程度可检测地比结合到基本上全部其他表位的程度更大，和/或基本上排除结合全部其他表位。免疫反应条件依赖于所述抗体结合反应的形式，一般是在免疫测定方法中使用或体内遇到的那些条件。参见Harlow & Lane (见上文)，对免疫测定形式和条件的描述。所述方法中采用的免疫反应条件是“生理条件”，其包括参考的条件(例如温度、渗透性和PH)，该条件在活的哺乳动物或哺乳动物细胞内是典型的。虽然应该承认某些器官处在极端条件下，但生物体内和细胞内环境正常地为PH7左右(即从pH6. 0到pH8. 0，更典型地PH6. 5-7. 5)，含有水作为主要溶剂，并且以0°C以上50°C以下的温度存在。渗透性在可支持细胞生活和增殖的范围内。分离的“分离的”生物组分，例如核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞器，已经与所述组分天然存在的环境(例如细胞)中的其他生物组分(即其他染色体和额外染色体DNA以及RNA、蛋白质和细胞器)基本分开或被纯化。已经“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包含通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。标记直接或间接缀合到另一分子(例如抗体或蛋白质)以帮助检测该分子的可检测的化合物或组合物。标记的具体非限制性实例包括荧光标签、酶的连接和放射性同位素。在一个实例中，“标记的抗体”是指另一分子掺入到所述抗体。例如，所述标记是可检测的标示物，例如掺入放射性标记的氨基酸或附着到可通过标记的抗生物素蛋白检测的生物素基多肽(例如可以通过光学或比色方法检测的含有荧光标示物或酶活性的链霉亲和素)。标记多肽和糖蛋白的多种方法在本领域是已知的并可以被使用。可用于多肽的标记的实例包括但不限于放射性同位素或放射性核苷酸(例如35S、nC、13N、150、18F、19F、99mTc、1311、3H、14C、15N、9°Y、99Tc、mIn和1251)、荧光标记物(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、稀土荧光体(lanthanide phosphor))、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、P _半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标示物、生物素基团、被二级指示剂识别的预定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合域、表位标签)或磁性试剂例如钆螯合物。在某些实施方案中，标记被多种长度的间隔臂附着以减少可能的空间位阻。接头在某些情况中，接头是在抗体结合片段(例如Fv片段)内的肽，其用于间接地使重链可变区与轻链可变区连结起来 。“接头”还可以是指用于将靶向部分例如抗体连接到效应分子例如细胞毒素或可检测标记的肽。术语“缀合”、“接合”、“键合”或“连接”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子，或将放射性核素或其他分子共价地附着到多肽例如scFv。在具体上下文中，该术语包括参考将配体例如抗体部分接合到效应分子。所述连接可以通过化学或重组的方式。“化学方式”是指所述抗体部分和所述效应分子之间的反应使得在所述两个分子之间形成共价键以形成一个分子。哺乳动物该术语包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人以及兽医的受试者。主要组织相容性复合体(MHC):—般指定的意思包含在不同物种中描述的组织相容性抗原系统，包括人白细胞抗原(“HLA”)。术语“基序”是指具有确定长度(通常约8到约11个氨基酸)的肽内的残基结构，，其被具体的MHC等位基因识别。对应于每个MHC等位基因的妝基序一般不同，并且其在闻度保守性残基和负结合残基的结构内有差别。黑素瘤起源于黑素细胞(产生黑素的细胞)的癌症形式。黑素细胞主要在皮肤被发现，但还存在于肠和眼睛。皮肤中的黑素瘤包括浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、肢端黑素瘤和恶性雀斑样痣(黑素瘤)。如上所述的任何类型可以产生黑素或可以是无黑色素的。类似地，任何亚型可以显示粘连形成(向神经性的稠密纤维反应)，所述粘连形成是攻击行为且具有局部复发趋势的标示物。其他黑素瘤包括明细胞肉瘤、粘膜黑素瘤和葡萄膜黑素瘤。影响预后的特征是以毫米为单位的肿瘤厚度(Breslow深度)、皮肤结构相关的深度(Clark水平)、黑素瘤类型、溃疡存在度、淋巴/神经浸润存在度、肿瘤浸润的淋巴细胞存在度(如果存在，预后更好)、病灶位铬、卫星病灶存在度以及局部或远端转移存在度。当黑素瘤已经扩散到淋巴结，最重要的因素之一是有恶性肿瘤的结的数量。一个结内的恶性肿瘤的程度也是重要的；微小转移中恶性肿瘤仅是微观的，其具有比大转移更有利的预后。当有远端转移时，5年存活率低于10% ;生存中值是6-12个月。到皮肤和肺的转移有更好的预后。到脑、骨和肝的转移与更坏的预后相关。黑素瘤可分为如下阶段阶段0 :原位黑素瘤(Clark水平I)，100%存活阶段I/I1:侵袭性黑素瘤，85-95%存活Tla :原发瘤小于1. OOmm,无溃瘍，Clark水平I1-1IITlb :原发瘤小于1. 00mm，有溃疡或Clark水平IN-NT2a :原发瘤1. 00-2. OOmm,无溃瘍阶段I1:高风险黑素瘤，40-85%存活T2b :原发瘤1. 