专利名称：一种用于脑神经保护的药物的组合的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，具体涉及一种用于保护脑神经的药物组合。
背景技术：
益智，别名益智仁、益智子，为姜科山姜属植物，是中医常用药材。现代研究表明， 益智具有拮抗钙活性、强心、抗癌、控制回肠收缩及拮抗前列腺素的作用。授权公告号为 CN100560718C的中国发明专利记载了益智乙醇提取物的主要成分原儿茶酸对氧化应激损伤的PC12细胞有保护作用，并能促进神经干细胞体外增殖及诱导其分化的作用。但迄今为止，尚未见国内外有对原儿茶酸和白杨素协同保护神经细胞损伤的作用的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组合物，该组合物具有保护脑神经的作用，可应用于保护脑神经药物开发。一种用于脑神经保护的药物的组合物，含有(a)原儿茶酸和(b)白杨素，(a)与 (b)的摩尔比值为4 85 I。优选地，本发明的组合物对体外神经细胞损伤保护达到最佳效果时(a)与(b)的摩尔比值约80 I。优选地，本发明的组合物在斑马鱼体内神经保护达到最佳效果时(a)与(b)的摩尔比值约4 I。本发明的组合物，能在6-羟基多巴胺诱导的PC12细胞损伤模型中增强细胞活性、 减少乳酸脱氢酶释放；在6-羟基多巴胺诱发的斑马鱼体内模型中显著减少多巴胺能神经元的损伤；同时(b)能增强(a)的神经保护作用。该组合物可应用于脑神经保护的药物开发。
图I为本发明的组合物对6-羟基多巴胺诱发的PC12细胞损伤的影响，其中，(A) 为本发明的组合物对PC12细胞活性的影响，(B)为本发明的组合物对PC12细胞乳酸脱氢酶释放量的影响；图2为本发明的组合物对6-羟基多巴胺诱发的斑马鱼多巴胺能神经元损伤的影响，(A)为代表性图片显示组合物能显著阻止6-羟基多巴胺诱导的斑马鱼多巴胺能神经元数量减少；(B)为多巴胺神经元定量统计分析结果；图3为本发明的组合物增加了 Nrf2/小时0_1的蛋白质表达，其中，⑷为本发明的组合物12小时内时间依赖地上调了 Nrf2/H0-1的蛋白质表达，(B)显示Nrf2/H0_l被组合物诱导的蛋白质表达变化具有浓度依赖性；图4为本发明的组合物诱导了Nrf2向细胞核转移，并增强了其转录活性，其中， (A)为本发明的组合物显著降低细胞质中Nrf2含量并提高细胞核中Nrf2含量，6-羟基多巴胺单独处理组亦提高Nrf2在細胞核中的表达，(B)显示白杨素、原儿茶酸和白杨素组合可提高Nrf2的转录活性；图5为Nrf2 siRNA下调了 PC12細胞的Nrf2/H0_l的蛋白质表达，并抑制了本发明的组合物的細胞保护作用，(A)显示Nrf2 siRNA显著降低Nrf2的蛋白质表达，以及Nrf2 所调节的关键转录蛋白质HO-I的下游信号通路，⑶显示Nrf2 siRNA能特异性抑制本发明組合物在6羟基多巴诱导PC12細胞损伤的保护作用，但Nrf2 siRNA和阴性对照RNA转染本身并未影响PC12的細胞活性。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例子对本发明作进ー步详细介绍。实施例1 PC12細胞的培养PC12神经细胞为购自美国模式培养物保藏所(ATCC)的大鼠嗜铬细胞瘤細胞。培养基为F-II基础培养基，含15% (体积百分比)的热灭活马血清、2. 5% (体积百分比) 的胎牛血清、青霉素(100単位/毫升)和链霉素(100微克/毫升)，細胞培养置于含95% 湿度和5% CO2的37°C的培养箱中，培养基隔天更换一次。实施例2本发明的組合物对6-羟基多巴胺诱发的PC12細胞损伤的保护作用1.