专利名称：一种鼻咽癌靶向磁共振对比剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学生物材料领域，尤其是一种LMPl+-鼻咽癌靶向磁共振对比剂及其制备方法。
背景技术：
肿瘤是当今影响人类健康的主要疾病之一，世界卫生组织的一项报道表明，随着全球人类生存环境的变化，全球恶性肿瘤的发生率将由现在的1000万人/年上升到1500 万人/年，成为威胁人类健康的头号杀手。在我国(特别是华南地区)，近年来，鼻咽癌的发病率呈上升趋势，全世界80%的鼻咽癌病例发生在中国。鼻咽癌病理类型主要为非角化型未分化癌，易出现颈部淋巴结及远处转移；在首程诊疗患者中，III-IV期患者占了 70% -80%。放射治疗在过去很长一段时间都是鼻咽癌的标准治疗手段，鼻咽癌治疗的5年生存率I-II期在60%左右，III-IV期则生存率很低， 仅20%-40%，治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移。此外，中晚期鼻咽癌放化疗后严重副反应有时难以避免，因此，早期发现鼻咽癌并进行准确诊断对其预后至关重要。EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)是鼻咽癌的主要病因， EBV-LMPl (Epstein-Barr Virus Latent membrane protein 1) B^^J^IgS , ^ EBV永生化基因中唯一能够转化体外培养的人和啮齿类动物细胞并使细胞获得“永生”的基因。其中EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMPl(Latent membrane protein 1)在鼻咽癌病人中阳性率超过65%，是重要的致瘤蛋白，是目前广泛认可的鼻咽癌细胞表面的标志性抗原。有望成为临床诊断及治疗的靶标，且潜伏膜蛋白阳性鼻咽癌的增殖能力、侵袭和转移能力均明显强于潜伏膜蛋白阴性鼻咽癌，两者对肿瘤治疗方案的反应也有较大差异。因此对鼻咽癌进行进一步的分型有明显的临床意义和科学价值。我们研制的i^304-APTES-PEG-LMPl， Clone CS. 1_4磁共振对比剂不仅仅可用于鼻咽癌的影像诊断，而且可以利用MRI对鼻咽癌进行进一步分型。磁共振(Magnetic Resonance Imaging，MRI)因其具有精确的软组织分辨率，无 X射线引起的辐射损伤，在肿瘤的诊断和疗效的监测中正在扮演着越来越重要的角色，磁共振对比齐Ll (Contrast agent for Magnetic resonance imaging,MRICA)能显著提高正常与异常组织之间的对比度，特别是提高肿瘤组织与周围正常组织的之间的信噪比，提高早期肿瘤的诊断的准确率。常规磁共振成像往往对这种肿瘤的早期准确诊断存在较大困难。目前全世界医院运用最多的阴性/阳性磁共振对比剂主要是非特异性对比剂，按照磁化性能分为阳性对比剂及阴性对比剂两大类。阳性对比剂主要为含钆与含锰螯合物， 其驰豫性能低，由于游离钆与锰对生物体具有较强的毒性，如钆(Gd)等的毒性反应(可以引起肾纤维化等)，且其是一种血池性对比剂，其使用范围较窄。其作用主要是缩短自旋晶格弛豫时间(Tl驰豫时间)，使靶组织的Tl信号加强，在磁共振上呈高信号，因此，又叫Tl 相对比齐LU 例如[Gd(DTPA)]. sup. 2- (diethylenetriaminepentaacetate-gadolinium(II I)), [Gd(DOTA)]. sup. -(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N' ,N" ,N' ‘’ —tetraacetate-gadolinium(III))，[Gd(BOPTA)]. sup. 2-(benzylo xypropioic-diethylenetriamine pentaacetate-gadolinium(III))禾口 MnDPDP(N, N' -dipyridoxylethy Iene diamine-N, N' -diacetate-5,5' -bis (phosphate)-manganese (II))。阴性对比剂又叫 T2 相对比剂， 主要是使局部磁场不均勻，进而减少自旋弛豫时间(T2驰豫时间)，使得靶向组织T2相信号减低，驰豫性能高。临床上的阴性对比剂主要以菲立磁为代表，但是菲立磁也是一种非特异性磁共振对比剂。与钆对比剂相比，其特点如下1)能够进入血管周围间隙，是一种血管间隙对比剂，因此，其使用范围更广泛；幻每单位金属铁能够产生更多的信号强度的改变， 驰豫性能高，尤其在T2WI序列；幻在体内具有生物可降解性，可经细胞内正常代谢途径而进入体内铁循环，参与体内铁的生命活动；4)菲立磁经过普鲁士蓝染色等方法染色，可以被光镜或电镜直接观察到，因此，更有可能成为肿瘤磁共振靶向对比剂的信号组件。缺点是在体内易被网状内皮系统和免疫吞噬细胞吞噬，因而半衰期短、对肿瘤的主动靶向聚集功能较弱。而要改变其生物相容性，延长其血液中的循环时间，增强其靶向性能，主要通过对 Fe3O4纳米微粒进行表面改性。可以成为表面修饰材料有多种，如多糖，白蛋白、APTES等。 为了减少其空间位阻，在I^e3O4与靶向分子之间插入一个柔软的连接臂作为一种链绳结构， 其系着抗原的游离端活动度大，在靶区能为抗原与抗体结合提供相对较长的接触时间与更多的接触机会，造影剂和靶器官之间的结合便更加紧密。合成一种价格低廉的、生物相容性好的、特异性强的鼻咽癌靶向磁共振对比剂，解决以往对比剂的不足，具有潜在的产业化前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种LMPl+-鼻咽癌特异性阴性对比剂及其制备方法，使得对比剂与现有技术相比具有低毒性，形态可控，高稳定性，好的生物相容性，高敏感性，好的特异靶向性，该对比剂可以用于人体或非人体LMPl+-鼻咽癌增强对比剂。本发明的目的可以通过以下方式实现一种鼻咽癌靶向磁共振对比剂，是用3-氨丙基三乙氧基硅烷(apteq包覆或连接到超顺磁性四氧化三铁上，使狗304表面氨基化，得到!^3O4-aptes表面改性微粒，再将聚乙二醇(peg)作为!^3O4-aptes表面改性微粒与eb病毒潜伏膜蛋白1单克隆抗体(简写为 LMPLClone CS. 1-4 ；购于DAKO公司，购买时间2008. 05. 05)之间的连接臂，将二者连接起来，得到的分散稳定的!^3O4-Aptes-Peg-LMPI, Clone CS. 1-4胶体溶液。所述的超顺fi53o4是采用化学共沉淀的方法合成的粒径为10-15nm颗粒。
所述的 fii3O4-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 胶体微粒粒径为 20_30nm。所述的鼻咽癌靶向磁共振对比剂是将超顺狗304与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反应，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子；得到!^3O4-APTES表面改性微粒，然后与PEG连接；再将LMP1，Clone CS. 1-4和带有PEG连接臂的!^3O4-APTES表面改性微粒混合，冰浴中搅拌过夜；借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，再经过洗涤，分散得到的磁共振对比剂。Fe3O4与APTES反应摩尔比为0. 1 1-20 1 ；两者反应30分钟_1小时。!^e3O4-APTES表面改性微粒与PEG的反应摩尔比为0. 1 1-20 1，两者反应30 分钟-1小时。