00-2. 00mm，有溃疡T3a :原发瘤 2. 00-4. OOmm,无溃瘍T3b :原发瘤 2. 00-4. OOmm,有溃疡T4a :原发瘤4. OOmm或更大,无溃瘍T4b :原发瘤4. OOmm或更大,有溃瘍阶段II1:局部转移，25-60%存活N1:单个阳性淋巴结N2 :2-3个阳性淋巴结或局部皮肤/中途转移N3 4个阳性淋巴结或淋巴结和局部皮肤/中途转移阶段IV:远端转移，9-15%存活Mla :远端皮肤转移，正常乳酸脱氢酶(LDH) Mlb :肺转移，正常LDHMlc :其他远端转移或任何有升高的LDH的远端转移单克隆抗体由B淋巴细胞的单克隆、其中转染有单个抗体轻链和重链基因的细胞或通过抗体文库中具体的噬菌体产生的抗体，使得所述单克隆抗体包括确定组的CDR并特异性结合目标靶抗原。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如(但不限于)通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造杂交的抗体形成细胞或从抗体序列的噬菌体展示文库选择。单克隆抗体包括人源化和完全人源性单克隆抗体。本文中，单克隆抗体的功能片段包括特异性结合所述单克隆抗体的靶蛋白(抗原结合)的抗体片段，例如但不限于scFv、Fv、dsRv或Fab。单克隆抗体特异性结合抗原表位,例如糖基化表位。单克隆抗体包括双功能抗体，其中一组或多组⑶R特异性结合靶抗原例如内质蛋白和效应子功能增强的Fe和其他乙二醇修饰的抗体。瘤形成、恶性肿瘤、癌症或肿瘤细胞异常及不受控制地生长的结果。瘤形成、恶性肿瘤、癌症或肿瘤经常可互换地使用。个体中肿瘤的量为“肿瘤负荷”，其可以按照所述肿瘤的数量、体积或重量来测量。不会转移的肿瘤称为“良性”。侵袭周围组织和/或可以转移的肿瘤称为“恶性”。血液肿瘤的实例包括白血病，其包括急性白血病(例如llq23阳性急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性粒细胞性白血病和成髓细胞的、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞的白血病和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高级别形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。实体瘤例如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳癌(包括基底型乳癌、导管癌和小叶乳癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和中枢神经系统肿瘤(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颉神经胶质瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜神经胶质瘤(menangioma)、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。在几个实例中，肿瘤是黑素瘤、乳癌、肾癌、神经胶质瘤或鳞状细胞癌，例如头颈 癌。核酸由核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物)通过磷酸二酯键组成的聚合物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中所述核苷酸及它们之间的键包括非天然存在的合成类似物，例如，举例但非限制地，磷硫酰、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。这样的多核苷酸可以被合成，例如使用自动DNA合成仪。术语“寡核苷酸”一般是指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。应该理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括其中〃U〃代替T的RNA序列(即A、U、G、C)。本文使用常规的符号描述核苷酸序列单链核苷酸序列的左手末端为5’末端；双链核苷酸序列的左手方向称为5’方向。向初生RNA转录本添加核苷酸的5’到3’方向称为转录方向。与mRNA具有相同序列的DNA链称为“编码链”;所述DNA链上与从该DNA转录的mRNA具有相同序列的、位于所述RNA转录本5’末端的5’外侧的序列称为“上游序列”；所述DNA链上与所述RNA具有相同序列的、在所述编码RNA转录本3’末端的3’外侧的序列称为“下游序列”。“cDNA”是指与mRNA互补或相同的单链或双链形式的DNA是。“编码”是指多核苷酸例如基因、cDNA或mRNA中核苷酸具体序列在生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质，所述其他聚合物和大分子有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列及由此产生的生物学性质。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生了蛋白，那么所述基因编码所述蛋白。基因或cDNA的编码链一其核苷酸序列与mRNA序列相同并通常在序列表中提供——和用作转录模板的非编码链都可以被称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其他产物。