专利名称：癌温热疗法的作用增强剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌温热疗法的作用增强剂，更详细而言，涉及含有5-氨基乙酰丙酸类或它们的盐的、不同时使用光动力疗法(Photodynamic therapy:F1DT)的癌温热疗法的作用增强剂。
背景技术：
据说癌(恶性肿瘤)成为日本最大的死因，日本国民每2人中有I人罹患癌。另夕卜，在其他发达国家中癌也排在死因的前列。因此，癌的有效治疗法的开发是日本国民、以及世界人民的宏愿。但是，由于癌是患者自身的细胞，因此能够不伴随副作用地、有效果地治疗癌的有效的治疗剂及治疗方法的开发并不容易，目前还未报道充分的治疗剂及治疗方法。目前，癌的治疗中主要采用外科治疗、化学疗法、放射线治疗，但是近年来发现也逐渐采用温热疗法、光动力疗法等。上述温热疗法是利用癌细胞与正常细胞相比具有耐热差的特性，特异性地抑制癌细胞的增殖的治疗法。S卩，将包括癌细胞和正常细胞的组织在42 43°C左右加热时，对于正常细胞部分来说，机体恒常性(体内平衡)发挥作用，将细胞周围的血管扩张并增加血流、释放热等，将细胞的温度保持在40°C左右，结果基本不受损伤，但是由癌细胞形成的部分由于通常血流不足等，因此体内平衡不能充分发挥作用，结果，细胞的温度上升至加热温度附近，在42.5°C左右细胞死灭。但是，在采用温热疗法进行加热的部位广泛的情况下、在作为治疗对象的癌位于距离身体表面一定程度深度的位置的情况下，还存在由于加热导致的患者的负担增加等问题。上述光动力疗法是将对癌组织具有亲和性的光敏剂或其前体对患者给与后，对癌组织照射激光使上述光敏剂 激发，由此产生活性氧，使癌细胞死灭的治疗法。例如，在专利文献I中，公开了含有脂质体的光动力疗法制剂，所述脂质体中，在脂质膜内或其内部水相中含有光敏性化合物，包埋至少一种以上的药物，并且实质上不含有机溶剂，公开了在优选光敏性化合物之一中包括原卟啉IX(PpIX)，作为Ppix前体的5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)在肿瘤中选择性地诱导PpIX产生。另外，在专利文献I中记载了同时使用光动力疗法和温热疗法。由此，一直以来已知由于5-ALA是作为光敏剂的PpIX的前体，所以将5-ALA用于癌的治疗时，至少利用光动力疗法，根据情况进一步同时使用温热疗法，但是一直以来并没有不利用光动力疗法的将5-ALA应用于癌治疗的报道。[专利文献I]日本特开2006-56807号公报
发明内容
本发明的课题在于提供不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的作用增强剂。如背景技术中记载的那样，一直以来已知由于5-ALA为作为光敏剂的PpIX的前体，所以将5-ALA用于癌的治疗时，至少利用光动力疗法，根据情况进一步同时使用温热疗法。本发明人等在上述情况下进行了深入研究，结果发现虽然其作用机理完全不清楚，但是5-ALA即使在不同时使用光动力疗法的癌温热疗法中，也能够增强抗癌作用，从而完成了本发明。即，本发明涉及〔I〕一种不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的作用增强剂，其特征在于，含有通式(I)表示的5-氨基乙酰丙酸类或它们的盐，R2RiNch2COCh2Ch2COR3 (I)[式中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、酰基、烷氧基羰基、芳基或芳烷基；R3表不轻基、烧氧基、酸氧基、烧氧基擬基氧基、芳基氧基、芳烧基氧基或氣基。]，以及〔 2〕如上述〔I〕所述的癌温热疗法的作用增强剂，其特征在于，5-氨基乙酰丙酸类或它们的盐不包埋在脂质膜内或其内部水相中。另外，作为本发明的其他实施方式，可以举出不同时使用光动力疗法的癌温热疗法，其特征在于，将通式(I)表示的5-氨基乙酰丙酸类或它们的盐向对象给与；用于制备不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的作用增强剂或治疗药的通式(I)表示的5-氨基乙酰丙酸类或它们的盐的应用；不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的治疗剂，其特征在于，含有通式(I)表示的5-氨基乙酰丙酸类或它们的盐。