疫苗的制作方法

专利名称：疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含Hiv-1抗原的免疫原性组合物及其在治疗感染HIV-1的受试者中的用途。具体来说，发明涉及包含HIV-1抗原的免疫原性组合物在治疗或改善感染HIV-1的受试者的疾病和/或延迟或减轻感染HIV-1的受试者对抗逆转录病毒疗法的需要中的用途。
背景技术：
HIV的多种免疫学特点使得HIV疫苗的开发极具挑战性。有很大的可能性抗体和T细胞选择病毒的相继免疫变体继续入侵宿主的应答系统。有证据表明在自然感染后存在特异性免疫，病毒往往会被宿主的免疫反应阻挡许多年，直至免疫系统最终不能控制病毒。在感染HIV的过程中，可以检测到细胞免疫反应(辅助性和特异细胞毒性T细胞)以及结合抗体、病毒中和和抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC) [Letvin, 1993;ffeiss, 1993]。在未经处理的个体中，HIV-1感染的典型过程一般在8-12年的时期内遵循三个主要阶段(

图1) [Pantaleo, 1993]。I) [Pantaleo, 1993]。虽然个体之间有很大的差别，感染的模式和程序如下:急性(原发)感染:原发HIV-1感染是一个短暂的状态。在40-90%患者中是一种有症状的疾病，并伴有i)血浆病毒血初始快速升高， )血液CD4+T淋巴细胞计数下降和iii)血液CD8+T淋巴细胞计数极大增加。血浆病毒血初始升高的下降通常与病毒特异性免疫反应的出现相关，特别是HIV-1特异性细胞毒T淋巴细胞(CTLs)的出现[Kaufmann, 1999]。慢性、无症状期:在这个时期内，出现临床上的，但不是病毒学上的潜伏期(中值时间是10年)，具有相对稳定的CD4+T淋巴细胞计数和低病毒载量。该时期是疾病管理的重要目标，因为受试者一般还是健康的。长期无进展者(LTNP)可以在没有治疗的情况下在该时期保持几年。目前的疾病管理策略，比如ART可以将这个时期尽可能地延长。慢性、有症状的HIV感染(AIDS):临床AIDS的开始是出现第一个C类⑶C [⑶C，1993]或者WHO第IV阶段临床事件[HO，2005]。AIDS指示着HIV-1感染的末期，在没有抗逆转录病毒疗法的情况下2-3年会发生死亡。给予感染HIV-1的受试者治疗性疫苗对于稳定或减少HIV-1病毒载量是有用的，因此在减少或者消除其他抗病毒治疗需求的情况下减缓HIV疾病的进展。因此，仍然需要开发能够对感染受试者的HIV疾病进行管理的治疗性疫苗。发明概述本发明的目的是提供增强感染HIV-1的受试者的T细胞反应的方法和组合物，包括I)选择感染了 Hiv-1的受试者；和2)将免疫原性组合物给予所述受试者，所述组合物包含a.两个或以上选自Nef、Gag和Pol的HIV-1抗原；和

b.能够诱发Thl免疫反应的佐剂；和
c.药学上可接受的赋形剂。本发明的再一个目的是提供在感染HIV-1的受试者中诱发免疫反应的方法和组合物，其中在给予组合物后，受试者与给药之前相比，有更高百分比的CD4+T细胞显示出对免疫原性组合物中的至少一种多肽的特异识别。本发明的再一个目的是提供在感染HIV-1的受试者中诱发免疫反应的方法和组合物，其中在给予组合物后，受试者与给药之前相比，有更高百分比的CD4+T细胞显示出对免疫原性组合物中的至少一种多肽的特异识别。本发明的再一个目的是提供给感染HIV-1的受试者恢复HIV-1特异性⑶8+T细胞功能或者防止功能的丢失的方法和组合物，包括给予本发明的组合物。本发明的再一个目的是提供减少感染HIV-1的受试者中病毒载量的方法和组合物，其中给予组合物后，受试者的病毒载量与给药前相比，至少在四个月中保持稳定或者下降。本发明的再一个目的是提供防止感染HIV-1的受试者中临床HIV疾病的发病的方法和组合物，其中给予组合物后，受试者的病毒载量至少在给药后的四个月中保持在100，000拷贝/ml以下。还提供了药物组合物，所述药物组合物包含a.两个或以上选自Nef、Gag和Pol的HIV-1抗原；和b.能够诱发Thl免疫反应的佐剂；和

c.药学上可接受的赋形剂。用于在没有抗逆转录病毒疗法(ART)的情况下，将感染HIV-1的受试者的病毒载量在给药后的至少四个月减少或者保持在100,000拷贝/ml或以下。在一个实施方案中，受试者未接受ART。在一个实施方案中，药物组合物是用于在没有ART的情况下，将感染HIV-1的受试者的病毒载量稳定性保持至少四个月。在另一个实施方案中，药物组合物用于增强未接受ART的感染HIV-1的受试者的T细胞反应。在再一个实施方案中，增强的T细胞反应是与给予药物组合物之前相比,受试者中更高百分比的⑶4+T细胞或者⑶8+T细胞显示出对药物组合物中至少一个多肽的特异识另O。在再一个实施方案中，增强的T细胞反应是与给予药物组合物之前相比，受试者中更高百分比的⑶4+T细胞表达至少一个、两个或者三个活化标记物，比如⑶40L、IL-2、TNF α和IFNy。在再一个实施方案中，增强的T细胞反应是HIV-1特异性CD8+T细胞功能的恢复或者对丢失该功能的抑制。在再一个实施方案中，受试者的病毒载量在至少六个月、至少十二个月、至少十八个月、至少两年、至少三年、至少四年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年或者至少十年保持在100，000拷贝/ml以下。在另一个实施方案中，受试者的病毒载量保持在50，000拷贝/ml以下、10，000拷贝/ml以下、5000拷贝/ml以下、1000拷贝/ml以下或者500拷贝/ml以下。在一个实施方案中，受试者同时接受抗逆转录病毒疗法(ART)。在再一个实施方案中，受试者在给予所述免疫原性组合物之前或者之后停止了抗逆转录病毒疗法(ART)。在另一个实施方案中，受试者从未接受过ART。在再一个实施方案中，受试者在被给予免疫原性组合物后中断了 ART至少六个月、至少一年、至少两年、至少三年、至少四年或者至少五年。在一个实施方案中，组合物中的多肽包含Nef、Gag和Pol。在再一个实施方案中，Gag是pl7、p24或者这两者。在另一个实施方案中，Pol是RT。在再一个实施方案中，多肽包含SEQ ID N0:8。在另一个实施方案中，免疫原性组合物还包含Env。在一个实施方案中，组合物的佐剂是选自下述的一或多个成分:免疫活性皂苷组分、脂多糖、免疫刺激性寡核苷酸和留醇。在再一个实施方案中，佐剂包含免疫活性皂苷组分和脂多糖。在再一个实施方案中，佐剂包含QS21和/或脂质A衍生物。在再一个实施方案中，脂质A衍生物是3D-MPL。在另一个实施方案中，佐剂包含CpG。在另一个实施方案中，甾醇是胆固醇。在再一个实施方案中，佐剂还包含脂质体载体。在一个实施方案中，受试者被给予一次组合物。在再一个实施方案中，受试者被给予两次或更多次组合物。在再一个实施方案中，组合物作为引发-强化方案中的引发剂量或者强化剂量。附图简述图1的图形显示了 HIV疾病进展与两个主要临床标记物⑶4+T细胞计数(细胞/mm3)和病毒载量(血浆病毒血症滴度)之间的相关性。图2示意了实施例中描述的患者组。图3A-B显示了经历ART患者组(图板A)和未经历ART患者组(图板B)中，作为距给予第一个剂量的天数的函数的CD4计数相对基础水平的变化。对每个图板中的每对数据，F4/AS01显示在左侧(黑色)，安慰剂在右侧(红色)。图4A-B显示了研究过程中未经历ART的患者组的病毒载量。图板A显示了作为距给予第一个剂量的天数的函数的病毒载量相对基础水平的变化(以1glO表示)。安慰剂是顶端的线(灰色)，F4/AS01是`底部的线(桔色)。图板B显示了未经历ART的患者组(总的接种组)在第44天、第4个月、第7个月和第12个月1glO病毒载量变化的逆累加分布曲线(RCChY轴对应病毒载量变化超过或者等于相应的X轴数值的受试者百分比。曲线中的每个下降对应给定受试者中观察到的病毒载量变化(每个点对应一个受试者)。对于每个图形，F4/AS01以左边的线(灰色)代表，安慰剂以右边的(粗的桔色线)代表。图5A-C显示了至少表达IL-2 (根据免疫原性方案组)的F4特异性⑶40L+T+细胞的百分比；㈧经历ART和未经历ART的受试者中对F4的整体反应；⑶经历ART的受试者中对特异性抗原的反应；(C)未经历ART的受试者中对特异性抗原的反应。P值都是基于由按照基线水平调节过的ANCOVA模型衍生的针对F4/AS01相对于安慰剂的几何平均比值的95%CI (排除未进行调节的接种前时间点[AN0VA])。对于每个图形，安慰剂组以左边(灰色)代表，F4/AS01以右边代表(桔色)。图6是对F4/AS01疫苗的⑶4T细胞反应的结果表格。响应者比率。用Nef、pl7、p24和逆转录酶(RT)肽集合刺激后，通过胞内细胞因子染色对T细胞应答进行评估。结果表示为至少表达IL-2的⑶40L+CD4+T细胞的总百分比。如果在接种疫苗前未检测到细胞因子的分泌，则在至少表达IL-2的CD40L+CD4+T细胞的比例超过或者等于0.03%的阈值时，将受试者视为是有响应的。如果在接种疫苗前能检测到细胞因子的分泌，则在至少表达IL-2的⑶40L+CD4+T细胞的比例比基线水平高至少两倍时，将受试者视为是有响应的。
