专利名称：：无汞乙脑灭活疫苗组合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及疫苗组合物，尤其涉及乙脑疫苗组合物，更具体的是涉及一种无汞乙脑灭活疫苗组合物。
背景技术：
：自法国人巴斯德发明疫苗以来，人类在与传染病的较量中，疫苗起到了举足轻重的作用，为提高人类的健康和社会的安定作出了重要的贡献。现行的疫苗主要分成减毒活疫苗和灭活疫苗两大类。减毒活疫苗主要包括水痘疫苗、麻风腮疫苗、甲肝疫苗和卡介苗等，灭活疫苗主要包括流感疫苗、乙脑疫苗、狂犬疫苗、百白破疫苗、Hib疫苗和流脑疫苗等。灭活疫苗在制剂时，传统的方法是在疫苗的主要成分(如病毒和细菌的重要抗原成分)中加入缓冲液或赋形剂。塞诺菲巴斯德生物制品有限公司生产的巴斯德流感裂解疫苗使用磷酸缓冲盐溶液为缓冲液(凡尔灵VAXIGRH^，国药准字J20030029)，中国药典三部记载的乙脑灭活疫苗使用用Earle's液为缓冲液(北京化学工业出版社，2005年版，74-76)。中国药典三部记载了I型肾综合征出血热灭活疫苗(北京化学工业出版社，2005年版，80-82)和人用狂犬疫苗(北京化学工业出版社，2005年版，89-91)使用人血白蛋白为抗原保护剂，A型脑膜炎球菌多糖疫苗中所使用的保护剂则为乳糖(中国药典三部，北京化学工业出版社，2005年版，34-36)。这些现有疫苗大多以硫柳汞为防腐剂，如I型肾综合征出血热灭活疫苗、人用狂犬疫苗和吸附百日咳白喉联合疫苗(中国药典三部，北京化学工业出版社，2005年版，80-82;89-91;54-57)。先前的灭活疫苗在制剂和分装时每瓶为多剂量，使用时需从一瓶中多次吸取疫苗进行接种。为了防止因接种操作引起的污染，在灭活疫苗中加入防腐剂(如硫柳汞)以降低疫苗受污染的几率。硫柳汞(thimerosal)可以有效地降低疫苗接种操作中引起的污染，但由于其中含有汞(Hg)的成分，可能会造成使用者(特别是儿童)被汞污染，引起不良反应。美国FDA在1999年的回顾中发现某些婴儿疫苗中的汞含量超过了联邦标准。因此，1999年7月FDA给疫苗生产商发了一封信，要求他们在疫苗中去除硫柳汞或说明继续使用该防腐剂的原因。这一行动取得了效果，在婴儿疫苗中汞的含量下降了60%。目前，部分单剂量的灭活疫苗已不含或含低硫柳汞(应不高于50iig/剂)，如流感疫苗(凡尔灵VAXIGRH^，塞诺菲巴斯德生物制品有限公司，国药准字J20030029)等。但目前国内外的乙脑灭活疫苗如国产乙型脑炎灭活疫苗(中国药典三部，北京化学工业出版社，2005年版74-76)、日本产日本脑炎灭活疫苗JE-VAX(BIKEN日本大阪大学观音寺研究所生产的乙脑灭活疫苗说明书)、及台湾国光日本脑炎疫苗(http:〃www.adimmune.com.tw/product.aspp_id=20051028929351YQ4XR)均含有硫柳荥，至今尚未有关乙脑灭活疫苗不含硫柳汞的报道。
发明内容本发明的一个目的在于提供一种无汞乙脑灭活疫苗组合物。在疫苗原液中添加无酚红199培养液和病毒保护剂制备该组合物。本发明的另一个目的在于提供一种无汞乙脑灭活疫苗组合物的用途，该组合物用于无汞乙脑灭活疫苗的制备。病毒保护剂具体为人血白蛋白或重组人血白蛋白。本发明所述的无汞乙脑灭活疫苗组合物的制备步骤如下1、Vero细胞培育从工作细胞库中取出细胞接种于细胞培养液中进行复苏，具体为含2.5_20%(v/v)小牛血清的199培养液。复苏的细胞长成单细胞层后，采用0.1-0.8%(w/v)胰蛋白酶消化传代，细胞以i:2-i:8比例传代，培养时间为2-7天，培养温度37士rc;2、接种乙脑病毒挑选细胞生长良好的培养瓶，用PBSpH7.2缓冲液充分淋洗细胞后加病毒维持液，具体为含1-10%(v/v)20X人血白蛋白的199培养液，接种乙脑病毒，MOI为0.01-0.001;3、乙脑病毒培养将接种病毒的细胞置34士rC培养2-7天。