根据本发明，能够显著增强不同时使用光动力疗法的癌温热疗法中的抗癌作用。另外，根据本发明，由于即使稍微降低温热疗法时加热的程度也能够得到充分的抗癌作用，所以在采用温热疗法加热的部位广泛的情况下、在作为治疗对象的癌位于距离身体表面一定程度的深度的位置的情况下等，也均能够减轻由于加热导致的患者的负担。另外，作为利用了本发明的癌温热疗法的作用增强剂的癌温热疗法相对于光动力疗法的优点，可以举出即使针对难以照射光线的部分的癌也能够获得抗癌作用。进而，根据本发明，能够将对正常细胞的损坏抑制到最小限度，并且针对癌细胞能够获得优异的抗癌作用。
[图1]是表示针对人胎儿肾细胞株HEK293株进行细胞内活性氧量测定分析的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示来自DCF-DA的荧光的峰值。[图2]为表示基于使用了人纤维肉瘤细胞株HT-1080的流式细胞术的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图3]为表示基于使用了来自大肠癌的细胞株Caco-2的流式细胞术的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图4]为表示基于使用了以与癌细胞同样地异常增殖的方式转化了的人胎儿肾细胞株HEK293的流式细胞术的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM),图的纵轴表示死细胞率(％ )。[图5]为表示基于使用了人成纤维细胞株W1-38的流式细胞术的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图6]为表示基于使用了小鼠成纤维细胞株NIH3T3的流式细胞术的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图7]为表不基于使用了来自大肠癌的细胞株Caco-2的锥虫蓝试剂的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率(细胞死亡率)
(% )o[图8]为表示基于使用了来自人肝癌的细胞株H印G2的锥虫蓝试剂的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图9]为表示基于使用了来自人胃癌的细胞株KatoIII的锥虫蓝试剂的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图10]为表示基于使用了来自人子宫颈癌的细胞株HeLa的锥虫蓝试剂的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图11]为表示基于使用了以与癌细胞同样地异常增殖的方式转化了的人胎儿肾细胞株HEK293的锥虫蓝试剂的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM),图的纵轴表示死细胞率(％ )。[图12]为表示基于使用了人正常二倍体成纤维细胞株W1-38的锥虫蓝试剂的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图13]为表示基于使用了小鼠成纤维细胞样细胞株NIH3T3的锥虫蓝试剂的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图14]为表示基于使用了来自人胎儿肺的正常成纤维细胞MRC5的锥虫蓝试剂的温热感受性试验的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示死细胞率)。[图15]为表示针对HEK293株，利用HPLC测定细胞内PpIX浓度的结果的图。图的横轴表示5-ALA浓度(mM)，图的纵轴表示细胞内PpIX浓度。
具体实施方式