图7A-B显示了接种了疫苗的经历过ART的患者中，在(A)接种前(每对数据的左侦牝显示为浅黄色)和第2个剂量后两周(第44天，每对数据的右侧，显示为深桔色)的F4特异性CD40L+CD4+T细胞的细胞因子共表达谱，(B)所有时间点的饼形图。结果表示为表达1、2或3种细胞因子(IL-2、TNFa或者IFN Y )的F4特异性⑶40L+⑶4+T细胞的百分比。图8A-D显示了给予F4co后的⑶8+T细胞反应。图板A显示了经历过ART的患者组中表达选自⑶40L、IL-2、TNF a和/或IFN Y中的至少一种标记物的F4特异性⑶8+T细胞的百分比。图板B显示了未经历ART的患者组中表达选自⑶40L、IL-2、TNF a和/或IFNy中的至少一种标记物的F4特异性⑶8+T细胞的百分比。图板C显示了经历过ART的患者组中表达选自⑶40L、IL-2、TNF a和/或IFN Y中的每一种标记物的F4特异性⑶8+T细胞的百分比。图板D显示了未经历ART的患者组中表达选自⑶40L、IL-2、TNF a和/或IFN Y中的每一种标记物的F4特异性⑶8+T细胞的百分比。图9显示了未经历的ART患者组(总接种组)在第2剂量后两周时，病毒载量与至少表达IL-2的F4特异性⑶4+⑶40L+T细胞发生率之间的关联。每个点对应来自给定受试者的数据。 图10A-B显示了经历过ART的组给药后12个月期间对F4c0的体液反应，按总体的分组(图板A)和按抗原的分组(图板B)。对所有图形，F4/AS01以顶端的线(桔色)代表，安慰剂以底部的线(灰色)代表。图1lA-B显示了未经历ART的组给药后12个月期间对F4c0的体液反应，按总体的分组(图板A)和按抗原的分组(图板B)。对于图板A和图板B的p24，顶端的线代表F4/AS01 (桔色)，底部的线代表安慰剂(灰色)。对于RT、Nef和pl7，顶端的线代表安慰剂(灰色)，底部的线代表F4/AS01 (桔色)。发明详述自然史研究表明⑶8+T细胞反应在控制原发性病毒血[Borfrow，1994]和疾病的进化[Harrer，1996]中有重要的作用。⑶8+T细胞是清除感染了病毒的细胞的主要免疫效应机制。已经在SIV猴模型中展示了试验性地使CD8+T细胞耗尽导致对已建立的病毒感染失去控制[Jin，1999]。因此，本发明的一个目的是防止感染HIV-1的受试者中⑶8+T细胞的损耗。⑶4+T细胞似乎对于维持⑶8+T细胞反应有重要作用。⑶4+T细胞的帮助是引发和有效地分化效应和记忆⑶8+T细胞所必需的[Janssen, 2003; Sun, 2004]。急性HIV-1感染后HIV-1特异性CD8+T细胞增殖的丧失可以在体外通过加入在急性感染过程中分离的自体同源CD4+T细胞得到恢复，更重要的是在体内通过疫苗诱发的HIV-1特异性CD4+T细胞恢复[Lichterf ield, 2004]。近期的报道表明多功能HIV特异性CD4+T细胞与长期无进展表现型(LTNP)相关，即被感染的受试者在没有ART的情况下维持在慢性、无症状时期[Potter, 2007; Kannanganat, 2007]。LTNP常常是病毒控制者，即被感染的受试者在没有干预的情况下保持低病毒载量，并且这些低病毒载量通常与高⑶4+T细胞计数相关。例如，在LTNP中进行的研究建立了表达至少两种到三种细胞因子的高水平CD4+T细胞与非进展性疾病和低病毒载量之间的相关性[Kannanganat, 2007;Boaz, 2002;Harari, 2004Iyasaer
e,2003] ο此外，记忆CD4+T细胞(IL-2+)可能在HIV感染中有保护作用[Younes，2003]，这些细胞的强烈增殖反应与低病毒载量相关[Lichterf ield，2004]。因此，多功能T细胞反应的诱导在CD8+T细胞活性和病毒载量管理中起着重要作用。令人惊奇的是给予本发明的疫苗在经历过ART和未经历ART的HIV-1感染受试者中均诱导了高水平的多功能CD4+T细胞。此外，还发现与给予安慰剂的感染HIV-1的受试者相比，给予本发明的疫苗还导致更低的病毒载量。在不局限于这个假设的情况下，我们相信发明所述方法中诱导的多功能CD4+T细胞反应与感染HIV-1的受试者中的病毒载量的下降之间有相关性。因此，本发明的一个目的是提供能够诱导⑶4+T细胞的方法和免疫原性组合物，所述⑶4+T细胞能够在组合物被给予感染了 HIV-1的受试者后特异识别组合物中的至少一种多肽。例如，给药后受试者与给药前相比，识别Gag、Pol和/或Nef的CD4+T细胞水平增力口。合适的情况下，反应的提高或者“更高”的反应是新发生的(当不存在给药前的已有反应时，任何增加都是)或者是给药后已有反应的显著增加，比如两倍或以上的提高或者统计学显著的提高。具有这些提高的⑶4+反应水平的受试者被认为是“响应者”，发明的一个目的是免疫原性组合物在至少20%感染了 HIV-1的受试者中诱导这样的反应。合适地，在给予本发明的免疫原性组合物后，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或者100%受试者是响应者。在一个实施方案中，至少75%的受试者是响应者。发明的再一个目的是提供在被给予感染了 HIV-1的受试者后能够诱导⑶4+T细胞中活化标记物的表达的方法和免疫原性组合物。例如，CD4+T细胞表达的活化标记物与长期无进展者和病毒控制者的⑶4+T细胞中表达的那些一致。在一个实施方案中，⑶4+T细胞活化标记物包括⑶40L、IL_2、TNFa和IFN Y。合适地，表达了一个、两个、三个或者全部四个标记物。

本文还提供了恢复CD8+T细胞的功能或者抑制功能丢失的方法和免疫原性组合物，比如感染了 HIV-1的受试者中HIV-1特异性⑶8+T细胞的活化。例如，正如通过测量HIV-1特异性抗原识别、增殖的提高、持续性的提高和/或活化标记物的表达，给予所述免疫原性组合物直接激活了 CD8+T细胞反应。“抗原”意味着在给予受试者时会引发抗该抗原的特异性免疫反应的物质。例如，HIV抗原是能够引发对HIV蛋白、其衍生物或片段的特异性免疫反应的HIV蛋白、其衍生物或片段。在一个实施方案中，抗原可以是编码蛋白(例如HIV蛋白、其衍生物或片段)的多核苷酸。替代直接的CD8+T细胞反应或者在此之外，本发明的免疫原性组合物能够诱导CD4+T细胞反应,后者可以恢复CD8+T细胞功能或者抑制所述功能的丧失。以上描述了这种⑶4+T细胞反应。本发明还提供了方法和组合物，可以用于减少感染了 HIV-1的受试者的病毒载量或者抑制病毒载量的预期增长。在不局限于所述理论的情况下，相信本发明的免疫原性组合物能够诱导免疫反应，比如以上描述的CD4+T细胞或CD8+T细胞反应，所述T细胞反应会抑制HIV-1生命周期中的至少的阶段，从而导致病毒载量不会象预期的那样随着时间增力口。因为病毒载量与疾病的进展密切相关[Mellors et al., 1996; Fraser et al，2007],正如在长期无进展者中看到的，稳定或者减少病毒载量使被感染受试者能够维持健康。