实验设计及药物处理原儿茶酸和白杨素分別溶解于ニ甲基亚砜(DMS0，购自西格玛奥德里奇公司)中， 储存液浓度为500mmol/L和12mmol/L，使用时直接稀释于培养基中，DMSO终浓度不超过 0.3%。用系列稀释的原儿茶酸或白杨素，或它们的組合物预处理細胞12小时，然后更换含 lmmol/L的6-羟基多巴胺新鲜低血清培养基处理8小时诱导PC12細胞损伤，用MTT和乳酸脱氢酶释放法检测細胞活力。2.PC12細胞损伤的检测方法(I)MTT 法 将100微升含有1 X IO4个PC12細胞的培养液接种于96孔板的每孔上，培养M小时后换无血清培养基饥饿细胞M小吋，用含不同浓度的白杨素、原儿茶酸、白杨素和原儿茶酸的組合的新鮮低血清培养基(含0. 5%胎牛血清)代替无血清的培养基培养12小吋。 接着，在新鮮的低血清培养基中让细胞与lmmol/L的6-羟基多巴胺反应8小吋。通过MTT 分析測定細胞活性。用WallacVictor3TMV微板读板仪(购自荷兰帕金-埃尔默公司)測定 570nm处的吸光度。(2)乳酸脱氢酶释放法当細胞膜破损时，也可以通过测定释放到培养基中的乳酸脱氢酶的活性来确定细胞活性。按照細胞毒性检测试剂盒(德国罗氏公司)的使用说明測定乳酸脱氢酶的总活性和释放乳酸脱氢酶的活性。用微板阅读仪在490nm处测定吸光度。将6-羟基多巴胺组释放的乳酸脱氢酶活性归ー化处理，给药组的结果用6-羟基多巴胺组的百分比表示。实验结果原儿茶酸単独预处理表现出了轻度的細胞保护作用，在1毫摩尔时细胞活力増加10% ；而单独的白杨素则没有表现出细胞保护作用；用白杨素和原儿茶酸共同处理PC12細胞吋，显著增强了原儿茶酸的細胞保护作用，当白杨素浓度为12微摩尔/升， 原儿茶酸浓度为1毫摩尔/升吋，細胞活性提高约25%，与単独的lmmol/L原儿茶酸给药组相比，p < 0.01，如图IA所示。相似地，原儿茶酸明显减少了 6-羟基多巴胺造成的乳酸脱氢酶的释放，此外，白杨素显著增强了原儿茶酸对乳酸脱氢酶释放的抑制作用，如图IB所示。与6-羟基多巴胺单独处理组比较，分别为< 0. 05、、< 0. 01和< 0. 001。实施例3本发明的组合物对6-羟基多巴胺诱发斑马鱼多巴胺神经元减少的保护作用。受精后发育一天斑马鱼胚胎用不同浓度的白杨素或原儿茶酸或白杨素和原儿茶酸组合分别和250微摩尔6-羟基多巴胺共同培养48小时。用6-羟基多巴胺和3 u mo I/L 诺米芬新(多巴胺转录因子的抑制剂)共同处理的斑马鱼胚胎作为阳性对照。处理后，收集斑马鱼，使用酪氨酸羟化酶抗体进行免疫组织化学研究。A.不同处理组中斑马鱼大脑中多巴胺能神经元的典型图像，斑马鱼间脑区域中与酪氨酸羟化酶抗体反应阳性(TH+)的神经元用红括号表示；B.每组统计分析来自3次实验的共60个斑马鱼鱼胚胎多巴胺能(TH+) 神经元，数值用对照组的百分比表示。实验结果6_羟基多巴胺处理显著减少了斑马鱼间脑中多巴胺能神经元的数量 (用红括号表示)，如图2A所示。白杨素和原儿茶酸的组合，而非其单独处理，可按浓度梯度显著减轻多巴胺能神经元的损伤。与未经处理的对照组进行比较，##P < 0. 01 ;与6-羟基多巴胺单独处理组比较分别为< 0. 05、、< 0. 01，如图2B所示。实施例4本发明的组合物增加了 Nrf2/H0_l的蛋白质表达。用不同浓度的白杨素或原儿茶酸或白杨素和原儿茶酸的组合，分别处理PC12细胞，随后提取细胞中的蛋白质，用Nrf2和HO-I的抗体进行蛋白质印迹分析。实验结果暴露在12 ii mol/L白杨素和lmmol/L原儿茶酸组合中的PC12细胞表现出了 Nrf2蛋白质表达量随着药物处理时间延长而增加的趋势，而PC12细胞增加的HO-I表达与Nrf2的变化相关，如图3A所示。白杨素和原儿茶酸的组合上调了 Nrf2/H0-1的蛋白质表达，而且该变化具有浓度依赖性。