[本发明的癌温热疗法的作用增强剂]本发明的癌温热疗法的作用增强剂(以下，也简单表示为“本发明的增强剂”。)为不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的作用增强剂，作为所述本发明的增强剂，只要含有以下通式(I)R2RiNch2COCh2Ch2COR3 (I)[式中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、酰基、烷氧基羰基、芳基或芳烷基；R3表不轻基、烧氧基、酸氧基、烧氧基擬基氧基、芳基氧基、芳烧基氧基或氣基。]表不的5_氣基乙酰丙酸类或它们的盐(以下，也表示为“本发明的5-氨基乙酰丙酸类等”。)即可，没有特别限定，所谓上述的“癌温热疗法的作用”表示基于癌温热疗法的抗癌作用。需要说明的是，对于人的正常细胞来说，由于优先进行有氧代谢，所以给与后的5-氨基乙酰丙酸类代谢至血细胞或细胞色素，而由于癌细胞优先进行无氧代谢，所以给与后的5-氨基乙酰丙酸类以血细胞或细胞色素的前体即原卟啉IX的形式蓄积在癌细胞中，这是本发明人等至此才发现的(参见日本特愿2009-161657号)。本发明的作用机制的详细情况尚不清楚，认为通过本发明的增强剂，在原卟啉IX较多地蓄积在癌细胞中的状态下进行癌温热疗法时，即使不照射激光，癌细胞中产生的活性氧量也显著上升，癌温热疗法中的抗癌作用显著增强(以下，也表示为“本发明的增强效果”。)。结果，根据本发明的增强齐U，能够使癌温热疗法中的抗癌作用显著增强，另外，由于即使稍微降低温热疗法时加热的程度也能够得到充分的抗癌作用，所以在采用温热疗法加热的部位广泛的情况下、在作为治疗对象的癌位于距离身体表面一定程度的深度的位置的情况下等，也均能够减轻由于加热导致的患者的负担。上述通式(I)中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、酰基、烷氧基羰基、芳基或芳烷基。作为上述烷基，优选碳原子数I 24的直链或支链的烷基，较优选碳原子数I 18的烷基，特别优选碳原子数I 6的烷基。作为所述碳原子数I 6的烷基，可以举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基等。作为上述酰基，优选碳原子数I 12的直链或支链的烷酰基、链烯基羰基或芳酰基，特别优选碳原子数I 6的烷酰基。作为所述酰基，可以举出甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基等。作为上述烷氧基羰基，优选总碳原子数2 13的烷氧基羰基，特别优选碳原子数2 7的烧氧基擬基。作为所述烧氧基擬基，可以举出甲氧基擬基、乙氧基擬基、正丙氧基擬基、异丙氧基擬基等° 作为上述芳基，优选碳原子数6 16的芳基,可以举出例如苯基、萘基等。作为上述芳烷基，优选由碳原子数6 16的芳基和上述碳原子数I 6的烷基形成的基团，可以举出例如苄基等。上述通式(I)中，R3表不轻基、烧氧基、酸氧基、烧氧基擬基氧基、芳基氧基、芳烧基氧基或氨基。作为上述烷氧基，优选碳原子数I 24的直链或支链的烷氧基，较优选碳原子数I 16的烷氧基，特别优选碳原子数I 12的烷氧基。作为所述烷氧基，可以举出甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、戍氧基、己氧基、羊氧基、癸氧基、十二烧基氧基等。作为上述酰氧基，优选碳原子数I 12的直链或支链的烷酰氧基，特别优选碳原子数I 6的烷酰氧基。作为所述酰氧基，可以举出乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基等。作为上述烧氧基擬基氧基，优选总碳原子数2 13的烧氧基擬基氧基，特别优选总碳原子数2 7的烧氧基擬基氧基。作为所述烧氧基擬基氧基，可以举出甲氧基擬基氧基、乙氧基擬基氧基、正丙氧基擬基氧基、异丙氧基擬基氧基等。作为上述芳基氧基,优选碳原子数6 16的芳基氧基,可以举出例如苯氧基、萘基氧基等。作为芳烷基氧基，优选具有上述芳烷基的芳烷基氧基，可以举出例如苄基氧基等。通式(I)中，作为R1及R2优选氢原子。作为R3优选羟基、烷氧基或芳烷基氧基，较优选羟基或碳原子数I 12的烷氧基，特别优选甲氧基或己氧基。通式⑴中，R1及R2为氢原子、R3为羟基的化合物为5-氨基乙酰丙酸，特别优选举出。作为除5-氨基乙酰丙酸以外的5-氨基乙酰丙酸类(即，5-氨基乙酰丙酸衍生物)的优选例子，可以举出5-氨基乙酰丙酸甲基酯、5-氨基乙酰丙酸乙基酯、5-氨基乙酰丙酸丙基酯、5-氨基乙酰丙酸丁基酯、5-氨基乙酰丙酸戊基酯、5-氨基乙酰丙酸己基酯等5-氨基乙酰丙酸酯，特别优选举出5-氨基乙酰丙酸甲基酯或5-氨基乙酰丙酸己基酯。