专利名称：：一种口蹄疫病毒抑制剂、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种应用RNAi技术设计的口蹄疫病毒病抑制剂、其制备方法及应用。
背景技术：
：家畜口蹄疫(Footandmouthdisease,FMD)是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物，国际兽医局将口蹄疫列为A类传染病之首。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。根据免疫原性，口蹄疫病毒有A、0、C、SATI、SATII、SATIII及Asial共7个血清型。现在市场上销售的灭活疫苗对家畜有免疫保护能力，但是疫苗注射后10天左右才能诱导体内产生大量抗体对动物进行保护。口蹄疫病毒感染动物后2到3天就能使大量动物发病，为此寻找快速保护动物的病毒抑制剂非常必要。RNAi技术是科学研究领域近年来取得的重大成就之一，它最大的优点在于具有快速的防御与治疗效果。在自然界中，各种病毒都会存在多种突变株，口蹄疫病毒就有七种血清型和很多的变异株，这给口蹄疫病的防治工作带来了巨大的困难。而siRNA能否到达口蹄疫病毒在动物体内感染与复制的部位就成为siRNA是否能够高效的干扰靶基因进而抑制病毒的重要问题。
发明内容本发明目的之一是提供一种高效的口蹄疫病毒病抑制剂，以抑制同一型中不同毒株甚至不同型的口蹄疫病毒在动物个体中复制与感染。本发明目的之二是提供上述抑制剂的制备方法。本发明提供了一种口蹄疫病毒抑制剂，该抑制剂含有表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒和以减毒猪霍乱沙门氏菌为受体菌的活菌苗，表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒分布于以减毒猪霍乱沙门氏菌为受体菌的活菌苗中。本发明的口蹄疫病毒抑制剂中，所述的siRNA序列的耙点是口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株3D基因(GenBank登录号AY317098)，口蹄疫病毒AsiaI型YNBS/58毒株1A基因(GenBank登录号AY390432)，口蹄疫病毒AsiaI型JIANGSU毒株1A基因(GenBank登录号EF149009)，口蹄疫病毒0型CHA/99毒株2B基因(GenBank登录号AJ539138)。本发明中，siRNA的序列因不同口蹄疫病毒毒株结构特征siRNA的序列可以根据病毒基因中靶点序列，前后浮动适当个数(一般为6个以内)的核苷酸残基，而不影响siRNA对病毒的抑制效应。即本发明可将前述的各质粒的siRNA序列按病毒基因靶，前后浮动6个以内的核苷酸残基。同时，设计siRNA的序列也可根据不同口蹄疫病毒毒株基因变异做相应的改变，这样可以保证siRNA对病毒株有最高效的抑制效果。本发明的实施例中描述了构建5个表达siRNA的质粒即P3D_NT56，p3Dl，p1A-NT65，p1A-NT19，和p2B。上述各质粒中siRNA序列的靶点分别作用在口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株3D基因cDNA的(3D-NT56)和(3D1);口蹄疫病毒AsiaI型YNBS/58毒株1A基因cDNA的(1A-NT65);口蹄疫病毒AsiaI型JIANGSU毒株1A基因(1A-NT19)以及口蹄疫病毒0型CHA/99毒株2B基因cDNA的(2B)。本发明的口蹄疫病毒抑制剂中，所述的表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒是p3D-NT56、p3D1、p1A-NT65、p1A-NT19、p2B中的一种或者几种。本发明的口蹄疫病毒抑制剂中，所述的表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒含有如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4或者SEQIDNO5中所示序列的任意一种或者几种。本发明的口蹄疫病毒抑制剂中，所述的表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒是将p3Dl、plA-NT19和p2B按任意比例混合而得，例如(0.1-10):(0.1-10):1。较好的，如l:2:i，或者i:i:i等。本发明的口蹄疫病毒抑制剂中，所述的表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒p3D-NT56、p2B和plA-NT65按任意比例混合而得，例如(0.1-10):(0.1-10):1。较好的，如i:2:i，或者i:i:i等。本发明的口蹄疫病毒抑制剂中，所述的活菌苗是以仔猪副伤寒活菌苗(减毒猪霍乱沙门氏菌C500)Salmonellacholeraesuis为传递系统的活菌苗。