4、收获乙脑病毒选择有典型细胞病变和肉眼检查无污染的培养瓶，收获病毒液。收获的病毒液经澄清合并，制成病毒收获液。5、乙脑病毒灭活按1:4000的比例加入5-20%(v/v)P-丙内酯，先置4°C24-72小时灭活病毒，再置37t:l-i2小时水解残余的e-丙内酯。病毒收获液灭活后即为病毒灭活液。6、乙脑病毒纯化病毒灭活液经300KD膜超滤浓縮10-100倍后即为病毒浓縮液。按病毒浓縮液体积的1_10%(v/v)加入20mg/ml硫酸鱼精蛋白进行沉淀，离心后收集上清液。上清液用蔗糖密度梯度超速离心法进一步纯化后制成病毒纯化液。病毒纯化液用300KD膜超滤透析脱糖，再经0.22iim除菌过滤后即为疫苗原液。7、乙脑疫苗配制原液检定合格后，根据效价测定结果配制，在疫苗原液中加入无酚红199培养液和病毒保护剂稀释合并制得无汞乙脑疫苗。病毒保护剂为5_30%(w/v)人血白蛋白或重组人血白蛋白溶液。病毒保护剂在无酚红199培养液中的浓度为0.5-10%(v/v)。病毒保护剂可以选择5-20%(w/v)、5-10%(w/v)、10-20%(w/v)或20-30%(w/v)人血白蛋白或重组人血白蛋白溶液。具体选择浓度为5%(w/v)、7%(w/v)、10%(w/v)、12%(w/v)、15%(w/v)、17%(w/v)、18%(w/v)、19%(w/v)、20%(w/v)、21%(w/v)、22%(w/v)、25%(w/v)、27%(w/v)或30%(w/v)的人血白蛋白或重组人血白蛋白溶液。病毒保护剂在无酚红199培养液中的浓度可以选择0.5-1%(v/v)、1-5%(v/v)或5-10%(v/v)。具体选择浓度为O.5%(v/v)、0.7%(v/v)、l%(v/v)、1.5%(v/v)、2%(v/v)、2.5%(v/v)、3%(v/v)、3.5%(v/v)、4.5%(v/v)、5%(v/v)、6%(v/v)、7%(v/v)、9%(v/v)或10%(v/v)。4价方法具体为免疫小鼠中和抗体测定法(中国药典三部，北京化学工业出版社，2005，74-76)，计算被检疫苗和参考疫苗组对病毒对照组的蚀斑减少率，其合格评定标准为T>(RA+RB)/2-0.33，其中，T=被检疫苗，RA/RB=参考疫苗。疫苗原液按若干稀释倍数进行配置，然后根据测定疫苗效价的结果确定疫苗原液中加入无酚红199培养液和病毒保护剂使用量。本发明实现的有益效果在乙脑疫苗制备中不使用硫柳汞避免了使用者(特别是儿童)所受到的汞污染而引起的不良反应，确保了使用者的身体健康。具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。应当说明的是，本发明所述的实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛_奥德里奇(Sigma-Aldrich)。实施例1无汞疫苗的配制取一定体积的疫苗原液样品，使用稀释液为2.5%(v/v)20X人血白蛋白的无酚红199培养液进行稀释5、10、15、20倍后，使用免疫小鼠中和抗体测定法测定效价(其合格评定标准为T>(RA+RB)/2-0.33，其中T=被检疫苗，RA/RB=参考疫苗)。确定某一个稀释倍数落入目标效价测定的范围(在所有合格数据中取稀释倍数最高者)。按稀释倍数将无酚红199培养液和病毒保护剂(人血白蛋白)加入疫苗原液得到无汞乙脑灭活疫苗。以配制10升疫苗液为例，如果合格实验测得的稀释倍数为10倍，在1升疫苗原液中，加入8.975升无酚红199培养液和0.25升20%人血白蛋白(购自国家药监局批准的生产企业，如上海生物制品研究所)。同样地，根据乙脑病毒原液效价测定结果配制，在疫苗原液中加入无酚红199培养液和病毒保护剂稀释合并制得无汞乙脑疫苗。病毒保护剂为5%(w/v)人血白蛋白溶液。病毒保护剂在无酚红199培养液中的浓度为0.5%(v/v)。同样地，根据乙脑病毒原液效价测定结果配制，在疫苗原液中加入无酚红199培养液和病毒保护剂稀释合并制得无汞乙脑疫苗。