因此，本发明的一个目的是通过给予本文描述的免疫原性组合物稳定或者减少感染了 HIV-1的受试者的病毒载量。在一个实施方案中，与类似的被感染受试者群体相比，受试者的病毒载量比预期增加得少。在另一个实施方案中，受试者的病毒载量得到稳定，即比给药时的病毒载量没有显著增加。在另一个实施方案中，给药后病毒载量下降。“稳定”意味着受试者的病毒载量与给予发明所述组合物前的病毒载量没有5%以上的变化。“减少”意味着受试者的病毒载量比给予发明所述组合物前的病毒载量低5%以上。例如，减少可以意味着比给予发明所述组合物前的病毒载量低6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或99.5%。本发明还提供了通过诱发免疫反应阻止感染了 HIV-1的受试者中的HIV疾病发展的方法和组合物，所述免疫反应能够阻止受试者的病毒载量增加到100，000拷贝/ml以上。100，000拷贝/ml以上的病毒载量与HIV疾病的进展关联，而10，000-99，999之间的病毒载量风险较低，优选少于30，000拷贝/ml。希望病毒载量低于10，000拷贝/ml、1000拷贝/ml 或者 500 拷贝/ml。“Determining Risk of Disease Progression，，，2007，aidsetc.0rg/aidsetc page=cm-106_cd4_stage 有提供,最后一次是在 2010 年 9 月 23 日登录。以上描述的对病毒载量的抑制希望能够持续临床上有意义的时间，比如从一个月到试或更多年。在一个实施方案中，抑制持续了至少四个月。在再一个实施方案中，抑制持续了至少六个月、至少十二个月、至少十八个月、至少两年、至少三年、至少四年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年或者至少十年。病毒载量，包括储藏(已经整合的)病毒载量，可以利用多种不同方法来测量，包括许多商品检测方法。这些检测方法包括定量PCR法、支链DNA法和血斑点法。可以替代以能够定量被感染受试者中存在的HIV量的其他方法。这些检测方法包括p24抗原法和逆转录酶法。可以利用任何合适的测试方法来定量被感染受试者中的HIV量。对 于本文描述的任何方法或检测法，可以使用实施例中提供的分析方法。本发明的再一个目的是缺乏抗逆转录病毒疗法(ART)的情况下，提供能够防止感染了 HIV-1的受试者中HIV疾病进一步发展的方法和免疫原性组合物。虽然ART对于控制HIV疾病比较有效，但这种疗法有明显的局限性，包括药物抗性、严重的副作用、难以依从、成本和可得性，特别是在发展中国家。因此，仍然需要能够克服这些局限性的长期管理方法。“抗逆转录病毒疗法(ART) ”意味着用于控制HIV-1疾病的进展的任何疗法，例如核苷酸和非核苷酸逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、进入抑制剂、成熟抑制齐U、细胞抑制剂和整合酶链转移抑制剂。这类药物包括拉米夫定(Iamivudine)和齐多夫定(zidovudine)、恩曲他滨(emtricitabine) (FTC)、齐多夫定(ZDV)、叠氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)、扎西他滨(zalcitabine)、双脱氧胞苷(ddC)、富马酸替诺福韦二卩比呋酯(tenofovir disoproxil fumarate) (TDF)、二脱氧肌苷(ddl)、司他夫定(stavudine)(d4T)、硫酸阿巴卡韦(abacavir sulfate) (ABC)、依曲韦林(etravirine)、地拉韦定(delavirdine) (DLV)、依法韦仑(efavirenz) (EFV)、奈韦拉平(nevirapine) (NVP)、安普那韦(amprenavir) (APV)、替拉那韦(tipranavir) (TPV)、英地那韦(indinavir) (IDV)、赛科纳瓦(saquinavir)、甲磺酸沙奎拉韦(saquinavir mesylate) (SQV)、洛匹那韦(1pinavir) (LPV)、利托那韦(ritonavir) (RTV)、福沙那韦I丐片(fosamprenavir calcium)(FOS-APV)、利托那韦、RTV、达如那韦(darunavir)、硫酸阿扎那韦(atazanavir sulfate)(ATV)、甲横酸奈非那韦(nelfinavir mesylate) (NFV)、恩夫韦妝(enfuvirtide)、T-20、马拉韦罗(maraviroc)和雷特格韦(raltegravir)。ART药物还可以包括祀向与疾病进展相关的HIV蛋白或细胞蛋白的抗体，比如ibalizumab。还包括基于免疫的疗法，比如IL-2、IL-12和a-epibromide。这些药物中的每一种可以单独给药或者与其他ART药物组合物给药。关于ART药物以及它们的给药的信息在许多药典中可以找到，比如United StatesPharmacopeia(USP)或者网上链接，比如 www.aidsmeds.com(2010 年 9 月 23 日登录)。在一个实施方案中，给予本发明的免疫原性组合物后，受试者的病毒载量如上所述在没有ART的情况下保持稳定或者下降。在另一个实施方案中，给予免疫原性组合物如上所述诱导了对HIV特异性的CD4+T细胞反应。在另一个实施方案中，给予免疫原性组合物如上所述诱导了 CD4+T细胞中活化标记物的表达。在另一个实施方案中，给予免疫原性组合物如上所述诱导了对HIV特异性的CD8+T细胞反应。在另一个实施方案中，给予免疫原性组合物如上所述恢复了 CD8+T细胞的功能或者抑制了所述功能的丧失。合适地，任意或者所有以上实施方案可以组合。在实施方案中，给药后在没有ART的情况下，受试者的HIV-1疾病状态没有进展为临床疾病。可以通过多种方式对临床疾病进行监测，比如通过测量受试者的病毒载量和/或CD4+T细胞计数，以及疾病的病理学表现，比如HIV相关的增殖紊乱和/或机会性感染。在再一个实施方案中，受试者的HIV-1疾病状态没有进展到推荐开始ART的临界状态，比如10，000拷贝/ml以上的病毒载量和/或少于500个细胞/mm3、少于350个细胞/mm3或者少于200个细胞/mm3的⑶4+T细胞计数。本发明的一个实施方案中，受试者未经历过ART。这些受试者以前或者当前没有经过ART治疗。在另一个实施方案中，受试者接受过ART。这些受试者可以是在给予本发明的免疫原性组合物之前经过ART治疗，但不与它同时进行(ART中断)。在一些实施方案中，受试者同时接受ART。同时并不意味着ART治疗和给予要求保护的组合物必须同时发生，而是表示受试者在给药 时还遵循ART治疗方案，无论是否严格依从。本发明的一个目的是与类似的被感染受试者群体相比，延迟感染HIV-1的受试者对ART的需要。在一个实施方案中，ART治疗被延迟了至少四个月。在再一个实施方案中，ART治疗被延迟了至少六个月、至少十二个月、至少十八个月、至少两年、至少三年、至少四年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年或者至少十年。这种延迟对于未经历过ART的受试者可以是初始ART治疗的延迟,对于接受过ART的受试者是重新开始ART治疗的延迟。在一个实施方案中，受试者可以交替进行ART治疗和要求保护的方法和组合物，从而在治疗方式之间循环。本发明的再一个目的是给有需要的感染了 HIV-1的受试者提供用于治疗的组合物，比如具有特定CD4+T细胞计数或属性、特定CD8+T细胞计数或load、特定病毒载量、特定治疗状态或者具有任何有助选择合适受试者的参数的受试者。例如，可以根据是否未经历ART、接受过ART、ART难治和/或ART不依从来选择受试者。本发明的另一个目的是通过由于病毒逃逸减少病毒复制和/或ART不依从来降低ART抗性HIV菌株的发生。通过提供不同的病毒控制方式，可以避免这类ART抗性HIV的发生。