经过验证能够传递DNA疫苗的减毒沙门氏菌均可被采用作为传递系统，如减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，肠炎沙门氏菌(SalmonellaentericaserovarEnteritidis)。本发明还提供了上述口蹄疫病毒抑制剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤(1)将表达抗口蹄疫病毒的siRNA的模板序列及其相应的启动子插入表达质粒，表达抗口蹄疫病毒的siRNA的模板序列位于相应启动子之后；(2)扩增(1)所得的质粒，并转化减毒猪霍乱沙门氏菌。本发明的口蹄疫病毒抑制剂制备方法中，(2)中将(1)所得的质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌进行扩增。上述的启动子可以是小鼠或人组织细胞中扩增U6(根据6enBank公布小鼠U6启动子基因序列，登录号X06980)。本发明提出的表达抗口蹄疫的siRNA的活菌苗的制备方法，包括基因制备、重组、或菌苗的组建和活菌苗制备，通常包括如下步骤(1)用PCR方法从小鼠或人组织细胞中扩增U6启动子。将启动子基因插入质粒。用化学合成的方法合成编码siRNA的DNA模板序列，并将其插入启动子之后，构成能够表达siRNA的重组质粒。(2)将siRNA表达质粒经过中间宿主鼠伤寒沙门氏菌LB5010后，电转化到减毒的猪霍乱沙门氏菌C500中，构建成抗口蹄疫病毒的重组活菌抑制剂。本发明首先在BHK-21细胞水平和乳鼠水平检测各siRNA表达质粒对于不同血清型口蹄疫病毒的抗病毒活性。试验结果显示，p3D-NT56，p3Dl，plA-NT65，plA-NT19和p2B对O型口蹄疫病毒均有抑制作用(表1)，p3D-NT56，p2B，plA-NT65对AsiaI型口蹄疫病毒同样具有较显著的抑制作用(表1)。p3D-NT56，p2B，plA-NT65在乳鼠水平上具有抑制0型和Asial型两种不同血清型病毒的能力(表2)。在细胞水平上，混合使用p3Dl+plA-NT19+p2B的抗病毒能力要高于单一质粒。混合使用p3D-NT56+p2B+plA-NT65不仅在细胞水平表现出4优于其它质粒的抗病毒效果(表l)，而且在乳鼠水平上同样显示出比其他单一质粒更为显著的抗病毒效果(表2)。更进一步，将上述siRNA表达质粒转入减毒沙门氏菌C500，获得口蹄疫病毒抑制剂活菌苗，如p3D-NT56/S.cho等。本发明用血清凝集实验检测重组菌的沙门氏菌血清学特性，以保证减毒猪霍乱沙门氏菌C500自身作为仔猪副伤寒疫苗的有效性。然后，将保存的重组活菌抑制剂菌种经活化后，按照约1%的接种量转接到三角瓶中静置培养，约6h以后，可得到2X10g-5Xl()gCFU/ml的重组活菌抑制剂培养物。采用肌肉注射方法免疫豚鼠和家猪。对豚鼠达到了80%的保护(表3)，家猪被100%保护了10天(图1)。本发明的一大特点是该活菌苗能将表达siRNA的质粒直接呈递给免疫应答相应器官的特异性抗原呈递细胞(APC)，从而使表达的siRNA可以高效的干扰靶基因-口蹄疫病毒的基因，直接在病毒入侵的部位对病毒复制进行抑制。本发明的另一个特点是具有交叉抑制力。其所携带的质粒能够表达靶向口蹄疫病毒保守序列的siRNA，因此可以抑制0型和Asial型口蹄疫病毒的复制。本发明利用RNAi技术，选取了口蹄疫病毒基因组中保守的特异区段作为靶序列干扰和抑制病毒复制，从而实现了siRNA对多种型和变异株的口蹄疫病毒的快速防治。本发明组建的重组活菌苗储存、使用方便。保存采用菌体冻干方式。既可以口服适用，又可以肌肉注射。口服减毒沙门氏菌还可以诱导机体产生粘膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，综合提高机体对病毒的抵抗能力。减毒沙门氏菌作为载体传递外源质粒，不仅可以使机体抵抗外源质粒携带的siRNA靶向的病毒，同时也可以抗沙门氏菌感染。附图是一次注射不同剂量p3D-NT56/S.cho抑制病毒在家猪体内复制的损伤值图。图例中的数字代表每头动物的编号。对动物发病损伤值的计数方法采用美国梅岛动物研究中心计数方法(Chinsangaram，J.etal.J.Virol.200377:1621-1625)，即猪的16个小蹄加上鼻镜总共计为17个单位，攻毒后通过计数发生病毒性水泡或病毒性溃烂的单位数目多少来表示症状的严重程度。图1是p3D-NT56/S.cho注射剂量109的损伤值图。图2是p3D-NT56/S.cho注射剂量101Q损伤值图。图3是pLacZ/S.cho注射剂量109损伤值图。图4是S.cho注射剂量l(f损伤值图。图5是PBS(磷酸缓冲液，空白对照)的损伤值图。可见，与图3-5相比，图1和图2所用注射剂都有一定的抑制病毒作用。具体实施例方式以下新型抑制剂的制备和检验过程以靶向3D基因的活菌抑制剂为例进行说明。实施例1用PCR方法从小鼠NIH/3T3细胞中扩增核糖体RNA的U6启动子。用该启动子序列替换质粒pcDNA3.1的多克隆位点前的启动子。化学合成SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4或者SEQIDN05各序列，各序列的反向重复序列以及发夹接头DNA序列。