需要说明的是，5-氨基乙酰丙酸的酯体显示与5-氨基乙酰丙酸相同的生理效果，例如公开在日本特表平11-501914号公报中。作为5-氨基乙酰丙酸类的盐，没有特别限定，优选药学上允许的无机酸或有机酸的酸加成盐。作为无机酸的加成盐，可以举出盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等，作为有机酸的加成盐，可以举出乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、抗坏血酸盐等，特别优选5-氨基乙酰丙酸盐酸盐或5-氨基乙酰丙酸磷酸盐。上述盐还可以通过化学合成、使用微生物或酶的方法中的任一种方法制造。例如，可以举出日本特开平4-9360号公报、日本特表平11-501914号公报、日本特开2006-182753号公报、日本特开2005-314361号公报、日本特开2005-314360号公报中记载的方法。作为本发明的增强剂中含有的、本发明的5-氨基乙酰丙酸类等的量，只要能够获得本发明的增强效果即可，没有特别限定，例如，可以优选示例相对于本发明的增强剂的总量例如为0.0001 99.9999质量％、优选0.001 80质量％、较优选0.001 50质量％、更优选0.005 20质量％。本发明的增强剂只要能够获得本发明的增强效果即可，除了本发明的5-氨基乙酰丙酸类等之外，还可以含有增强癌温热疗法的抗癌作用的其他物质等的任意成分。本发明的5-氨基乙酰丙酸类等可以利用常用方法制成适宜的制剂。作为制剂的剂型，可以为散剂、颗粒剂等固体制剂，从可以简便地使用的观点考虑，优选制成溶液剂、乳剂、悬浮剂等液体制剂。作为上述液体制剂的制造方法，可以优选示例例如将本发明的5-氨基乙酰丙酸类等与溶剂混合的方法、进而混合混悬剂或乳化剂的方法。如上所述，将本发明的5-氨基乙酰丙酸类等制成制剂时，根据制剂上的需要，可以配合适宜的载体，例如，赋形剂、粘合剂、溶剂、助溶剂、混悬剂、乳化剂、等渗剂、缓冲剂、稳定剂、镇痛剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、润滑剂、崩解剂、湿润剂、吸附剂、甜味剂、稀释剂等任意成分。需要说明的是，作为本发明的增强剂，可以优选示出本发明的5-氨基乙酰丙酸类等不包埋在脂质膜内或其内部水相中的产物。本发明的增强剂在体外的体系、体内的体系中均能够增强不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的抗癌作用，可以优选示例在体内的体系中使用的方法。作为上述在体外的体系中使用的方法，可以示例包括下述步骤的方法:(a)使本发明的增强剂与对象细胞接触的步骤；及(b)将对象细胞加热至41 44°C (优选42 43°C )的范围内的步骤，作为上述步骤(a)，可以较优选 地示例(al)在使对象细胞与本发明的增强剂接触的状态下，培养一定时间(优选5分钟 25小时、较优选10分钟至15小时、更优选3小时 7小时、进一步优选5小时)的步骤；作为上述步骤(b)，可以较优选地示例(b I)将对象细胞加热至41 44°C (优选42 43°C )的范围内，将该对象细胞在该范围内的温度下维持10分钟 5小时(优选15分钟 3小时、较优选20分钟 2小时、更优选30分钟 60分钟)的步骤。作为在所述体外的体系中的本发明的增强剂的使用量，只要能够获得本发明的增强效果即可，没有特别限定，可以优选示例使与对象细胞接触的培养基中的浓度以5-氨基乙酰丙酸类等换算计例如为0.1 μ M IOOOmM,优选为10 μ M 50mM。作为将本发明的增强剂在体内的体系中使用的方法，可以示例包括下述步骤的方法:㈧将本发明的增强剂给与至对象的步骤；及⑶将对象的癌部位加热至41 440C (优选42 43°C)的范围内的步骤，作为上述步骤(A)，可以较优选示例(Al)将本发明的增强剂向对象给与后，使其经过一定时间(优选5分钟 25小时、较优选10分钟至15小时、更优选3小时 7小时、进一步优选4小时 6小时)的步骤，作为上述步骤⑶，可以较优选示例(B I)将对象的癌部位加热至41 44°C (优选42 43°C)的范围内，将该部位在该范围内的温度下维持10分钟 5小时(优选15分钟 3小时、较优选20分钟 2小时、更优选25分钟 90分钟、进一步优选30分钟 75分钟、特别优选40分钟 60分钟)的步骤。