病毒保护剂为10%(w/v)人血白蛋白溶液。病毒保护剂在无酚红199培养液中的浓度为1.0%(v/v)。同样地，根据乙脑病毒原液效价测定结果配制，在疫苗原液中加入无酚红199培养液和病毒保护剂稀释合并制得无汞乙脑疫苗。病毒保护剂为20%(w/v)人血白蛋白溶液。病毒保护剂在无酚红199培养液中的浓度为2.0%(v/v)。同样地，根据乙脑病毒原液效价测定结果配制，在疫苗原液中加入无酚红199培养液和病毒保护剂稀释合并制得无汞乙脑疫苗。病毒保护剂为30%(w/v)人血白蛋白溶液。病毒保护剂在无酚红199培养液中的浓度为10.0%(v/v)。同样地，根据乙脑病毒原液效价测定结果配制，在疫苗原液中加入无酚红199培养液和病毒保护剂稀释合并制得无汞乙脑疫苗。病毒保护剂为25%(w/v)重组人血白蛋白溶液。病毒保护剂在无酚红199培养液中的浓度为5%(v/v)。5实施例2无汞疫苗与含汞疫苗菌检按照本制剂处方配制疫苗液，分别与补加0.01%(v/v)柳硫汞的疫苗液和现有市场销售的乙脑灭活疫苗(北京天坛生物公司生产，含0.01%硫柳汞)进行了平行无菌检查验证。试验按照中国药典规定的无菌检查法中的直接接种法和薄膜过滤法(中国药典三部，北京化学工业出版社，2005，附录XII，73-75)进行。将以上三种制剂配方的疫苗液分别接种硫乙醇酸盐、改良马丁和营养琼脂培养基，放置2025t:和3035t:培养14天后评定结果，试验同时设置阴性和阳性对照组。实验结果见下表，试验样品1为本制剂配方，试验样品2为本制剂配方+0.01%(v/V)柳硫汞，试验样品3为北京天坛生物生产的乙型脑炎灭活疫苗(含0.01%(v/v)柳硫汞)。"-"表示无细菌生长，"+"表示有细菌生长<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>试验结果表明，以上三种制剂配方的疫苗液无菌检查均为阴性。证明按照本制剂处方配制的疫苗液(不含柳硫汞防腐剂)能达到中国药典对无菌制品要求的质量标准。权利要求一种无汞乙脑灭活疫苗组合物，由灭活乙脑病毒、无酚红199培养液和病毒保护剂组成。2.根据权利要求1所述的无汞乙脑灭活疫苗组合物，其特征在于所述的病毒保护剂为人血白蛋白或重组人血白蛋白。3.根据权利要求2所述的无汞乙脑灭活疫苗组合物，其特征在于所述的病毒保护剂为人血白蛋白或重组人血白蛋白溶液，浓度为5-30%。4.根据权利要求2所述的无汞乙脑灭活疫苗组合物，其特征在于所述的病毒保护剂为人血白蛋白或重组人血白蛋白溶液，浓度为5%、7%、10%、12%、15%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、25%、27%或30%。5.根据权利要求l-4之一所述的无汞乙脑灭活疫苗组合物，其特征在于所述的病毒保护剂在无酚红199培养液中的浓度为0.5-10%，体积比。6.根据权利要求l-4之一所述的无汞乙脑灭活疫苗组合物，其特征在于所述的病毒保护剂在无酚红199培养液中的浓度为0.5%、0.7%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4.5%、5%、6%、7%、9%或10%，体积比。7.根据权利要求1所述的无汞乙脑灭活疫苗组合物，在无汞乙脑灭活疫苗的制备中的应用。全文摘要本发明公开了一种无汞乙脑灭活疫苗组合物，由灭活乙脑病毒、无酚红199培养液和病毒保护剂组成。经过与含汞制剂的菌检比较，本发明组合物能达到中国药典对无菌制品要求的质量标准。在乙脑疫苗制备中不使用硫柳汞避免了使用者所受到的汞污染而引起的不良反应，确保了使用者的身体健康。文档编号A61P31/00GK101732707SQ20081020317公开日2010年6月16日申请日期2008年11月21日优先权日2008年11月21日发明者朱绍荣申请人:上海荣盛生物药业有限公司