将各序列与对应的反向重复序列通过发夹接头DNA连接形成siRNA模板序列。将各siRNA模板序列插在U6启动子之后，分别构建成p3D-NT56，p3Dl，plA_NT65，plA_NT19和p2B。在细胞和乳鼠水平检测这些质粒对于不同血清型口蹄疫病毒毒株的抑制。然后将对于各毒株具有交叉保护作用的质粒p3D-NT56用CaCl2法转化到中间宿主减毒鼠伤寒沙门氏菌LB5010。从LB5010中提取质粒，再用电击法转化减毒猪霍乱沙门氏菌C500，得到p3D-NT56/S.cho。用玻片凝集实验验证重组菌p3D-NT56/S.cho的血清学特性，即具有免疫原性。实施例2用本发明组建的重组活菌抑制剂以107101QCFU/只的剂量对体重为250-300克的豚鼠进行后腿股内侧肌肉注射(用平板稀释计数法计算活菌数目)。36小时后用50IDs。的口蹄疫病毒对豚鼠进行后脚掌穿剌攻击。结果显示，未注射活菌抑制剂的豚鼠在口蹄疫病毒攻击的48小时内均发病，而预先注射了活菌抑制剂的豚鼠对口蹄疫病毒的攻击产生了强烈的抵抗力，约有80%的豚鼠最终得到保护(表3)，而且注射活菌抑制剂的发病豚鼠在症状上比对照组动物要轻得多。实施例3用本发明组建的重组活菌抑制剂以10810"CFU/只的剂量对家猪进行颈部肌肉注射。24小时后用50IDs。的口蹄疫病毒对家猪进行颈部肌肉注射攻击。攻毒七天和十四天后对家猪取血，血液静置过夜，3500r/min离心10min，取上层血清。检测中和抗体和非结构蛋白抗体。结果显示，未注射活菌抑制剂的家猪在口蹄疫病毒攻击的4天内均发病，而预先注射了活菌抑制剂的家猪被100%的保护到10天(图1)。血清学分析结果表明(表4)，未发病动物的中和抗体以及非结构蛋白抗体效价均为阴性，从而说明活菌抑制剂有效的抑制了口蹄疫病毒在家猪体内的复制。细胞中和抗体测定方法(1)细胞传代，传细胞于96孔板，371\5%C02条件下培养24小时，细胞铺满板底面。(2)稀释血清样品，稀释4个梯度，各稀释梯度为2的倍数。(3)将病毒液稀释到100ID5。/0.lml。(4)每一血清稀释度样品加入病毒液(病毒液与血清样品体积为1:1)。混匀后，37"温箱放置1小时。(5)倒掉96孔板细胞上清液，每孔加入100ii1血清病毒混和液，每一稀释度加4孔。37°C、5%C02条件下培养，48-72小时后观察每孔病变情况，以半数病变的稀释度作为中抗体指标。表lsiRNA表达质粒转染细胞降低口蹄疫病毒的效价6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注Mixl=p3D_NT56+p2B+plA_NT65;Mix2=p3D1+p2B+p1A-NT19;2pLacZ+pNTH21，pNTH21，Lip，LacZ和空白均为对照组。pNTH21和pLacZ为表达非特异性shRNA的质粒，由本实验室构建。Lip为单纯脂质体转染细胞组。空白为非转染组。病毒效价计算方法在96孔板上培养BHK-21细胞，直至长满孔底。以无血清无抗生素的匿EM培养基对原始病毒液作十倍的系列稀释(例如，10—3-10—8)。吸去细胞孔中的培养基，每孔中加入100iU某一稀释度的病毒液，每一稀释度作4个重复孔。置于细胞培养箱371\5%(A条件下培养。72h后，通过倒置显微镜观察并记录每个稀释度细胞发生病理学病变[17]的孔数，以Reed-Muench公式(Reed，L.J.，Muench，H.A.Am.J.Hyg.193827:493-497)计算半数细胞感染剂量(TCID5。)表2注射siRNA表达质粒降低感染口蹄疫病毒的乳鼠的死亡率7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注Mixl=p3D-NT56+plA-NT65+p2B;Mix2=p3Dl+plA-NT19+p2B;PBS为注射磷酸缓冲液的实验组。每组20只乳鼠。存活率=每组存活动物数+每组动物总数X100%。表3重组活菌苗在豚鼠体内抗病毒效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表中"-"表示保护率不再降低。保护率=每组未发病动物数+每组动物总数X100%。表4p3D-NT56/S.cho—次注射动物的血清学分析组别动物编号中和抗体ELISA阻断率(%)o天7天14天0天7天14天PBS28-8《3108362NDND冊1-48《3362362NDNDND3-2《3128362么6±0.239.5±0.136.2±2.0pLacZ/S.cho6-2《3180362NDNDND10943-14《3180362NDNDND43-5《3256256NDNDND49-3《3128180NDNDNDp3D-NT56"c力o2-7《32318012.16±1.112.6±2.425.8±0.410'5-6《3111806.5±1.010.1±0.327.8±423-3《31118012肚0.89.5±0.232.9±5.21-1《32318011.9±0.521.2±3.829.5±27p3D-NT56/Xc/w1-3《3108》1283.出.O36.5±1.250.0±4310'。