除非另有指定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列和RNA可以包括内含子。“重组核酸”是指具有没有天然连接在一起的核苷酸序列的核酸。这包括核酸载体，其含有可用于转化适合的宿主细胞的扩增或装配的核酸。包括所述重组核酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。然后所述基因在所述重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”。重组核酸也可以用作非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。如果序列为第一序列的多核苷酸特异性地与序列为第二序列的多核苷酸杂交，那么所述第一序列相对应第二序列为“反义的”。用于描述两个或更多核苷酸序列或氨基酸序列之间序列关系的术语包括“参考序列”、“选自”、“比较窗□”、“相同”、“序列同一性百分数”、“基本相同”、“互补”和“基本互补”。对于核酸序列的序列比较，一般一个序列作为参考序列，测试序列与之相比。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果必要可指定子序列坐标并指定序列算法程序参数。使用默认程序参数。用于比较的序列比对方法在本领域是已知的。可以进行最佳的用于比较的序列比对，例如通过Smith & Waterman, Adv. App1.Math. 2:482, 1981 的局部同源算法，通过 Needleman & ffunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970白勺同源性比对算法，通过 Pearson&Lipman, Proc. Nat，1. Acad. Sc1. USA85:2444, 1988 的搜索相似性方法，通过这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA, Genetics Co mputer Group, 575Science Dr.，Madison, WI)的计算机执行，或通过人工比对和目视检查(参见例如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel etal.,edsl995supplement) X可用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP 使用 Feng&Doolittle, J. Mol.Evo1. 35:351-360, 1987的渐进比对方法的简化方法。所使用的方法与Higgins&Sharp，CABI0S5:151-153, 1989描述的方法相似。使用PILEUP，将参考序列与其他测试序列比较以测定序列同一性关系的百分数，使用如下参数默认空隙加权(3. 00)、默认空隙长度加权(0.10)和加权的末端空隙。PILEUP可以从GCG序列分析软件包获得，例如7.0版本(Devereaux et al. , Nuc. Acids Res. 12:387-395，1984)。另一个适合于测定序列同一性百分数和序列相似性的算法实例为BLAST和BLAST2. 0 算法，其描述见于 Altschul et al.，J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 和 Altschulet al. ,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402，1977。公众可以通过美国国立生物技术信息中心得到执行BLAST分析的软件(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默认字符长度(W)为11，比对(B)为50，期望(E)为10，M=5, N=-4，并且两条链都比较。BLASTP程序(用于氨基酸序列)使用的默认字符长度(W)为3，期望(E)为 10，并使用 BL0SUM62 记分矩阵(参见 see Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sc1.USA89:10915, 1989)。
寡核苷酸长度最高约100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。开放读码框(ORF):不含任何终止密码子的编码氨基酸的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常被翻译为肽。可操作地连接当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能关系的方式放铬时，所述第一核酸序列与第二核酸序列是可操作地连接的。例如，如果启动子例如异源性启动子影响编码序列的转录或表达，那么所述启动子与所述编码序列是可操作地连接的。当需要将两个蛋白编码区域连接时，所述可操作地连接的DNA序列通常是连续的并且位于相同的读码框中。药剂当正确地给予受试者或细胞时能够诱导需要的治疗或预防效果的化学化合物或组合物。可药用载体可用的可 药用载体是常规的。Remington’ sPharmaceuticalSciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 15th Edition, 1975 中描述了适合药学递送本文公开的融合蛋白的的组合物和制剂。