在上述步骤(Al)中，使其经过一定时间，是由于使本发明的增强剂中含有的5-氨基乙酰丙酸类等的代谢产物即原卟啉IX在癌细胞中更多地蓄积，获得更优异的本发明的增强效果。作为将上述本发明的增强剂向对象给与的方法，可以示例向静脉内、肌肉内、动脉内等的注射给与；经口给与；经皮给与；经粘膜给与；经直肠给与；经腔道给与；向脑等的局部给与，其中，可以优选示例向静脉内、肌肉内、动脉内等的注射给与；经口给与；经皮给与。作为在所述体内的体系中的本发明的增强剂的给与量，只要能够获得本发明的增强效果即可，没有特别限定，可以优选示例以本发明的5-氨基乙酰丙酸类等换算计成人I人每1日优选1mg 1OOOOmg、较优选3mg 3000mg、更优选IOmg IOOOmg。本发明的增强剂的给与时间段没有特别限定，可以为早晨也可以为傍晚，给与量较多时，分多次给与较好。作为上述体外的体系或体内的体系中的加热方法，只要能够加热至规定的温度即可，没有特别限定，例如可以示例下述方法:将微波、近红外线、远红外线、可见光、或电磁波等照射至目标部位近旁进行加热的方法；在目标部位附近进行温灸而加热的方法；用热水加热目标部位附近的方法(例如沐浴)； 用蒸汽加热目标部位附近的方法(例如桑拿浴)；在食道及直肠等管腔内放入能够发热的器具进行加热的方法；在癌组织中放入多根电极针进行加热的方法。其中，由于容易以一定程度地针对癌部位进行加热，并且，较容易加热，因此可以优选示例将微波、近红外线、远红外线、可见光、或电磁波等照射至目标部位近旁进行加热的方法，其中，由于电磁波容易到达至身体的深部，所以可以较优选示例将电磁波照射至目标部位附近进行加 热的方法。需要说明的是，本发明的增强剂为不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的作用增强剂，但可以与光动力疗法以外的方法(例如，外科治疗、化学疗法、免疫疗法)同时使用。作为上述对象细胞的由来、对象的生物种类，可以优选示例哺乳动物，可以优选示例人、猴子、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、牛、猪、马、兔子、绵羊、山羊、猫、狗等，其中可以较优选示例人。在本发明中，所谓“癌”可以举出恶性黑色素瘤(黑素瘤)、皮肤癌、肺癌、气管及支气管癌、口腔上皮癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、大肠癌、肝脏及肝内胆管癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、乳癌、子宫癌、卵巢癌、脑肿瘤等上皮细胞等恶化后的癌.肿瘤、肌肉肿瘤、骨肉瘤、尤文肉瘤等构成支持组织的细胞即肌肉或骨恶化后的癌 肿瘤、白血病、恶性淋巴瘤、骨髓瘤、伯基特淋巴瘤等来自造血细胞的癌 肿瘤等，其中，作为易于适用癌温热疗法、特别是能够较多地享受本发明的增强剂的增强效果的癌，可以优选示例纤维肉瘤、黑素瘤、大肠癌、进而转移至腹腔内的癌。需要说明的是，作为与本发明实质上相同的方案，还可以示例下述方案:本发明的增强剂的制造中的、本发明的5-氨基乙酰丙酸类等的应用；将本发明的5-氨基乙酰丙酸类等用于本发明的增强剂的方法；基于不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的癌的预防及/或治疗中的、本发明的增强剂的应用；特征在于将本发明的增强剂向对象给与的、不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的抗癌作用的增强方法。上述应用及方法中的文字的内容及其优选方案如上所述。以下通过实施例详细说明本发明，但本发明不限定于所述实施例。[实施例1][细胞内活性氧量测定分析]为了研究本发明的5-氨基乙酰丙酸类等对温热疗法时细胞内的活性氧种量(细胞内活性氧量)带来怎样的影响，使用来自人胎儿肾脏的HEK293细胞及DCF-DA荧光试剂(2' , 7' -Dichlorodihydrofluorescein Diacetate ;H2DCFDA),进行细胞内活性氧量测定分析。