带有PEG连接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒和LMPl，Clone CS. 1-4以Fii3O4/单抗的摩尔比1 1-100 1混合反应。Fe3O4与APTES的摩尔比优选为1 1-10 1，Fe3O4与PEG摩尔比优选为 1 1-10 1，带有PEG连接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒和 LMPl,Clone CS. 1—4 以Fii3O4/ 单抗的摩尔比优选为10 1-100 1。一种鼻咽癌靶向磁共振对比剂的制备方法，将超顺磁性!^e3O4与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反应，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子；得到!^3O4-APTES表面改性微粒， 然后与PEG连接；再将LMP1，Clone CS. 1-4和带有PEG连接臂的!^3O4-APTES表面改性微粒混合，冰浴中搅拌过夜；借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，再经过洗涤，分散得到磁共振对比剂。所述的超顺Fe53O4是采用化学共沉淀的方法合成的粒径为10-15nm颗粒。!^e3O4与APTES反应摩尔比为0. 1 1-20 1 ；两者反应30分钟_1小时； Fe3O4-APTES表面改性微粒与PEG的反应摩尔比为0. 1 1-20 1 ；两者反应30分钟-1小时；带有PEG连接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒和LMP1，Clone CS. 1-4以!^e3O4/单抗的摩尔比1 1-100 1混合反应。一种LMPl+-鼻咽癌特异性阴性磁共振对比剂是运用Discovery Studio和 Autodock等计算机模拟药物分子设计软件构建的分子设计平台进行设计，并通过以上方法制备而成。本发明的优势本发明制备的LMPl+-鼻咽癌特异性阴性磁共振对比剂，所产生的!^e3O4-LMPl是生物相容性好的磁共振对比剂，具有超顺磁性。体外细胞学实验证实，该对比剂对血细胞形态无明显影响，对肾细胞生长无明显影响，体内大鼠急性动物实验证实，该对比剂安全性好， 无1例动物死亡，可以从肾脏排除，不存在体内长期聚集问题。解决了常规含钆对比剂肾脏等毒性问题，解决了常规狗304生物相容性差，易聚集于受体肝脾等网状内皮系统的问题。本发明制备的LMPl+-鼻咽癌特异性阴性磁共振对比剂，体外细胞学实验证实， 磁性细胞分选仪显示其敏感性为85.9%，同时，它具有高度特异靶向LMP-Γ鼻咽癌细胞 (CNE1-LMP1细胞株)的能力，特异性为75. 51 %，体内裸鼠荷瘤模型MR成像实验证实，其对 LMP-I+鼻咽癌肿瘤显像的敏感性及特异性为85. 7%及71. 4%，且具有高驰豫性能，该对比剂在主要聚集于LMP-Γ鼻咽癌瘤灶区。解决了常规磁共振对比剂低驰豫性能，对鼻咽癌低敏感性及低特异性，MRI诊断正确率低的问题。本发明制备的!^3O4-Aptes-Peg-LMPI,Clone CS. 1-4 磁共振对比剂，经 APTES、PE6 与LMPl，Clone CS. 1-4表面改性及修饰后，具有良好的分散性能，解决了颗粒团聚易至动物死亡的问题，提升其临床应用价值。
图1为本发明的主要工艺流程图及检测实验步骤示意图；图 2Fi5304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 与 LMP-Γ 鼻咽癌进行特异性结合光学显微图(X1000)；2-1为LMPl靶向对比剂与CNE1-LMP1细胞共孵后油镜下成像；4/8页2-2为LMPl靶向对比剂与CNEl细胞共孵后油镜下成像；图 3Fi5304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 与 LMP-Γ 鼻咽癌靴共孵后 MRI 成像图； 肉眼观察即可发现T2WI信号强度降低程度随着细胞数量级的递增；图 4Fe304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 对荷鼻咽癌 LMPl+ 和鼻咽癌 LMPr 双瘤动物MRI成像图；4-1，4-2分别为裸鼠T1、T2序列图像，证明模型造瘤成功，箭头所指为CNE+LMP1肿瘤，4-3为经裸鼠尾静脉注射LMPl-Fe3O4后在Τ2序列，可见右侧LMPl+信号明显降低，而左侧LMPr鼻咽癌肿块信号无明显变化。图5荷鼻咽癌LMPl+和鼻咽癌LMP1—双瘤动物模型LMPl抗原表达的免疫组化分析图(Χ200)；5-1为LMPl+鼻咽癌细胞细胞膜上见棕黄色染色，LMPl表达阳性；5-2为LMPl-鼻咽癌细胞表达LMPl阴性；图 6Fe304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 增强扫描后，对荷鼻咽癌 LMPl+ 和鼻咽癌LMP1_双瘤动物普鲁士兰染色图；6-l，CNEl_LMPl移植瘤肿块组织内见大量、显示清晰的蓝染铁颗粒，说明肿瘤组织中LMPl靶向对比剂聚集良好；6-2，CNEl移植瘤肿块组织内只可见少许蓝染铁颗粒(箭头所示)。与前图相比差异明显，从而表明LMPl靶向!^e3O4对于裸小鼠荷人鼻咽癌CNE1-LMP1 移植瘤肿块具有一定的靶向效应。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBS)溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比0.1 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比0.1 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/ 单抗的摩尔比1 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm ；加分散剂(油酸酰，用量0. 2% 0. 5% )超声分散30分钟后， 得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/ml。实施例2 取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBQ溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液
6转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比0.1 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比0.1 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/ 单抗的摩尔比10 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm;加分散剂(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超声分散30分钟后， 得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/ml。实施例3取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBQ溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比0.1 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比0.1 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/ 单抗的摩尔比1 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm ；加分散剂(己烯基双硬脂酰胺.