通常，所述载体的性质依赖于所采用的具体的给予模式。例如，肠胃外给予的制剂通常包括可注射液体，其包括药学和生理学可接受的液体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为赋形剂。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体夕卜，要给予的药物组合物可以含有最小量的无毒辅助物质例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲试剂等，例如乙酸钠或去水山梨糖醇单月桂酸酯。多核苷酸术语多核苷酸或核酸序列是指至少10个碱基长度的聚合形式的核苷酸。重组多核苷酸包括没有与在其来源的生物体天然存在的基因组中与其直接连续的两个编码序列(一个在其5’末端，一个在其3’末端)直接连续的多核苷酸。因此该术语包括例如插入到载体、插入到自主复制质粒或病毒、或插入到原核生物或真核生物基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其他序列的单独分子(例如cDNA)存在的重组DNA。所述核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或两种核苷酸的修饰形式。该术语包括单链形式和双链形式的DNA。多肽不管其长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)的任何氨基酸链。在一个实施方案中，所述多肽是内质蛋白多肽。“残基”是指通过酰胺键或类酰胺键插入多肽中的氨基酸或氨基酸类似物。多肽具有氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)。预防、治疗或改善疾病“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其征象或症状的治疗性介入，例如肿瘤负荷减少或转移的数量尺寸的降低。“改善”是指疾病例如癌症的征象或症状的数量或严重度的减少。探针和引物探针包括附着到可检测标记或报告分子上的分离的核酸。引物是短的核酸，优选DNA寡核苷酸，长度为15个核苷酸或更多。引物可以通过核酸杂交退火结合到互补的靶DNA链以形成所述引物与所述靶DNA链之间的杂合，然后通过DNA聚合酶沿所述靶DNA链延伸。引物对可用于核酸序列的扩增，例如通过本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)或其他核酸扩增方法。本领域技术人员应该理解具体探针或引物的特异性随其长度而增加。因此，例如，包括20个连续核苷酸的引物将比只有15个核苷酸的对应引物以更高的特异性退火结合到靶上。因此，为了获得更高的特异性，可以选择包括20、25、30、35、40、50或更多个连续核苷酸的探针和引物。启动子启动子是指导核酸转录的核酸控制序列的阵列。启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列，例如聚合酶II型启动子中的TATA元件。启动子还可任选地包括远端增强子或抑制元件，其位铬离所述转录起始位点可以多达几千碱基对。组成型和可诱导的启动子都包括在内(参见例如Bitter et al. , Methods inEnzymologyl53:516-544, 1987)。可以使用的启动子的具体非限制性实例包括源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒后期启动子；牛痘病毒7. 5K启动子)。还可以使用由重组DNA或合成技术产生的启动子。可将多核苷酸插入到含有启动子序列的表达载体，其中所述启动子序列可帮助所述宿主中插入的遗传序列有效地表达。所述表达载体一般含有复制起点、启动子、以及允许对所转化细胞进行表型选择的具体核酸序列。纯化术语纯化不需要绝对的纯；而是意图作为相对的术语。因此，例如，纯化的核酸是比其在细胞内天然环境中更浓缩的核酸。类似地，纯化的肽制剂是比其在细胞内天然环境中更浓缩的肽或蛋白质。基本纯化表示从其他蛋白质或细胞组分纯化。在一个实施方案中，纯化(或分离)制剂使得所述蛋白质或肽占所述制剂中总的肽或蛋白质含量的至少50% (例如但不限于70%、80%、90%、95%、98%或99%)。可以通过本领域任何已知方法纯化(和/或合成)本文所公开的内质蛋白多肽(参见例如Guide to Protein Purification, ed.Deutscher，Meth. Enzymol. 185，Academic Press,San Diego,1990;and Scopes,ProteinPurification!Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982)。重组重组核酸是具有非天然存在的序列或者具有通过人工组合两种本来分离的序列片段而制造的序列的核酸。这种人工组合经常是通过化学合成，或更通常地通过核酸分离片段的人工操作例如通过基因工程技术来完成。重组毒素其中 细胞靶向部分融合到毒素上的嵌合蛋白质(Pastan etal.，Science, 254:1173-1177，1991)。如果所述细胞靶向部分是抗体的Fv部分，那么所述分子被称为重组免疫毒素(Chaudhary et al. , Nature, 339:394-397，1989)。所述毒素部分被遗传改造以使其不能结合存在于大多数正常细胞上的毒素受体。重组免疫毒素选择性杀死被所述抗原结合域识别的细胞。这些重组毒素和免疫毒素可以用于治疗癌症例如其中内质蛋白被表达的癌症。