需要说明的是，所述测定分析利用下述性质:细胞透过性的H2DCFDA直至在活细胞的细胞质中被氧化为止为非荧光物质，但是如果进入活细胞内，则其二乙酸基被细胞内酯酶切断，进而如果被活性氧种氧化，则产生荧光。测定的荧光量越多，表示细胞内活性氧量越多。所述测定分析采用以下方法进行。首先，将准备的HEK293细胞在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s ModifiedEagle(DME)培养基中于37°C下培养24小时，将其分为8个组。接下来，将培养基交换为不含FBS的DME培养基，添加5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)使最终浓度分别成为0.5mM、1.0mM、或
2.0mM，于37°C下，培养2小时后，添加10% FBS，将所述HEK293细胞于37°C或42°C下培养24小时。另外，对于未添加5-ALA的HEK293细胞也同样地于37°C或42°C下培养24小时。以上，整个培养过程在遮光下进行，完全不照射紫外线、可见光、红外线、放射线等。进而，在各组的HEK293细胞中，添加DCF-DA荧光试剂(SIGMA公司制)使其最终浓度成为20 μ M，培养30分钟后，采用流式细胞术(Becton -Dickinson公司制、FACSCalibur)测定各组中来自DCF-DA的荧光(FLl ;绿色荧光)。需要说明的是，从流式细胞术本体照射至细胞上的激发光仅用于测定，对细胞死亡无影响。将各组中的其荧光的峰值示于图1的图中。由图1的结果可知，表明添加5-ALA时，虽然在培养温度37°C的情况下，细胞内活性氧量也有若干上升，但是在培养温度42°C的情况下，细胞内活性氧量显著上升。更详细而言，在培养温度42 °C的情况下，与未添加5-ALA的情况相比，通过0.5mM的5-ALA的添加，细胞内活性氧量上升至1.23倍(300/244)，通过1.0mM的5-ALA添加，细胞内活性氧量上升至1.34倍(326/244)，通过2.0mM的5-ALA添加，细胞内活性氧量上升至1.42倍(346/244)。[实施例2][基于流式细胞术的温热感受性试验]为了研究通过添加5-ALA使得癌细胞对温热的感受性受到怎样的影响，进行了利用流式细胞术法的、以下的温热感受性试验。首先，作为癌细胞株，准备人纤维肉瘤细胞株HT-1080、来自大肠癌的细胞株Caco-2，准备作为正常细胞株的人成纤维细胞株W1-38、小鼠成纤维细胞株NIH3T3，准备以与癌细胞同样地异常增殖的方式转化了的人胎儿肾细胞株HEK293。将所述细胞在含有10% FBS的DME培养基中于37°C下培养24小时，将其分为8个组。接下来，将培养基交换为不含FBS的DME培养基，添加5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)使得最终浓度分别成为0.5mM、
1.0mM、或2.0mM,于37°C下培养2小时后，添加10% FBS，将所述细胞组于37°C或42°C下培养24小时。另外，对于未添加5-ALA细胞组也同样地于37°C或42°C下培养24小时。以上，整个培养过程在遮光下进行 ，完全未照射紫外线、可见光、红外线、放射线等。
接下来，利用MBL公司制MEBCYTO-apoptosis试剂盒及流式细胞术测定各组的死细胞率(％)。需要说明的是，从流式细胞术本体照射至细胞上的激发光仅用于测定，对细胞死亡无影响。对于死细胞率来说，对引起了凋亡及坏死的细胞的总和进行计数，算出针对总细胞数的比例。将HT-1080的结果示于图2，将Caco-2的结果示于图3，将HEK293的结果示于图4，将W1-38的结果示于图5，将NIH3T3的结果示于图6。由图2 4可知，在作为癌细胞株的HT1080、Caco-2、及被转化、如癌细胞那样异常增殖的HEK293中，显示添加5-ALA时，虽然即使在培养温度37°C的情况下，死细胞率(％)也若干上升，但是在培养温度42°C的情况下，死细胞率(％)显著上升。另一方面，由图5及6可知，在作为正常细胞的W1-38、NIH3T3中，未见在42°C培养条件下的依赖5-ALA浓度的细胞死亡的增强。由此，对于在42°C培养条件下的5-ALA的细胞死亡增强作用来说，在正常细胞中几乎无法获得，而在癌细胞中、或者在癌细胞样的异常增殖的细胞中能够显著获得。