专利名称：：一种安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及凝血酶，尤其涉及一种安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂及其制备方法。
背景技术：
：现有蛋白制品的病毒灭活/去除方法有其局限性，如S/D法(有机溶剂/表面活性剂法)只对包膜病毒有效，因而导致蛋白制品的应用仍有一定的风险。湿热法(60°C，10小时)、干热法(80°C，72小时或者100°C，30分钟)能够有效地杀灭人类无脂包膜病毒，如B19病毒和甲肝病毒。但是，对于动物源的病毒，如牛细小病毒、猪细小病毒以圆环病毒，由于其为无脂包膜病毒，S/D不能有效地将其杀灭，同时，由于这类病毒对热的抵抗，常用的湿热和干热法对其基本无效。而在国内外批准的众多医用生物材料中，动物来源的产品所占比例不小。因此寻找一种能灭活所有病毒，且对蛋白制品活性影响较小、操作方便的方法，将有助于提高蛋白制品应用的安全性。台匕l!匕
发明内容本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种成本低廉、性稳定、耐辐照的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂及其制备方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现—种安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂，其特征在于，该凝血酶制剂包括凝血酶、稳定剂，所述的凝血酶制剂承受20-40KGy的钴6°伽玛射线的辐照，在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持凝血酶的功能和结构。所述的凝血酶为蛋白质，所述的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氯化钠和枸橼酸三钠；所述的蛋白质、L-精氨酸盐酸盐、氯化钠、枸橼酸三钠的含量如下(g/100ml)蛋白质L-氯化钠枸橼酸三钠所述的蛋白质、L-(g/100ml):蛋白质氯化钠枸橼酸三钠0.HO;0.HO;0.OHO;0.01-5。精氨酸盐酸盐、氯化钠、枸橼酸三钠的含0.5-5;0.1-2;0.3-1;1-3。:优选如下所述的凝血酶制剂还包括残留水分，该残留水分的含量为0.5-15%3所述的残留水分的含量优选0.5-5%。所述的凝血酶包括哺乳动物来源的凝血酶。所述的哺乳动物包括牛、马、猪、羊。所述的凝血酶制剂为冻干粉。—种安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括采用无菌技术获取哺乳动物全血，在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白质含量，计算蛋白质重量，加入稳定剂，搅拌混匀；冻干，封装；进行钴6°伽玛射线辐照，得到安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂。所述的哺乳动物全血为经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的哺乳动物全血；所述的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氯化钠和枸橼酸三钠；所述的伽玛射线辐照的剂量为20-40KGy，温度为-10-40°C。Y射线灭活病原体的机理如下大量实验证实Y射线辐照对各种微生物均有杀灭作用，包括有包膜和无包膜病毒及所有的基因型物质。电离辐射对生物大分子的损伤既有能量传递的直接作用，也有通过水的辐解反应大量产生自由基的间接作用，这两者之间除时间上有先后之分外，在损伤的类型与机理等方面也存在一定差异。直接作用离子射线的直接作用主要是光子存储能量到"靶结构"上，这些能量的转移主要导致分子的外部电子从分子上移位而破坏共价键；间接作用间接作用主要是射线作用于水分子、氧分子或其它的分子，形成高活性的自由基和活性氧，自由基和活性氧使病原体核酸断裂。目前认为，传染因子的基因物质比蛋白生物制品更容易受到Y射线的损伤，这主要是由于两者物理特征(大小和密度)和化学结构的不同。生物大分子对射线辐照的敏感性与其本身质量大小有关，实际上，几十年前人们就通过Y射线灭活病毒所需的剂量来估计病毒基因组的大小，一般情况下灭活微生物所需的剂量与微生物的核酸大小成反比。Y射线辐照消毒和灭菌具有以下优点与传统的消毒灭菌方法相比较，Y射线辐照有其独特的优点①不使物品升温；②穿透力强，射线可穿透被照物品的各个部位，一般不受物品包装、形态的限制；③被照物品不会产生感生放射性，辐照后无残留毒性；④方法简便；⑤省能，尤其适于大规模工业化处理。采用Y射线辐照灭活蛋白制品中的病毒—般情况下，20-50kGy剂量的Y射线辐照几乎能灭活所有的病毒，但灭活病毒的同时，辐照剂量越大，对蛋白制品成分的损伤也越大，如何在灭活病毒的同时又保留蛋白有效成分、不破坏蛋白成分的活性，这将是Y射线辐照应用于蛋白制品病毒灭活的关键。实验表明将冻干状态下的蛋白制品由于所含水分少，经电离辐射后所产生自由基少，对蛋白制品的损伤大幅度减弱。Y射线是一种有效灭活生物蛋白制品中病毒的方法。尽管对某些蛋白制品生物活性有不同程度的影响，但如果能研制出效果好的蛋白保护剂，Y射线辐照技术将可用于蛋白制品的病毒灭活处理，蛋白制品的临床应用安全系数也会得到明显提高。本发明采用资源广泛、价格低廉的动物血源作为凝血酶的来源，添加稳定剂提高其稳定性，采用钴6°伽玛射线的辐照进行灭菌灭病毒，并维持良好的功能和结构。