选择性杂交在排除无关核苷酸序列的中度或高度严格条件下的杂交。在核酸杂交反应中，达到特定水平的严格性所使用的条件依赖于要杂交的核酸的性质而不同。例如，在选择杂交条件时可以考虑所述核酸杂交区域的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如GC含量比AT含量)和核苷酸类型(例如RNA对DNA)。另外要考虑所述核酸之一是否是固定化的，例如固定化到滤器上。渐进升高严格性的条件的具体非限制性实例如下在约室温下2XSSC/0. 1%SDS(杂交条件);在约室温下0. 2XSSC/0. 1%SDS (低严格性条件);在约42°C 0. 2x SSC/0. 1%SDS(中度严格性条件)；在约68°C 0.1x SSC (高严格性条件)。本领域技术人员可以容易地确定这些条件的变化(例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nded.，vol. 1-3, ed. Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 1989)。洗涤可以使用这些条件中仅仅一个(例如高严格性条件)或可以使用所述条件的每个(例如以如上列出的顺序每个10-15分钟)，可重复所列出的任何步骤或全部。但是，如上所提到的，最佳条件会依据具体涉及的杂交反应而不同，并可以凭经验确定。序列同一性氨基酸序列之间的相似性可表述为序列之间的相似性，或者可表述为序列同一性。常常以同一性(或相似性或同源性)百分数的形式测量序列同一性；百分数越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，内质蛋白多肽的同系物或变体会拥有相对高程度的序列同一性。用于比较的序列比对方法在本领域是已知的。多种程序和比对算法描述于Smith and Waterman, Adv. App1.Math.2:482, 1981;Needleman and ffunsch, J.Mol.Biol. 48:443, 1970;Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA85:2444, 1988;Higginsand Sharp, Gene73:237，1988;Higgins and Sharp, CABI0S5:151,1989;Corpet etal. , Nucleic Acids Researchl6:10881, 1988;以及 Pearson and Lipman, Proc. Natl.Acad. Sc1. USA85:2444, 1988. Altschul et al. , Nature Genet. 6:119，1994 中提供了序列比对方法和同源性计算的详细思路。所述NCBI 基础局部比对搜索工具(BLAST) (Altschul et al.，J. Mol.Biol. 215:403, 19 90)可以从几个来源得到，包括美国国立生物技术信息中心(NCBI, Bethesda, MD)和因特网，用于链接序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。如何使用所述程序确定序列同一性的描述可以从因特网上的NCBI网站得到。通过全长比对计算(使用NCBI Blast2. O、空隙blastp设定为默认参数)，内质蛋白多肽的同系物和变体一般具有与内质蛋白氨基酸序列至少75%例如至少80%的序列同一性。对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列比较，两个序列Blast功能的采用默认的BL0SUM62矩阵并使用默认参数(空隙存在值为11，每个残基空隙值为I)完成。当比对短肽时(少于约30个氨基酸)，所述比对应使用两个序列Blast功能采用PAM30矩阵并使用默认参数(开放空隙9，延伸空隙I罚分)完成。当通过这种方法评估时，与所述参考序列有甚至更大相似性的蛋白质会显示增加的同一性百分数，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。当不完整的序列用于序列同一性比较时，同系物和变体中10-20个氨基酸的短窗口一般具有与所述参考序列至少80%的序列同一丨丨生,并且可具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性。测定这种短窗口中序列同一性的方法可以在因特网上NCBI网站获得。本领域技术人员应该理解，这些序列同一性范围仅为指导的目的而提供；获得具有落在所提供范围外的非常高的序列同一性的同系物是完全可能的。特异性结合试剂基本仅结合到所确定的靶点的试剂。因此内质蛋白特异性结合试剂是基本仅结合到内质蛋白多肽的试剂。在一个实施方案中，所述特异性结合试剂是特异性结合内质蛋白的单克隆或多克隆抗体。鳞状细胞癌起源于形成皮肤、眼睛、多种内脏器官和中空器官的内层以及某些腺体导管的表面的鳞状细胞、薄扁平细胞的一类癌症。鳞状细胞癌还指表皮样癌。一类鳞状细胞癌是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。头颈部鳞状细胞癌包括鼻腔、窦、唇、口、唾液腺、咽和喉的癌症。HNSCC可分为如下阶段阶段0 :没有肿瘤存在的证据。