7-1《323》180&4±0.027.9±0.233.6±3.23-4《3108》1807.4±0.739.1±1.8必.5±0.21-34《364》180NDNDND6_4《336236212.9±2.942.9±1.155.9±1.11094-6《318031513.6±1.9545±1.963.2±0.7ND:未检测到注测定非结构蛋白抗体使用北京世纪元亨公司的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒。本试剂盒的非结构蛋白抗体判定标准为，当被检血清的阻断率>30%，判为抗体阳性；20%《被检血清阻断率<30%，判为抗体可疑；被检血清阻断率<20%，判为抗体阴性。序列表〈210>1〈211>56〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gaggctatcctctcctttgcacgccgtgggaccatacaggagaagttgatctccgt〈210>2〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2gttcttggtcactccataa〈210>3〈211>65<212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tcaggc朋cactgg朋gceitcatta已c朋ctecteceitgcagcagteccagaactccertg60gacac65〈210>4〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400>4ac朋ctectacatgcagca19<210>5〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5ccagatgcaggaggacatgt2510权利要求一种口蹄疫病毒抑制剂，其特征在于，该抑制剂含有表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒和以减毒猪霍乱沙门氏菌为受体菌的活菌苗，表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒存在于以减毒猪霍乱沙门氏菌为受体菌的活菌苗中。2.如权利要求1所述的口蹄疫病毒抑制剂，其特征在于，所述的表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒是p3D-NT56、p3Dl、plA-NT65、plA-NT19、p2B中的一种或者几种。3.如权利要求1所述的口蹄疫病毒抑制剂，其特征在于，所述的表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒含有SEQIDN01、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4或者SEQIDNO5中所示序列的任意一种或者几种。4.如权利要求2所述的口蹄疫病毒抑制剂，其特征在于，所述的表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒是将p3Dl、plA-NT19和p2B按任意比例混合而得。5.如权利要求2所述的口蹄疫病毒抑制剂，其特征在于，所述的表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒p3D-NT56、p2B和plA-NT65按任意比例混合而得。6.如权利要求l所述的口蹄疫病毒抑制剂，其特征在于，所述的活菌苗是p3D-NT56/S.cho、p3Dl/S.cho、plA-NT65/S.cho、plA-NT19/S.cho、p2B/S.cho中的一种或者几种。7.如权利要求1所述口蹄疫病毒抑制剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤(1)将表达抗口蹄疫病毒的siRNA的模板序列及其相应的启动子插入表达质粒，表达抗口蹄疫病毒的siRNA的模板序列位于相应启动子之后；(2)扩增(1)所得的质粒，并转化减毒猪霍乱沙门氏菌。8.如权利要求7所述口蹄疫病毒抑制剂的制备方法，其特征在于，(2)中将(1)所得的质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌进行扩增。全文摘要本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种应用RNAi技术设计的口蹄疫病毒病抑制剂、其制备方法及应用。该抑制剂是含有表达抗口蹄疫病毒的siRNA的质粒、以减毒猪霍乱沙门氏菌为受体菌的重组活菌苗。本发明的重组活菌苗储存、使用方便。既可以口服适用，又可以肌肉注射。减毒沙门氏菌作为载体传递siRNA表达质粒，不仅可以使机体抵抗该siRNA靶向的病毒，同时也可以抗沙门氏菌感染。文档编号A61P31/14GK101732710SQ20081020305公开日2010年6月16日申请日期2008年11月20日优先权日2008年11月20日发明者丛薇,严维耀,刘明秋,郑兆鑫,金虹申请人:复旦大学