免疫原性组合物此处公开了适用于发明方法的免疫原性组合物。HIV-1基因组编码多种不同的蛋白，这些蛋白中的每一个都可以整体上或者作为片段是免疫原性的。包膜蛋白包括例如gpl20、gp41和Env前体gpl60。HIV-1的非包膜蛋白包括例如内部结构蛋白(比如gag和pol基因的产物)和其他非结构蛋白(比如Rev、Nef、Vif和 Tat)。因为⑶4+T细胞反应对HIV-1进展的免疫控制很重要，HIV-1抗原可以含有至少一个，优选一个以上CD4+T细胞表位。含有最多数量的保守T细胞表位的病毒抗原是Gag、Pol和Nef。替代地，或者除了⑶4+T细胞表位，抗原可以含有B细胞表位(比如在Env多肽中提供)和/或CD8+T细胞表位。发明的免疫原性组合物包含这些抗原中的一或多个。这些抗原可以与一或多个融合多肽组合，或者分开提供或者作为混合物。在实施方案中，发明的免疫原性组合物包含一或多个含有Nef的多肽。HIV-1Nef是早期蛋白，即它在感染的早期，没有结构蛋白的情况下被表达。Nef基因编码早期辅助性HIV-1蛋白，该蛋白经证实具有多种活性。例如，已知Nef蛋白能够导致⑶4、HIV-1受体和来自细胞表面的I型MHC分子的下调，虽然这些功能的生物学意义仍未确定。此外，Nef与T细胞的信号途径相互作用并诱发活性状态，然后这种活性状态又会促进更高效的基因表达。一些HIV-1分离株含有位于该区域的突变，导致它们不能编码有功能的蛋白，严重破坏了它们的体内复制和致病性。提到Nef是指全 长Nef和全长Nef的片段、变体和衍生物。该术语还包括含有Nef的多肽，包括含有Nef的片段、变体和衍生物的多肽。在实施方案中，发明的免疫原性组合物包含一或多个含有Pol的多肽。Pol基因编码两个蛋白，具有病毒早期感染所需要的两种活性，即RT和病毒DNA整合到细胞DNA中需要的整合酶蛋白。Pol的主要产物被毒粒蛋白酶切割产生氨基端RT肽，该肽含有DNA合成所需要的活性(RNA和DNA依赖性DNA聚合酶活性以及RNase H功能)，和羧基端整合酶蛋白。因此RT是Pol片段的例子。HIV-1RT是全长RT (p66)和缺少羧基端RNase H结构域的切割产物(p51)的异二聚体，p66和p51也是Pol片段的例子。提到Pol是指全长Pol和全长Pol的片段、变体和衍生物。该术语还包括含有Pol的多肽，包括含有Poi的片段、变体和衍生物的多肽。在实施方案中，Pol包含RT片段。RT片段是Pol片段的例子。提到RT是指全长RT和全长RT的片段、变体和衍生物。该术语还包括含有RT的多肽，包括含有RT的片段、变体和衍生物的多肽。以这种方式，RT可以包含p66片段、p51片段，和/或p66和/或p51的片段、变体和衍生物。在实施方案中，发明的免疫原性组合物包含一或多个含有Gag的多肽。Gag基因被翻译成前体多聚蛋白，经蛋白酶切割后产生的产物包括基质蛋白(P17)、衣壳(p24)、核衣壳(p9)、p6和两个间隔臂肽(p2和pi)，所有这些都是Gag片段的例子。Gag基因产生55千道尔顿(kD)的Gag前体蛋白，又称为p55，它是由未剪接的病毒mRNA表达的。在翻译过程中，p55的N端被豆蘧酰化，引发它与细胞膜的胞质面相连。膜关联的Gag多聚蛋白召集两个拷贝的病毒基因组RNA以及其他病毒和细胞蛋白，从而引发病毒粒子从感染细胞表面出芽。出芽后，P55被病毒编码的蛋白酶(pol基因的一个产物)在病毒成熟的过程中切割成四个更小的蛋白，被命名为MA(基质[pl7])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])和p6，它们都是Gag片段的例子。pl7(MA)多肽来自p55的N端豆蘧酰化末端。多数MA分子保持与毒粒脂双层内表面的附着，使病毒粒子稳定。MA的一个子集被召集到毒粒更内层，在此它成为复合体的一部分，护送病毒DNA到达细胞核。由于MA上的亲核信号能被细胞核输入机制所识别，这些MA分子能够协助病毒基因组的核运输。这个现象使得HIV-1能够感染非分裂细胞，对于逆转录病毒是一个很不寻常的特性。p24(CA)蛋白形成病毒粒子的圆锥形核心。已证实亲环蛋白A能与p55的p24区域相互作用导致它被并入HIV-1颗粒中。Gag和亲环蛋白A之间的相互作用很关键，因为利用环孢菌素A打断这个相互作用会抑制病毒的复制。Gag的NC区域负责特异识别HIV-1的所谓包装信号。包装信号由位于病毒RNA5，端附近的四个茎环结构组成，能够有效介导异源RNA整合到HIV-1毒粒中。NC通过两个锌指基元介导的相互作用与包装信号结合。NC还能促进逆转录。p6多肽区介导p55Gag和辅助蛋白Vpr之间的相互作用，导致Vpr被并入正在组装的毒粒中。p6区还含有所谓 的晚期结构域，是出芽毒粒从被感染细胞完全释放所必需的。提到Gag是指全长Gag和全长Gag的片段、变体和衍生物。该术语还包括含有Gag的多肽，包括含有Gag的片段、变体和衍生物的多肽。在实施方案中，Gag包含p55前体蛋白。提到p55是指全长p55和全长p55的片段、变体和衍生物。该术语还包括含有P55的多肽，包括含有p55的片段、变体和衍生物的多肽。以这种方式，P55可以包含pl7片段、p24片段、p9片段、p6片段；和/或pl7、p24、p9和/或p6的片段、变体和衍生物；以及包含所述片段、变体或衍生物的多肽。在实施方案中，Gag是pl7。在实施方案中，Gag是p24。在实施方案中，Gag包含作为独立蛋白抗原成分或者融合在一起的pl7和p24。合适地，P17和p24被融合在一起，通过一个异源氨基酸序列隔开。在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含HIV包膜蛋白(Env)或其片段或衍生物。本发明中描述的抗原是全长抗原，例如全长Nef、全长Pol、全长Gag。发明还涵盖不是全长的抗原，包括能够或者不能对应全长的抗原片段或变体。合适地，片段是免疫原性片段，变体是免疫原性变体。一般来说，“片段”(无论是否是免疫原性的)都含有来自它们是其片段的多肽的连续氨基酸序列，所述多肽包含HIV抗原。合适地，片段含有至少5-8个氨基酸、至少9-15个氨基酸、至少20、至少50或者至少100个连续氨基酸来自它们作为其中的片段的多肽。“免疫原性片段”用于本文包括抗原的至少一个T细胞表位或B细胞表位，并且显示出HIV-1抗原性。这类片段能够在分离状态或者用合适的构建体呈递(比如融合了其他HIV-1表位或抗原，融合了可能是蛋白性和/或免疫原性的融合伙伴，或者在载体上或者载体中呈递时)时，诱发抗天然抗原的免疫反应。术语“变体”用于本文包括与其不是变体的对应分子相比，发生了有限的改变的多肽。这包括改变了多肽性能的点突变，例如通过提高表达系统中的表达或者除去不需要的活性，包括不需要的酶活性。然而，包含HIV-1抗原的多肽变体必须维持与天然多肽的足够相似性，这样才能保持免疫原性组合物或疫苗所需要的抗原性，从而仍然能够引起抗天然抗原的免疫反应。一个特定变体是否能够引发这类免疫反应可以通过合适的免疫学检验来测量，比如ELISA (对于抗体反应)或者利用合适的细胞标记物和细胞因子染色进行流式细胞术(对细胞反应)。合适地，根据本发明的“变体”包含一或多个氨基酸的添加、缺失或取代。它们涵盖被截短的抗原，即抗原的C端和/或N端被切除了一或多个氨基酸。合适地，“变体”包括那些抗原的C端和/或N端被切除了 1-5个氨基酸、6-10个氨基酸、11-15个氨基酸、16-20个氨基酸、21-25个氨基酸或者25个以上氨基酸的截短分子。本发明的变体可以引入一或多个氨基酸的一或多个缺失、添加或取代。相应地，抗原的截短分子可以另 外包含肽的其他部分的一或多个氨基酸缺失、添加或取代。本发明的变体还包含与Nef、Pol和/或Gag的多肽序列有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的多肽序列。在本发明的实施方案中，免疫原性组合物包含含有一或多个抗原的两个多肽、含有一或多个抗原的三个多肽、含有一或多个抗原的四个多肽或者含有一或多个抗原的五个或更多个多肽。Nef、Pol和/或Gag中的每一个可以在免疫原性组合物中出现一次以上。