阶段1:肿瘤最大尺寸小于2cm或更少；没有局部淋巴结牵连或远端转移的证据。阶段I1:肿瘤大于2cm，但不大于4cm ;没有局部淋巴结牵连或远端转移的证据。阶段II1:肿瘤大于4cm ;在某些情况中，肿瘤已经扩散到淋巴结；没有远端转移的证据。阶段IV :肿瘤已经扩散到淋巴结；在某些情况中，存在远端转移。受试者活的多细胞有脊椎生物体，一个包括人和兽医的受试者的类别，其包括人和非人哺乳动物。T细胞对免疫反应关键的白细胞。T细胞包括但不限于⑶4+T细胞和⑶8+T细胞。CD4+T淋巴细胞是在其表面携带称为“分化簇4” (CD4)标示物的免疫细胞。这些细胞常称为“辅助”T细胞，其帮助协调免疫反应包括抗体反应以及杀伤性T细胞反应。CD8+T细胞携带“分化簇8”(CD8)标示物。在一个实施方案中，CD8T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。在另一个实施方案中，CD8细胞是抑制性T细胞。治疗有效量在治疗的受试者中足以达到需要效果的具体物质的量。例如，这可以是抑制或遏制肿瘤生长所必需的量。在一个实施方案中，治疗有效量是清除肿瘤或降低转移的数量或尺寸必需的量。当给予受试者时，通常使用会达到靶组织(例如在肿瘤中)浓度的剂量，其中所述靶组织浓度已被证实可达到需要的体外效果。毒素对细胞呈细胞毒性的分子。毒素包括相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin, PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素、阜草素、局限曲菌素或白树毒素，或其修饰的毒素。例如，PE和DT是高毒化合物,一般通过肝脏毒性引起死亡。但是，通过移除所述PE和DT毒素的 天然靶向组分(例如PE的域Ia或DT的B链)并将其用不同的靶向部分例如抗体代替，所述PE和DT可以被修饰为可用作免疫毒素的形式。转导转导细胞是已经通过分子生物学技术引入核酸分子的细胞。如本文所用的，术语转导包括可以将核酸分子引入所述细胞的所有技术，包括用病毒载体转染，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂质转染和粒子枪加速进行的裸露DNA的引入。载体被引入到宿主细胞从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括本领域已知的一种或多种选择标示物基因以及其他遗传元件。除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非上下文另有明确的指示，单数形式的术语“一”、“一个”和“该”包括复数的指示对象。类似地，除非上下文另有明确指示，单词“或者”意图包括“和”。还应该理解，为核酸或多肽给出的所有碱基尺寸或氨基酸尺寸以及所有分子重量或分子质量值是近似值，被提供用以描述。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开内容的实施或测试，适合的方法和材料如下所述。术语“包括(comprise) ”意为“包含(include) ”。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他文献，其全文以引用的方式纳入本文。如果有冲突，那么以本说明书(包括术语解释)为准。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的，并非意图进行限制。II1.特异性结合内质蛋白的人单克隆抗体已经生产了特异性结合内质蛋白(Grp94)的抗体，包括单克隆抗体例如完全人源性单克隆抗体。这些抗体和/或其抗原结合片段可以用于分离内质蛋白，并可用于检测和/或治疗表达内质蛋白的肿瘤，例如但不限于黑素瘤、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌或胰腺癌。这些抗体可以与可检测标记或效应分子缀合。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合糖基化内质蛋白。因此，在该实施方案中，所述抗体没有特异性结合非糖基化内质蛋白或无关抗原。本文公开了特异性结合内质蛋白的人单克隆抗体及其抗原结合片段。在一个实例中，人内质蛋白具有如下所述的氨基酸序列MRALWVLGLCCVLLTFGSVRADDEVDVDGTVEEDLGKSREGSRTDDEVVQREEEAIQLDGLNASQIRELREKSEKFAFQAEVNRMMKLIINSLYKNKEIFLRELISNASDALDKIRLISLTDEMALSGNEELTVKIKCDKEKMLLHVTDTGVGMTREELVKNLGTIAKSGTSEFLNKMTEAQEDGQSTSELIGQFGVGFYSAFLVADKVIVTSKHNNDTQHIWESDSNEFSVIADPRGNTLGRGTTITLVLKEEASDYLELDTIKNLVKKYSQFINFPIYVWSSKTETVEEPMEEEEAAKEEKEESDDEAAVEEEEEEKKPKTKKVEKTVWDWELMNDIKPIWQRPSKEVEEDEYKAFYKSFSKESDDPMAYIHFTAEGEVTFKSILFVPTSAPRGLFDEYGSKKSDYIKLYVRRVFITDDFHDMMPKYLNFVKGVVDSDDLPLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKYNDTFWKEFGTNIKLGVIEDHSNRTRLAKLLRFQSSHHPTDITSLDQYVERMKEKQDKIYFMAGSSRKEAESSPFVERLLKKGYEVIYLTEPVDEYCIQALPEFDGKRFQNVAKEGVKFDESEKTKESREAVEKEFEPLLNWMKDKALKDKIEKAVVSQRLTESPCALVASQYGWSGNMERIMKAQAYQTGKDISTNYYASQKKTFEINPRHPLIRDMLWRIKEDEDDKTVLDLAVVLFETATLRSGYLLPDTKAYGDRIERMLRLSLNIDPDAKVEEEPEEEPEETAEDTTEDTEQDEDEEMDVGTDEEEETAKESTAEKDELSEQ ID N0:5,还见于2010年6月16日可以获得的GENBANK 登录号No. NM_003299，其在此以引用的方式纳入本文。