与现有技术相比，本发明的动物源凝血酶来源广泛、价格低廉，添加稳定剂保证具有优良的稳定性，可以承受20-40KGy的钴6°伽玛射线的辐照，在有效地杀灭可能污染的病原微生物(包括除朊病毒以外的病毒，细菌，支原体，霉菌等)的同时，维持凝血酶的功能和结构，确保使用的安全性和有效性；此外，本发明采用的制备方法工艺合理，操作简单，具有良好的应用性。图1为实施例2中采用Reed-muenchTCID5。法测定辐照前后病毒灭活动力曲线图。具体实施例方式下面对照附图及具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度IOO级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质1.5g/100ml，氯化钠lg/100ml，L-精氨酸盐酸盐O.5g/100ml，枸橼酸三钠:2.4g/100ml;冻干，封装；微生物限量测定细菌总数小于300CFU/克(产品重量)；然后在室温下，进行总剂量为25KGy的钴6°伽玛射线辐照，实现最终灭菌灭病毒，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。实施例2病毒灭活实验根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将纯化液分为两份第一份，每100毫升溶液的组成成分如下蛋白质1.5克，氯化钠l克，L-精氨酸盐酸盐0.5克，枸橼酸三钠2.4克；分装，冻干；小于300CFU/克(产品重量)；第二份，每100毫升溶液的组成成分如下蛋白质1.5克，维生素C:200mM，氯化钠1克，枸橼酸三钠2.4克，小于300CFU/克(产品重量)。将上述两部分液体各自分成3等分，每等分分别加入约107qfU/ml的猪细小病毒(PPV)，分装到西林瓶，lml/瓶，粉碎后，再次冷冻干燥，使冻干粉的水分含量《1%。送辐照中心在_10-401:条件下进行钴6°伽马射线辐照，辐照剂量为分别为5，10，15，20，25，30，35，40KGy.采用Reed-muenchTCID50法测定辐照前后病毒滴度降低(TotalReductionFactor,TRF)情况，实验数据见图1。如图l所示，结果表明，与第二组配方相比较，采用第一组配方作为保护剂，在25-30KGy的辐照剂量下，PPV的TRF降低了近5.0，而抗坏血酸组仅仅降低了2_3.5，说明本发明稳定剂较抗坏血酸组更加有效地增强了辐照的灭病毒作用。实施例35本发明凝血酶稳定性测试及效价测定根据生产工艺流程，按照实施例1方法制备凝血酶。随机抽取两组批号进行稳定性测试，测定指标为凝血酶效价。从每一批号中分别取100套置于冷冻箱中(为期3年)、80套置于37t:及75%相对湿度的烘箱中(为期6个月)、80套置于25t:空调房中(为期6个月)作为测试样本。在此之前，已进行过基线时间测试，且测试结果均合格。在为期3年的实时测试过程中，前半年内每月选取IO套样品进行检测，此后，每半年选取10套样品进行检测，检测结果记录在表1中。表1凝血酶温度实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>凝血酶效价测定将纤维蛋白原配成相当于0.2%凝固物质的纤维蛋白原生理盐水溶液，用磷酸氢二钠溶液(0.05mol/L)或磷酸二氢钠溶液(0.05mol/L)调节pH值为7.07.4，再用生理盐水稀释成0.1%的溶液，备用。标准曲线的制备取凝血酶标准品，加生理盐水溶解，分别配成每ml含5.0，6.4，8.0，10.0单位的标准品溶液。另取内径lcm，长10cm的试管4支，各精密加入纤维蛋白原生理盐水溶液各0.lml，置37t:水浴中，观察纤维蛋白的初凝时间，每种浓度测5次，求均值。以每管中标准溶液的浓度(U)为横坐标，凝结时间(秒)为纵坐标，绘制标准曲线。测定法取样品3瓶，分别精密称取其内容物的重量，按标示量分别加生理盐水配制成标准曲线浓度的溶液，精密吸取0.lml，按标准曲线的制备平行测定5次凝结时间的平均值(误差要求同标准曲线)。在标准曲线上或用直线回归方程求得单位数，按下式计算。凝血酶(单位/瓶)=Uxl0xV<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>上式中U:0.lml样品在标准曲线上读得的实际单位数V:溶解每瓶凝血酶所用的毫升数W:样品的重量(mg)10:0.1ml换算成1.0ml的数实施例4—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质0.lg/100ml，L-精氨酸盐酸盐0.lg/100ml，氯化钠:0.01g/100ml，枸橼酸三钠:O.Olg/lOOml;冻干，封装；微生物限量测定细菌总数小于300CFU/克(产品重量)；然后在-l(TC下，进行总剂量为20KGy的钴6°伽玛射线辐照，实现最终灭菌灭病毒，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。实施例5—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度IOO级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质:10g/100ml，L-精氨酸盐酸盐10g/100ml，氯化钠:10g/100ml，枸橼酸三钠:5g/100ml;冻干，封装；微生物限量测定细菌总数小于300CFU/克(产品重量)；然后在4(TC下，进行总剂量为40KGy的钴6°伽玛射线辐照，实现最终灭菌灭病毒，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。