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含两个或以上含有Nef的多肽，两个或以上含有Pol的多肽和/或两个或以上含有Gag的多肽。在再一个实施方案中，一或多个多肽中的每一个可以包含Nef、Pol和/或Gag中的一个、Nef、Pol和/或Gag中的两个、Nef、Pol和/或Gag中的三个、Nef、Pol和/或Gag中的四个等等。如果组合物中存在一个以上的多肽，每个多肽可以包含相同数量和/或组成的抗原，或者每个多肽可以包含不同数量和/或组成的抗原。如果组合物中有三个或以上的多肽，两个或以上的多肽可以包含相同数量和/或组成的可以，而其余多肽包含不同数量和/或组成的抗原。众多记载表明这些抗原的多肽序列在不同病毒株(包括来自不同HIV-1亚型的病毒株)之间保守性很高。在实施方案中，组合物中的多肽来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K型的HIV-1株，或者HIV-1的流行重组形式(CRF)。在实施方案中，多肽是来自相同亚型的，t匕如B型。在另一个实施方案中，多肽来自两个或以上的亚型。在再一个实施方案中，多肽来自与受试者感染的HIV-1株相同的亚型。在另一个实施方案中，至少一个多肽来自与受试者感染的HIV-1株不同的亚型。在再一个实施方案中，所有多肽都和受试者感染的HIV-1株来自不同的亚型。每个HIV-1亚型和病毒株的参照序列可以容易地从各种众所周知的基因数据库得至1J，t匕如在 www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank/ 登录的 Genbank 或者 www.uniprot.0rg/ 登录的UniProt数据库(都在2011年9月21日登录)。例如，可以在这些数据库中找到本发明的每个亚型和/或病毒株的每个抗原的序列。W02006/013106中公开了融合蛋白，所述融合蛋白包含本发明的免疫原性组合物中可以存在的一或多个抗原，该申请通过引用并入本文。抗原Pol、Nef、Gag以及它们的变体和片段以前曾被选中包含在融合蛋白中以用于免疫原性组合物中，因为认为它们在不同HIV病毒株中保守性较好，因此比保守性差一些的抗原更可能与来自不同HIV病毒株的抗原发生交叉反应。但是，融合蛋白中引入这些抗原可能带来无法预测的后果，因为其中的抗原没有对应的天然蛋白。相应地，融合蛋白并不易于制备，并且不能假定它们与天然蛋白的工作方式相同。在本发明的实施方案中，免疫原性组合物中的两个、三个、四个或更多个抗原融合形成融合蛋白。合适地，Gag被融合到Pol上或者Pol被融合到Gag上，Pol被融合到Nef上或者Nef被融合到Pol上，和/或Nef被融合到Gag上或者Gag被融合到Nef上。合适地，在本发明的融合蛋白中，Gag是P17和/或p24，和/或Pol是RT。具体来说，将免疫原性组合物中的抗原融合形成融合蛋白是方便的，所述融合蛋白包含处于任何顺序的Nef、RT、pl7和p24。合适地，抗原被融合形成包含p24-RT-Nef-pl7的融合蛋白。这样的融合蛋白被称为F4。融合蛋白中的抗原可以直接相互融合或者借助连接分子融合。这类连接分子可以包含含有一或多个氨基 酸的异源氨基酸序列。融合蛋白中的抗原可以来自相同的HIV病毒株，可以来自相同HIV-1亚型中的不同病毒株，或者可以来自不同HIV-1亚型中的不同病毒株。合适地，融合蛋白中的抗原来自两个、三个或四个不同HIV-1亚型中的HIV-1病毒株。替代地，融合蛋白中的所有抗原来自相同HIV-1亚型中的HIV-1病毒株(们)。发明所述的肽可以与其他抗原联用。具体来说，这包括HIV-1env蛋白及其片段或变体。优选的env形式是gpl20、gpl40和gpl60。所述env可以是例如W000/07631中描述的来自被称为R2的HIV-1B亚型包膜克隆的包膜蛋白，或其片段或变体。Env也可以是被称为W61.D的gpl20克隆，或其片段或变体。因此发明还提供了根据发明还包含HIV-1env蛋白或其片段或变体的免疫原性组合物。为了清楚起见，这里使用的术语“片段”和“变体”的含义与上文的定义相同。在实施方案中，本发明的包含融合蛋白的免疫原性组合物还包含一或多个含有抗原的非融合多肽。合适地，非融合多肽中的抗原所来自的HIV-1病毒株与融合蛋白中的至少一个抗原来自的是相同亚型。替代地，非融合多肽中的抗原所来自的HIV-1病毒株与融合蛋白中的一或多个亚型不同。合适地，非融合多肽包含Env。例如，所述非融合多肽包含gpl20、gpl40或gpl60中的一或多个。HIV-1包膜糖蛋白gpl20是用于附着在宿主细胞上的病毒蛋白。gpl20蛋白是中和抗体以及抗体依赖性细胞性细胞毒(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的病毒抑制(ADCVI)的主要靶点，但是蛋白中最常被抗体识别的区域(V3环)也是蛋白中最多变的部分。gpl20蛋白还含有能被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位。这些效应细胞能够清除感染了病毒的细胞，因此构成了第二种主要的抗病毒免疫机制。较之中和抗体的靶点区域，CTL的某些表位在不同HIV-1病毒株之间似乎较为保守。因为这个原因，gp41、gpl20和gpl60可以作为用于引发细胞介导的免疫反应(特别是CTL)的疫苗中的抗原成分。本发明的免疫原性组合物或疫苗含有免疫保护量或免疫治疗量的多肽，可以通过常规技术进行制备。在实施方案中，单个剂量免疫原性组合物中每个抗原的总量是0.5_25μ8、2-20 μ g、5_15 μ g 或大约 10 μ g。合适地，单个剂量免疫原性组合物中的融合蛋白的总量是10μ g，和/或单个剂量免疫原性组合物中的非融合多肽的总量是20 μ g0在实施方案中，单个剂量免疫原性组合物中所有抗原的总量是0.1μ g-ΙΟΟμ g、0.5-50 μ g,2-40 μ g,5-30 μ g,7-20 μ g,例如所有抗原的总量可以是大约100 μ g、大约90 μ g、大约80 μ g、大约70 μ g、大约60 μ g、大约50 μ g、大约40 μ g、大约30 μ g、大约20 μ g或者大约10 μ g。免疫原性组合物剂量中的蛋白含量要挑选能够在典型受体中诱发免疫反应，但不带来明显的有害副作用的量。根据采用的具体免疫原和所选的给剂或接种方案，这个量会有所变化。通过包括对受试者中的相关免疫反应进行观察的标准研究可以明确特定免疫原性组合物的最佳用量。佐剂Vaccine Design the Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell andNewman, Plenum Press, New York, 1995中概括描述了佐剂,该文献通过引用并入本文。作为免疫刺激剂的例子的佐剂是指免疫原性组合物中能够加强或者强化对抗原的(抗体和/或细胞介导的)特异性免疫反应的成分。佐剂可以诱发Thl型和Th2型免疫反应。Thl型细胞因子(例如IFN-Y、IL_2和IL-12)倾向于诱发细胞介导的针对给定抗原的免疫反应，而Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、11-6、IL-10)倾向于诱发对抗原的体液免疫反应。在本发明中，佐剂是优选的Thl免疫反应的诱导剂。Thl和Th2型免疫反应的区别不是绝对的。现实中,个体支持的免疫反应会被描述为Thl优势型或Th2优势型。但是,根据Mosmann and Coffman (通过引用并入本文)描述过的鼠CD4+T细胞克隆来考虑细胞因子的家族往往是方便的。传统上，Thl型应答与T淋巴细胞产生INF- Y和IL-2细胞因子关联。其他经常直接与Thl型免疫反应的诱导相关的细胞因子不是由T细胞产生的，比如IL-12。促进Thl优势型反应的合适佐剂系统包括:单磷酰脂质A或其衍生物(或者一般的脱毒的脂质A参见例如美国专利申请公开2008/138359，该申请通过引用并入本文)，尤其是3-脱O-酰基化的单磷酰脂质A(3D-MPL)(其制备见美国专利4，912，094，该专利通过引用并入本文)；和单磷酰脂质A (优选3-脱O-酰基化的单磷酰脂质A)与铝盐(例如磷酸铝或者氢氧化铝)或者水包油乳剂的组合。