就单种药物而言，白杨素，而非原儿茶酸适度增加了 Nrf2/H0-1的蛋白质表达，如图3B所示。与未经处理组进行比较，*p < 0. 05和、< 0. 01。实施例5本发明的组合物诱发了 Nrf2向细胞核转移，并增强了其转录活性。I.实验方法⑷用12 ii mo I/L白杨素和lmmol/L原儿茶酸的组合预处理PC12细胞12小时，随后再用lmmol/L6-羟基多巴胺培养2小时。随后分别提取细胞浆和细胞核蛋白，用于蛋白质印迹分析。(C)用克隆有抗氧化反应元件(ARE)的报告基因质粒转染PC12细胞，随后用白杨素、原儿茶酸或其指定浓度的组合进行处理。12小时后，收获细胞，并测定荧光素酶活性。2.实验结果白杨素和原儿茶酸组合物能增加Nrf2向细胞核内转位，使细胞核内Nrf2蛋白量升高，而细胞浆内Nrf2蛋白下降，如图4A所示。并且，白杨素和原儿茶酸组合物能显著增强ARE的转录活性，如图4B所示。与未经处理的对照组进行比较，分别为< 0. 05、**p
<0. 01 和 ***p < 0. 001。实施例6本发明的组合物减少了 PC12细胞经6-羟基多巴胺诱导的的脂质过氧化作用，恢复了受抑制的抗氧化酶活性。I.实验方法
用12ymol/L白杨素、lmmol/L原儿茶酸或者其组合对PC12细胞进行12小时的预处理，随后暴露在lmmol/L6-羟基多巴胺中2小吋。收获細胞，提取蛋白，測定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(catalase)和細胞内丙ニ醛(MDA)水平。2.实验结果用6-羟基多巴胺处理PC12細胞造成了超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的显著降低，分別降低大约至六分之一和二分之一。尽管如此，用白杨素和原儿茶酸组合进行预处理显著缓解了超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的下降。此外，仅用白杨素，而非仅用原儿茶酸，会适度减缓过氧化氢酶活性的下降(P < 0. 05)。用6-羟基多巴胺处理的PC12細胞表明細胞内丙ニ醛增加了大约3倍，用白杨素、原儿茶酸或其組合预培养PC12細胞都显著缓解了細胞内丙ニ醛水平的变化，实验结果见表1。与6-羟基多巴胺单独处理组比较，分別为 *p < 0. 05、**p < 0. 01 和 ***p < 0. 001。表1白杨素和原儿茶酸在经6-羟基多巴胺处理的PC12細胞中对抗氧化酶活性和
脂质过氧化作用的影响
权利要求
1.一种用于脑神经保护的药物的組合物，其特征在于含有(a)原儿茶酸和(b)白杨ο
2.如权利要求1所述的用于脑神经保护的药物的組合物，其特征在干(a)与(b)的摩尔比值4 85 :1。
3.如权利要求2所述的用于脑神经保护的药物的組合物，其特征在于在斑马鱼实验中(a)和(b)的最佳摩尔比值为4:1。
4.如权利要求2所述的用于脑神经保护的药物的組合物，其特征在于在体外細胞实验中⑷和⑴的最佳摩尔比值为80 :1。
全文摘要
本发明公开了一种用于脑神经保护的药物的组合物，含有(a)原儿茶酸和(b)白杨素，(a)与(b)的摩尔比值为4～851。本发明的组合物能在6-羟基多巴胺诱导的PC12细胞损伤模型中增强细胞活性、减少乳酸脱氢酶释放；在6-羟基多巴胺诱发的斑马鱼体内模型中显著减少多巴胺能神经元的损伤；同时(b)能增强(a)的神经保护作用，该组合物可应用于脑神经保护的药物开发。
文档编号A61K31/192GK102526021SQ20121001616
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者张在军, 李国辉, 李铭源 申请人:澳门大学