在另一个实例中，所述内质蛋白被如下核酸序列编码gtgggcggac cgcgcggctg gaggtgtgag gatccgaacc caggggtggggggtggaggcggctcctgcg atcgaagggg acttgagact caccggccgc acgccatgagggccctgtgggtgctggg cc tctgctgcgt cctgetgacc ttcgggtcgg tcagagctgacgatgaagttgatgtggatg gtacagtaga agaggatctg ggtaaaagta gagaaggatcaaggacggatgatgaagtag tacagagaga ggaagaagct attcagttgg atggattaaatgcatcacaaataagagaac ttagagagaa gtcggaaaag tttgccttcc aagccgaagttaacagaatgatgaaactta tcatcaattc attgtataaa aataaagaga ttttcctgagagaactgatttcaaatgctt ctgatgcttt agataagata aggctaatat cactgactgatgaaaatgctctttctggaa atgaggaact aacagtcaaa attaagtgtg ataaggagaagaacctgctgcatgtcacag acaccggtgt aggaatgacc agagaagagt tggttaaaaaccttggtaccatagccaaat ctgggacaag cgagttttta aacaaaatga ctgaagcacaggaagatggccagtcaactt ctgaattgat tggccagttt ggtgtcggtt tctattccgccttccttgtagcagataagg ttattgtcac ttcaaaacac aacaacgata cccagcacatctgggagtctgactccaatg aattttctgt aattgctgac ccaagaggaa acactctaggacggggaacgacaattaccc ttgtcttaaa agaagaagca tctgattacc ttgaattggatacaattaaaaatctcgtca aaaaatattc acagttcata aactttccta tttatgtatggagcagcaagactgaaactg ttgaggagcc catggaggaa gaagaagcag ccaaagaagagaaagaagaatctgatgatg aagctgcagt agaggaagaa gaagaagaaa agaaaccaaagactaaaaaagttgaaaaaa ctgtctggga ctgggaactt atgaatgata tcaaaccaat
权利要求
1.一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括SEQ ID NO:1的氨基酸 26-33 (CDRl)、SEQ ID NO:1 的氨基酸 51-58 (CDR2)、SEQ ID NO:1 的氨基酸97-103 (CDR3)，或其两者或三者的组合，并且其中所述抗体特异性结合人内质蛋白。
2.权利要求1所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括SEQIDNO: 2 的氨基酸 27-32 (CDRl)、SEQ ID NO: 2 的氨基酸 50-52 (CDR2)、SEQ ID NO: 2 的氨基酸89-97 (⑶R3)，或其两者或三者的组合。
3.权利要求1-2任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的重链可变域包括SEQ ID NO:1 的氨基酸26-33 (CDRl)、SEQ ID NO:1 的氨基酸51-58 (CDR2)、SEQID NO:1的氨基酸97-103 (CDR3)，并且所述抗体的轻链可变域包括SEQ ID NO:2的氨基酸27-32 (CDRl)、SEQ ID NO: 2 的氨基酸 50-52 (CDR2)和 SEQ ID NO: 2 的氨基酸 89-97 (CDR3)。
4.权利要求1-3任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的重链包括 SEQ ID NO:1。
5.权利要求1-4任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的轻链包括 SEQ ID NO:2。
6.权利要求1-5任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的重链包括SEQ ID NO:1，并且所述抗体的轻链包括SEQ ID NO:2。
7.权利要求1-6任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、单链Fv蛋白(scFv)或二硫化物稳定的Fv蛋白(dsFv)。