在这种组合中，抗原和3D-MPL被包含在相同的颗粒结构中，从而能够更有效地递送抗原性和免疫刺激性信号。研究显示3D-MPL能够进一步加强明矾吸附的抗原的免疫原性[Thoelen et al.1998 ；美国专利5，776，468，两份文献均通过引用并入本文]。加强型系统 包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，特别是W094/00153(通过引用并入本文)中公开的QS21和3D-MPL的组合；或者致反应性较低的组合物，其中象美国专利6，846，489(通过引用并入本文)中描述的用胆固醇对QS21进行了抑制。美国专利6，146，632中描述了一种特别强力的在水包油乳剂中包含QS21、3D-MPL和生育酚的佐剂制齐U。在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含可以是QS21的皂苷。制剂还可以包含水包油乳剂和生育酚(美国专利6，146,632)。在一个实施方案中，制剂含有MF59这种含有角鲨烯的水包油乳剂。在本发明的实施方案中，佐剂包含的一或多个成分选自有免疫活性的皂苷组分和/或脂多糖和/或免疫刺激性寡核苷酸。在实施方案中，佐剂包含有免疫活性的皂苷组分和脂多糖。合适地，所述有免疫活性的皂苷组分是QS21，和/或所述脂多糖是脂质A衍生物。合适地，脂质A衍生物是3D-MPL。合适的佐剂是3D-MPL和QS21的组合(美国专利5，750，110，通过引用并入本文)，包含3D-MPL和QS21的水包油乳剂(美国专利6，146，632，W098/56414)或者与其他载体一起配制的3D-MPL(美国专利5，776，468，通过引用并入本文)。3D MPL 可以从 GlaxoSmithKline Biologicals North America 获得，它主要促进带有IFN-Y (Thl)表现型的⑶4+T细胞应答。可以根据美国专利4，912，094中公开的方法进行制备。从化学上讲，它是带有3、4、5或6个酰基化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。优选本发明的组合物中使用的是小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL的颗粒大小使得它可以通过0.22 μ m的滤膜进行过滤除菌。这种制品在美国专利5，776，468中有描述，该专利通过引用并入本文。适合本发明使用的另一种佐剂是Quil A及其衍生物。Quil A是从南美树种智利阜荚树(Quilaja Saponaria Molina)分离的阜苷制品，由Dalsgaard等在1974 年首次描述具有佐剂活性(“Saponin adjuvants” , Archiv.fiir die gesamteVirusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243_254,通过引用并入本文)。已经通过HPLC分离到保持了佐剂活性而没有QuilA相关毒性的纯化Quil A片段(美国专利5，604，106，通过引用并入本文)，例如QS7和QS21(又称为QA7和QA21)。QS21是从智利皂荚树的树皮得到的天然皂苷，能够诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)、Thl细胞和优势型IgG2a抗体反应，是就本发明来说优选的皂苷。具体的特别合适的QS21制剂已有描述，这些制剂包含固醇(美国专利6，846，489，通过引用并入本文)。构成本发明一部分的皂苷在与胆固醇和脂质配制时，可以是分开的胶束形式、混合的胶束(优选但不是排他地含有胆汁盐)或者是ISCOM母体的形式(美国专利4，578，269，通过引用并入本文)、脂质体或相关的胶体结构，比如虫样的或者环样的多聚复合体或者脂质/层状结构和片层，或者处于水包油乳剂的形式(例如象美国专利6，146，632中那样，该专利通过引用并入本文)。皂苷可以与金属盐结合，比如氢氧化铝或者磷酸铝(美国专利6，464，489，通过引用并入本文)。加强型系统涉及单磷酰脂质A(或脱毒的脂质A)和皂苷衍生物的组合，特别是象W094/00153(通过引用并入本文)中公开的QS21和3D-MPL的组合，或者是象美国专利6，846，489中公开的其中的QS21用胆固醇进行了抑制的致反应性较低的组合物。美国专利6，146,632中描述的一种特别强力的佐剂制剂涉及在水包油乳剂中的生育酚，有或没有QS21 和 / 或 3D-MPL。
在实施方案中，佐剂包含固醇，合适的是胆固醇。合适的固醇(例如胆固醇)能够在保持皂苷的佐剂效应的情况下减少组合物的致反应性。在本发明的实施方案中，佐剂包含脂质体载体。在实施方案中，佐剂包含的皂苷和固醇的比率是皂苷:固醇在1:1-1:100 (w/w)。合适地，阜苷:固醇的比率在1:1-1:10 (w/w)或者阜苷:固醇的比率在1:1-1:5 (w/w)。在实施方案中，佐剂包含的皂苷和脂多糖的比率是皂苷:脂多糖为1:1。合适地，佐剂包含脂多糖，所述脂多糖在每剂中的量是160μ g。合适地，脂多糖在每剂中的量是50 μ g、25 μ g、10 μ g或者5 μ g。合适地，佐剂包含皂苷，所述皂苷在每剂中的量是160 μ g。合适地，皂苷在每剂中的量是 50 μ g、25y g>10y g 或者 5 μ g。在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL 剂量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3 或 0.125-0.25mg (例如 0.2-0.3,0.1-0.15,0.25 或 0.125mg)固醇(例如胆固醇)。在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30 μ g (例如5-15、40-50、10、20、30、40 或 50 μ g)脂质 A 衍生物(例如 3D-MPL)。在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30 μ g (例如5-15、40-50、10、20、30、40 或 50 μ g)皂苷(例如 QS21)。在实施方案中，佐剂在基于脂质体的制剂中包含50μ g3D_MPL和50μ g QS21。在再一个实施方案中，佐剂在基于脂质体的制剂中包含25μ g3D-MPL和25 μ g QS21。

在本发明的实施方案中，佐剂包含水包油乳剂。合适地，所述水包油乳剂包含角鲨烯和/或α生育酚。合适地，水包油乳剂是可以代谢的水包油乳剂。具体来说，水包油乳剂适合包含诸如Tween80的乳化剂。佐剂可以合适地包含皂苷和脂多糖。具体来说，佐剂可以包含皂苷:脂多糖比率在1:10-10:1 (w/w)范围的皂苷和脂多糖。佐剂可以合适地包含皂苷和固醇。具体来说，佐剂可以包含皂苷:固醇比率在1:1-1:20 (w/w)范围的皂苷和固醇。佐剂可以合适地包含皂苷和可代谢油。具体来说，佐剂可以包含可代谢油:皂苷比率在1:1-250:1 (w/w)范围的皂苷和可代谢油。佐剂可以合适地包含α生育酚。在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.5-15、1-13、2-11、4-8或5-6mg(例如2-3、5-6或10-llmg)可代谢油(比如角鲨烯)。在实施方案中，佐剂包含(每个0.51^剂量)0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、1-4或2-3mg(例如 0.9-1.1、2-3 或 4_5mg)乳化剂(比如 Tween80)。在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.5-20、l-15、2-12、4-10、5-7mg(例如11-13,5-6或2-3mg)母生育酚(比如α生育酚)。