即，在癌温热疗法中，同时使用5-ALA时，癌温热疗法中的抗癌作用(细胞死亡诱导作用)显著增强，并且，所述细胞死亡诱导作用在正常细胞中几乎未增强。由此表明在癌温热疗法中同时使用5-ALA时，能够将对正常细胞的损坏抑制到最小限度，并且获得对癌细胞的优异的抗癌作用。需要说明的是，更详细地说明图2的HT-1080的结果时，对于培养温度为42°C的情况来说，与未添加5-ALA的情况相比，通过添加0.5mM的5-ALA，死细胞率(％ )上升至约1.7倍，通过添加1.0mM的5-ALA，死细胞率)上升至约1.5倍，通过添加2.0mM的5-ALA，死细胞率(％)上升至约2.3倍。另外，更详细地说明图3的Caco-2的结果时，对于培养温度42°C的情况来说，与未添加5-ALA的情况相比，通过添加0.5mM的5-ALA，死细胞率)上升至约2.1倍，通过添加1.0mM的5-ALA，死细胞率)上升至约2.0倍，通过添加2.0mM的5-ALA，死细胞率)上升至约1.9倍。进而，更详细地说明图4的HEK293的结果时，对于培养温度42°C的情况来说，与未添加5-ALA的情况相比，通过添加0.5mM的5-ALA，死细胞率)上升至约3.2倍，通过添加1.0mM的5-ALA，死细胞率)上升至约4.8倍，通过添加2.0mM的5-ALA，死细胞率)上升至约6.0倍。[实施例3][基于锥虫蓝试剂的 温热感受性试验]作为癌细胞株，使用来自大肠癌的细胞株Caco-2、来自人肝癌的细胞株HepG2、来自人胃癌的细胞株KatoII1、来自人子宫颈癌的细胞株HeLa，作为以与癌细胞同样地异常增殖的方式转化了的细胞，使用人胎儿肾细胞株HEK293，作为正常细胞，使用人正常二倍体成纤维细胞株W1-38、小鼠成纤维细胞样细胞株NIH3T3、来自人胎儿肺的正常成纤维细胞MRC5。对于所述各细胞，在添加了 10% 85和、0、0.5、1、2禮各浓度的541^的01^培养基中于37 °C或42 °C下培养24小时，通过胰蛋白酶处理回收细胞。之后，将回收的细胞溶液和锥虫蓝试剂等量混合，使用血球计数板对细胞进行计数，算出死细胞(被锥虫蓝染色了的细胞)的比例)(细胞死亡率)。结果表明，在作为癌细胞的Caco-2 (参照图7)、H印G2(参照图8)、KatoIII (参照图9)、HeLa(参照图10)的各癌细胞、和与癌细胞同样地异常增殖的人胎儿肾细胞株HEK293(参照图11)中，在37 °C的培养下，在添加有各浓度的5-ALA的情况下未见死细胞率的上升，但是通过于42°C下进行培养，死细胞率与5-ALA浓度依赖性地显著上升。特别是在转化了的人胎儿肾细胞株HEK293中，显著地观察到5-ALA浓度依赖性。另一方面，在W1-38(参照图12)、NIH3T3(参照图13)、MRC5(参照图14)各正常细胞中，即使通过于42°C下进行培养也未见5-ALA浓度依赖性的、死细胞率的上升。由上述结果可知，与上述实施例2中的基于流式细胞术的温热感受性试验同样地表明，在癌温热疗法中5-ALA的同时使用能够将对正常细胞的损伤抑制到最小限度，并且，增强对癌细胞的抗癌作用。需要说明的是，更详细地说明图7的Caco-2的结果时，对于培养温度42°C的情况而言，与未添加5-ALA的情况相比，通过0.5mM的5-ALA的添加，死细胞率)上升至约
1.2倍，通过1.0mM的5-ALA添加，死细胞率)上升至约1.7倍，通过2.0mM的5-ALA添力口，死细胞率(％)上升至约1.6倍。另外，更详细地说明图8的H印G2的结果时，对于培养温度42°C的情况来说，与未添加5-ALA的情况相比，通过0.5mM的5-ALA的添加，死细胞率(% )上升至约1.1倍，通过1.0mM的5-ALA添加，死细胞率(％ )上升至约1.35倍，通过
2.0mM的5-ALA添加，死细胞率)上升至约1.5倍。更详细地说明图9的KatoIII的结果时，对于培养温度42°C的情况来说，与未添加5-ALA的情况相比，通过0.5mM的5-ALA的添加，死细胞率(％ )上升至约1.8倍，通过1.0mM的5-ALA添加，死细胞率(％ )上升至约1.8倍，通过2.0mM的5-ALA添加，死细胞率)上升至约1.8倍。更详细地说明图10的HeLa的结果时，对于培养温度42°C的情况来说，与未添加5-ALA的情况相比，通过0.5mM的5-ALA的添加，死细胞率)上升至约1.4倍，通过1.0mM的5-ALA添加，死细胞率)上升至约1.5倍，通过2.0mM的5-ALA添加，死细胞率)上升至约1.6倍。进而，更详细地说明图11的HEK293的结果时，对于培养温度42°C的情况来说，与未添加5-ALA的情况相比，通过0.5mM的5-ALA的添加，死细胞率)上升至约1.6倍，通过1.0mM的5-ALA添加，死细胞率(％ )上升至约2.0倍，通过2.0mM的5-ALA添加，死细胞率(％ )上升至约