8.权利要求7所述分离的人单克隆抗体抗原结合片段，其中所述抗体是scFv。
9.权利要求1-8任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是IgG0
10.权利要求1-9任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是经标记的。
11.权利要求10所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述标记是荧光标记物、酶标记物或放射性标记物。
12.—种组合物，包括权利要求1-11任一项所述分离的抗体或抗原结合片段和可药用载体。
13.一种分离的免疫缀合物，包括连接到效应分子的权利要求1-9任一项所述人单克隆抗体或抗原结合片段。
14.权利要求13所述分离的免疫缀合物，其中所述效应分子是假单胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)或者其变体或片段。
15.一种组合物，其包括权利要求14所述分离的免疫缀合物和可药用载体。
16.一种治疗被诊断为患有表达内质蛋白的癌症的受试者的方法，包括 给予所述受试者治疗有效量的权利要求12或15的组合物， 从而治疗所述受试者中所述表达内质蛋白的癌症。
17.权利要求16所述方法，其中所述癌症为黑素瘤、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌或胰脏腺癌。
18.权利要求17所述方法，其中治疗所述受试者包括减少转移灶的数量或尺寸。
19.一种检测受试者中癌症或确认所述癌症的诊断的方法，包括 将来自所述受试者的样品与权利要求1-11任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段接触；并且 检测所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段与所述样品的结合， 其中与所述分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与对照样品的结合相比，所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段与所述样品的结合增加，则检测到所述受试者中癌症或确认了所述受试者中癌症的诊断。
20.权利要求19所述方法，其中所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段是直接经标记的。
21.权利要求19或20所述方法,还包括 将特异性结合所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段的第二抗体与所述样品接触， 检测所述第二抗体的结合， 其中与所述第二抗体与对照样品的结合相比，所述第二抗体与所述样品的结合增加，则检测到所述受试者中癌症或确认了所述受试者中癌症的诊断。
22.权利要求19-21任一项所述方法，其中所述癌症为黑素瘤、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。
23.权利要求19-22任一项所述方法，其中所述对照样品是来自未患癌症的受试者的样品。
24.权利要求19-23任一项所述方法，其中所述样品为血液样品、尿样品、活检样品、血清样品、痰样品、血浆样品或脑脊髓液样品。
25.权利要求19-24任一项所述方法，其中所述癌症是转移性的。
26.一种分离的或重组的核酸分子，编码权利要求1-11任一项所述的人单克隆抗体或抗原结合片段。
27.权利要求26所述分离的或重组的核酸分子，其中所述人单克隆抗体的Vh域包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其简并变体。
28.权利要求26或27所述分离的或重组的核酸分子，其中所述人单克隆抗体的\域包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或其简并变体。
29.权利要求26-28任一项所述分离的或重组的核酸分子，其可操作地连接到异源启动子。
30.一种表达载体，其包含权利要求26-29任一项所述分离的或重组的核酸分子。
31.一种分离的宿主细胞，其是用权利要求25-28任一项所述核酸分子或权利要求30所述表达载体转化的。
32.权利要求16所述方法，还包括给予所述受试者治疗有效量的化学治疗剂。
33.权利要求32所述方法，其中所述化学治疗剂为5-氟尿嘧啶、环巴胺、放射物或其组入口 o
34.权利要求13所述免疫缀合物，其中所述效应分子为细胞因子、趋化因子、化学治疗剂或放射性核苷酸。
35.权利要求34所述免疫缀合物，其中所述效应分子为细胞因子或趋化因子。
全文摘要
本文公开了特异性结合内质蛋白的分离的单克隆抗体。在某些实施方案中，这些抗体是完全人源性的。本文还公开了编码这些抗体的重组核酸、包括这些核酸的表达载体和用这些表达载体转化过的宿主细胞。在几个实施方案中，所公开的抗体可用于检测和/或治疗表达内质蛋白的肿瘤，例如黑素瘤、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。在一个实例中，所述肿瘤是黑素瘤。
文档编号A61K39/395GK103068851SQ201180039600
公开日2013年4月24日 申请日期2011年6月15日 优先权日2010年6月16日
发明者S·费龙, X·王, T·P·康拉茨, E·菲沃伊诺, B·胡德 申请人:高等教育联邦系统-匹兹堡大学