在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30 μ g (例如5-15、40-50、10、20、30、40 或 50 μ g)脂质 A 衍生物(例如 3D-MPL)。在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL 剂量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3 或 0.125-0.25mg (例如 0.2-0.3,0.1-0.15,0.25 或 0.125mg)固醇(例如胆固醇)。在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30 μ g (例如5-15、40-50、10、20、30、40 或 50 μ g)皂苷(例如 QS21)。另一个实施方案中，佐剂包含金属盐和脂质A衍生物。这类感兴趣的佐剂系统包括那些基于与脂多糖3-脱O-酰基化单磷酰脂质A组合的铝盐的佐剂。抗原和3-脱O-酰基化单磷酰脂质A可以一起吸附在相同的金属盐颗粒上或者吸附在不同金属盐颗粒上。合适地，佐剂包含(每个0.5mL 剂量)100-750、200-500 或 300-400μ g Al，例如处于磷酸铝的形式。在这类实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60，10-50或20-30 μ g (例如 5-15、40-50、10、20、30、40 或 50 μ g)脂质 A 衍生物(例如 3D-MPL)。在本发明的实施方案中，佐剂包含含有CpG基元的免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可以用于本发明的免疫原性组合物中。用于佐剂或本发明的免疫原性组合物中的优选寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，优选所述寡核苷酸含有两个或以上的二核苷酸CpG基元，所述基元被至少三个，更优选至少六个或以上的核苷酸隔开。CpG基元是胞嘧啶核苷酸跟着一个鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸一般是脱氧核苷酸。在优选实施方案中，寡核苷酸中的寡核苷酸间是二硫代磷酸酯，或者更优选硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯和其他核苷酸间连键也在发明的范围内。还包括在本发明范围内的是带有混合核苷酸间键合的寡核苷酸。制备硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在美国专利5，666，153,5, 278，302和W095/26204中有描述，这些文献均通过引用并入本文。

优选的寡核苷酸的例子含有以下序列。这些序列优选含有硫代磷酸修饰的核苷酸间键合。0LIG01(SEQ ID NO:1):TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG1826)0LIG02(SEQ ID NO:2):TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG1758)0LIG03(SEQ ID NO:3):ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG0LIG04(SEQ ID NO:4):TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG2006)0LIG05(SEQ ID NO:5):TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG1668)0LIG06(SEQ ID NO:6):TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG5456)替代的CpG寡核苷酸可以包含以上的优选序列，其中含有不连续的缺失或添加。本发明使用的CpG寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法合成(例如，参见EP468520，通过引用并入本文)。这类寡核苷酸可以方便地利用自动合成仪来合成。给药药物组合物的给药可以采取一个或者一个以上的单独剂量，例如以含有相同多肽的组合物的重复剂量，或者异质“初免-强化”接种方案的形式。在实施方案中，发明的免疫原性组合物首先以两个或三个剂量给予受试者，其中所述剂量间隔一周、两周、三周、四周、五周、六周、八周、十周或十二周的时间。合适地，齐U量之间间隔四周。合适地，将组合物每6-24或9-18个月(例如每年)一次给予受试者(例如作为加强剂)。例如，将组合物以6个月或I年的间隔给予受试者(例如作为加强剂)。合适地在这方面，之后将组合物给予受试者能够加强先期给予相同受试者的组合物所引发的免疫反应。合适地，组合物是初免剂量。替代地，组合物是强化剂量。
合适地，给予了两个或更多个初免和/或强化剂量。异质初免-强化方案在初免和强化步骤中给予的是不同形式的免疫原性组合物或疫苗，其中每个本身可以包括两次或更多次给药。初免组合物和强化组合物有至少一个共同的抗原，虽然不一定是抗原的相同形式，但可以是相同抗原的不同形式。根据本发明，初免强化接种可以是同质初免强化方案或者异质初免强化方案。同质初免强化方案使用相同的组合物进行初免和强化，例如本发明的免疫原性组合物。异质初免强化方案可以用基于蛋白和DNA的制剂组合进行。这种策略被认为可以有效地诱发广泛的免疫反应。含有佐剂的蛋白疫苗主要诱发抗体和CD4+T细胞免疫反应，而以质粒或重组载体来递送DNA可以诱发强烈的CD8+T细胞反应。因此，联合接种蛋白和DNA可以提供更多样的免疫反应。这对HIV来说特别相关，因为抗体(中和抗体以及那些与ADCC和ADCVI关联的抗体)、⑶4+T细胞和⑶8+T细胞被认为对于抗HIV-1的免疫防御很重要。例如，DNA可以以腺病毒载体进行递送。在发明其他方面中，本发明的免疫原性组合物是疫苗组合物。New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller etal., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A.1978 中概括描述了疫苗的制备，该文献通过引用并入本文。文中与本发明的“免疫原性组合物”相关的实施方案也适用于与本发明的“疫苗”相关的实施方案，反之亦然。发明人希望本文中的术语“包含(comprising、comprise和comprises) ”在任何情况下任选可以分别被术语“由…构成(consisting of > consist of和consists of)”替
换。 本专利说明书中提到的所有参考文献或专利申请均通过弓I用并入本文。为了更好地理解本发明，给出了以下实施例。这些实施例仅用于阐述的目的，无论如何也不应当理解为对发明范围的限制。
实施例以下实施例和数据用于对发明的阐述，而非限制。1.示范性F4候选疫苗的制备按照先前美国专利7，612，173和美国专利申请61/181，130 (均通过引用全部并入本文)中的描述制备F4候选疫苗。该疫苗含有IOyg/剂密码子优化的F4重组蛋白(F4co)并含有专利佐剂AS01B，后者是含有免疫刺激剂3-D-MPL和QS21各50 μ g的基于脂质体的佐剂。替代地，可以使用专利佐剂AS01E，它含有AS01B中一半浓度的相同免疫刺激剂，即25 μ g3-D-MPL和25 μ g QS21。方法简单总结如下。2.F4co融合杭原F4co是包含排列如下的4个B型HIV-1抗原的融合蛋白:p24-RT-Nef-pl7。这四个抗原是:_p24，gag基因编码的病毒衣壳蛋白。-RT (逆转录酶)，负责将病毒RNA转录为双链DNA的病毒酶。该酶在一个氨基酸(色氨酸229被赖氨酸取代)上发生突变从而去除RT聚合酶活性。这个蛋白由pol基因编码。