3.5 倍。[实施例4][细胞内PpIX浓度 的基于HPLC的测定]使用在上述实施例3中显著地观察到5-ALA与温热疗法的同时使用效果的、转化了的人胎儿肾细胞株J1EK293进一步进行研究。另外，作为对照，使用未见5-ALA与温热疗法的同时使用效果的、正常细胞株W1-38株。对于上述2种细胞，在含有10% FBSJP 0、0.5、
1、2mM各浓度的5-ALA的DME培养基中，于37°C或42°C下培养24小时，通过胰蛋白酶处理回收细胞后使用血球计数板，进行调整使得测定样品中含有的细胞数成为1X104。接下来，用NaOH使细胞溶解，将用DMF溶液(将N，N-二甲基甲酰胺:2-丙醇=100: I混合得到的产物)处理后的细胞溶解液在13，000rpm、4°C下离心分离10分钟之后仅回收上清液，将在室温下反应24小时的上清液作为测定样品，用于利用HPLC的PpIX浓度测定。将对于上述HEK293株，通过HPLC测定细胞内PpIX浓度得到的结果示于图15。确认到在42°C培养条件下HEK293细胞株内的PpIX浓度以依赖于5-ALA浓度的方式上升。所述结果表明，上述实施例3中所示的5-ALA的温热疗法的增强作用以依赖于5-ALA的方式被引起。需要说明的是，更详细地说明图15的HEK293的结果时，对于培养温度42°C的情况，与未添加5-ALA的情况相比，通过0.5mM的5-ALA的添加，细胞内PpIX浓度上升至约
2.75倍，通过1.0mM的5-ALA添加，细胞内PpIX浓度上升至约6.3倍，通过2.0mM的5-ALA添加，细胞内PpIX浓度上升至约5.9倍。另一方面，虽然图中未示出，在正常细胞W1-38株中，无论添加的5-ALA浓度如何，在用于本实验的任意测定样品中，细胞中PpIX浓度均为检测限以下。所述结果证明，如上述实施例3所示，5-ALA与温热疗法的同时使用不会对正常细胞带来伤害。产业上的可利用性本发明可以优选用于癌治疗领域，更详细而言，可以优选用于不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的作用 增强剂的领域。
权利要求
1.种不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的作用增强剂，其特征在于，含有通式(1)表示的5-氨基乙酰丙酸类或它们的盐，R2RiNch2COCh2Ch2COR3 (I) 式中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、酰基、烷氧基羰基、芳基或芳烷基；R3表示羟基、烷氧基、酰氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或氨基。
2.按权利要求1所述的癌温热疗法的作用增强剂，其特征在于，5-氨基乙酰丙酸类或它们的盐不包埋在脂质膜内或其内部水相中。
全文摘要
本发明提供不同时使用光动力疗法的癌温热疗法的作用增强剂。通过作为癌温热疗法的作用增强剂，利用通式(1)R2R1NCH2COCH2CH2COR3 (1)[式中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、酰基、烷氧基羰基、芳基或芳烷基；R3表示羟基、烷氧基、酰氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或氨基。]表示的5-氨基乙酰丙酸类或它们的盐，由此能够不同时使用光动力疗法地治疗癌。
文档编号A61P43/00GK103096884SQ20118004299
公开日2013年5月8日 申请日期2011年9月12日 优先权日2010年9月14日
发明者千叶樱拓, 田中彻, 高桥究, 中岛元夫, 安部史纪 申请人:学校法人东京农业大学, 思佰益药业股份有限公司