实施例6—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度IOO级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质0.5g/100ml，L-精氨酸盐酸盐0.lg/100ml，氯化钠0.3g/100ml，枸橼酸三钠:lg/100ml;冻干，封装；微生物限量测定细菌总数小于300CFU/克(产品重量)；然后在3(TC下，进行总剂量为30KGy的钴6°伽玛射线辐照，实现最终灭菌灭病毒，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。实施例7—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质5g/100ml，L-精氨酸盐酸盐2g/100ml，氯化钠lg/100ml，枸橼酸三钠3g/100ml;冻干，封装；微生物限量测定细菌总数小于300CFU/克(产品重量)；然后在室温下，进行总剂量为25KGy的钴6°伽玛射线辐照，实现最终灭菌灭病毒，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。上述各实施例还可以采用牛、马或羊等哺乳动物的全血替代猪全血制备凝血酶制剂。权利要求一种安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂，其特征在于，该凝血酶制剂包括凝血酶、稳定剂，所述的凝血酶制剂承受20-40KGy的钴60伽玛射线的辐照，在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持凝血酶的功能和结构。2.根据权利要求1所述的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的凝血酶为蛋白质，所述的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氯化钠和枸橼酸三钠；所述的蛋白质、L-精氨酸盐酸盐、氯化钠、枸橼酸三钠的含量如下(g/100ml):蛋白质0.1-10;L-精氨酸盐酸盐0.1-10;氯化钠0.01-10;枸橼酸三钠0.01-5。3.根据权利要求2所述的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的蛋白质、L-精氨酸盐酸盐、氯化钠、枸橼酸三钠的含量优选如下(g/100ml):蛋白质0.5-5;L-精氨酸盐酸盐0.1-2;氯化钠0.3-1;枸橼酸三钠1-3。4.根据权利要求2或3所述的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的凝血酶制剂还包括残留水分，该残留水分的含量为0.5-15%。5.根据权利要求4所述的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的残留水分的含量优选O.5-5%。6.根据权利要求1或2所述的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的凝血酶包括哺乳动物来源的凝血酶。7.根据权利要求6所述的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的哺乳动物包括牛、马、猪、羊。8.根据权利要求1所述的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的凝血酶制剂为冻干粉。9.一种如权利要求1所述的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括采用无菌技术获取哺乳动物全血，在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白质含量，计算蛋白质重量，加入稳定剂，搅拌混匀；冻干，封装；进行钴6°伽玛射线辐照，得到安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂。10.根据权利4要求9所述的安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的哺乳动物全血为经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的哺乳动物全血；所述的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氯化钠和枸橼酸三钠；所述的伽玛射线辐照的剂量为20-40KGy，温度为-10-40°C。全文摘要本发明涉及一种安全的冻干哺乳动物源凝血酶制剂及其制备方法，所述的凝血酶制剂包括凝血酶、稳定剂，所述的凝血酶制剂承受20-40KGy的钴60伽玛射线的辐照，在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持凝血酶的功能和结构。与现有技术相比，本发明的动物源凝血酶来源广泛、价格低廉，添加稳定剂保证具有优良的稳定性，可以承受20-40KGy的钴60伽玛射线的辐照，在有效地杀灭可能污染的病原微生物(包括除朊病毒以外的病毒，细菌，支原体，霉菌等)的同时，维持凝血酶的功能和结构，确保使用的安全性和有效性；此外，本发明采用的制备方法工艺合理，操作简单，具有良好的应用性。文档编号A61K38/48GK101757616SQ20081020290公开日2010年6月30日申请日期2008年11月18日优先权日2008年11月18日发明者何红兵申请人:上海松力生物技术有限公司