-Nef，由env基因侧翼的开放读框(ORF)编码的调控蛋白。_pl7，gag基因编码的病毒基质蛋白。以下多聚核苷酸序列经过密码子优化，从而在不改变表达出来的融合蛋白的氨基酸序列的情况下，使密码子的使用与大肠杆菌中高度表达的基因的密码子使用相仿。2.lF4co的核苷酸序列:
权利要求
1.药物组合物，其包含a.选自Nef、Gag和Pol的两种或更多种HIV-1抗原；b.能够诱导Thl型免疫反应的佐剂；和c.药学上可接受的赋形剂，其用于将感染了 HIV-1的受试者的病毒载量在给药后保持至少四个月。
2.药物组合物，其包含a.选自Nef、Gag和Pol的两种或更多种HIV-1抗原；b.能够诱导Thl型免疫反应的佐剂；和c.药学上可接受的赋形剂，其用于将感染了 HIV-1的受试者的病毒载量在给药后降低或者保持在100，000拷贝/ml或以下至少四个月。
3.药物组合物，其包含 a.选自Nef、Gag和Pol的两种或更多种HIV-1抗原；b.能够诱导Thl型免疫反应的佐剂；和c.药学上可接受的赋形剂，其用于增强感染了 HIV-1的受试者的T细胞反应。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中增强的T细胞反应是:a.与给予药物组合物之前相比，受试者中有更高百分比的CD4+T细胞或者CD8+T细胞显示出对药物组合物中至少一种多肽的特异识别；和/或b.与给予药物组合物之前相比，受试者中有更高百分比的⑶4+T细胞表达至少一个、两个或者三个活化标记物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中:a.其中所述受试者并非正在接受抗逆转录病毒疗法(ART);和/或b.感染HIV-1的受试者i)从未经历ART，ii)在被给予药物组合物之前中止了ART，或者iii)同时还接受ART。
6.权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中病毒载量:a.保持在50，000拷贝/ml或以下、10，000拷贝/ml或以下、5000拷贝/ml或以下、1000拷贝/ml或以下、或者500拷贝/ml或以下；和/或b.在给药后下降；和/或c.保持或下降了至少六个月、至少十二个月、至少十八个月、至少两年、至少三年、至少四年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年或者至少十年。
7.权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中:a.所述药物组合物包含Nef、Gag和Pol;和/或b.Gag是pl7、p24或者这两者；和/或 c.Pol是RT ;和/或 d.所述药物组合物包含SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 12,SEQ ID N0:14 和/ 和 SEQ ID NO: 16 ;和 / 或e.所述药物组合物还包含Env。
8.权利要求1-7中任一项所述的药物组合物，其中所述佐剂:a.是选自免疫活性皂苷组分、脂多糖、免疫刺激性寡核苷酸和固醇的一或多种成分，任选其中的固醇是胆固醇；和/或b.包含免疫活性皂苷组分和脂多糖；和/或c.包含QS21和/或脂质A衍生物，任选其中的脂质A衍生物是3D-MPL;和/或d.包含CpG;和/或e.还包含脂质体载体。
9.权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物:a.被给予受试者一次；和/或b.被给予受试者两次或更多次；和/或c.作为初免-强化接种方案中的初免剂量或强化剂量。
10.稳定或者抑制感染了HIV-1的受试者中病毒载量增加的方法，所述方法包括 1)选择感染了Hiv-1的受试者；和2)将免疫原性组合物给予所述受试者，所述组合物包含a.选自Nef、Gag和Pol的两种或更多种HIV-1抗原；b.能够诱导Thl型免疫反应的佐剂；和c.药学上可接受的赋形剂，其中给药后受试者的病毒载量与给药前相比在至少四个月中保持稳定或者下降。
11.防止感染了HIV-1的受试者中临床HIV疾病发病的方法，所述方法包括1)选择感染了HIV-1的受试者；和2)将免疫原性组合物给予所述受试者，所述组合物包含a.选自Nef、Gag和Pol的两种或更多种HIV-1抗原；b.能够诱导Thl型免疫反应的佐剂；和c.药学上可接受的赋形剂，其中受试者的病毒载量在给药后保持在100，000拷贝/ml以下至少四个月。
12.防止感染了HIV-1的受试者中HIV疾病进展的方法，所述方法包括1)选择感染了HIV-1的受试者；和2)将免疫原性组合物给予所述受试者，所述组合物包含a.选自Nef、Gag和Pol的两种或更多种HIV-1抗原；b.能够诱导Thl型免疫反应的佐剂；和c.药学上可接受的赋形剂，其中受试者的病毒载量在被给予免疫原性组合物后保持稳定。
13.在感染了HIV-1的受试者中诱导免疫反应的方法，所述方法包括1)选择感染了HIV-1的受试者；和2)将免疫原性组合物给予所述受试者，所述组合物包含a.选自Nef、Gag和Pol的两种或更多种HIV-1抗原；和b.能够诱导Thl型免疫反应的佐剂；和c.药学上可接受的赋形剂，其中在步骤2)的给药后，与给药前相比，受试者中有更高百分比的CD4+T细胞i)显示出对免疫原性组合物中至少一种多肽的特异识别，或者ii)表达选自^401^11^-2、了即(！和IFN Y中的至少一个、两个或者三个活化标记物。
14.权利要求10-13中任一项所述的方法，其中:a.受试者并非正在接受抗逆转录病毒疗法(ART);和/或b.所述感染了HIV-1的受试者i)未经历过ART ；ii)在被给予药物组合物前中止了ART，或者iii)同时还接受ART。
15.权利要求10-14中任一项所述的方法，其中所述病毒载量:a.保持在50，000拷贝/ml或以下、10，000拷贝/ml或以下、5000拷贝/ml或以下、1000拷贝/ml或以下、或者500拷贝/ml或以下；和/或b.在给药后下降；和/或c.保持或下降了至少六个月、至少十二个月、至少十八个月、至少两年、至少三年、至少四年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年或者至少十年。
16.权利要求10-15中任一项所述的方法，其中:a.所述药物组合物包含Nef、Gag和Pol;和/或b.Gag是pl7、p24或者这两者；和/或 c.Pol是RT ;和/或 d.所述药物组合物包含SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 12,SEQ ID N0:14 和/ 和 SEQ ID NO: 1 6 ;和 / 或e.所述药物组合物还包含Env。
17.权利要求10-16中任一项所述的方法，其中所述佐剂:a.是选自免疫活性皂苷组分、脂多糖、免疫刺激性寡核苷酸和固醇的一或多种成分，任选其中的固醇是胆固醇；和/或b.包含免疫活性皂苷组分和脂多糖；和/或c.包含QS21和/或脂质A衍生物，任选其中的脂质A衍生物是3D-MPL;和/或d.包含CpG;和/或e.还包含脂质体载体。
18.权利要求10-17中任一项所述的方法，其中所述药物组合物:a.被给予受试者一次；和/或b.被给予受试者两次或更多次；和/或c.作为初免-强化接种方案中的初免剂量或强化剂量。
全文摘要
本发明提供了用于对感染HIV-1的受试者进行治疗的方法和组合物。发明尤其涉及增强被感染受试者的免疫反应以及稳定或降低被感染受试者的病毒载量。
文档编号A61K39/21GK103228294SQ201180057028
公开日2013年7月31日 申请日期2011年9月27日 优先权日2010年9月27日
发明者P.布尔格农, M.C.考特索科斯, G.H.沃斯 申请人:葛兰素史密斯克莱生物公司