用量为0. 5% 2% )超声分散30分钟后，得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/ml。。实施例4取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBQ溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比1 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比1 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/单抗的摩尔比1 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMPl，Clone CS. 1-4混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4纳米磁流体，粒径20-30nm ；加分散剂(己烯基双硬脂酰胺.用量为0. 5% 2% )超声分散 30分钟后，得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/ml。。实施例5
取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBS)溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比1 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比1 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/ 单抗的摩尔比10 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm ；加分散剂(聚乙烯醇PVA.用量为2% )超声分散30分钟后，得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/mL·实施例6取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBS)溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比1 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比1 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/单抗的摩尔比100 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm ；加分散剂(聚乙烯醇PVA.用量为2% )超声分散30分钟后，得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/mL·实施例7 取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBS)溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比10 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比10 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/ 单抗的摩尔比1 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4纳米磁流体，粒径20-30nm ；加分散剂(油酸.用量0. 2% )超声分散30分钟后，得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/mL·实施例8取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBS)溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比10 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比10 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/ 单抗的摩尔比10 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm;加分散剂(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超声分散30分钟后， 得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/mL·实施例9取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBS)溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比10 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比10 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/ 单抗的摩尔比100 1取PEG连接的APTES修饰的!^e3O4纳米磁流体和LMPl,Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm;加分散剂(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超声分散30分钟后， 得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/ml。实施例10取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBS)溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比20 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比20 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/单抗的摩尔比1 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm;加分散剂(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超声分散30分钟后， 得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/mL·实施例11取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBS)溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比20 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比20 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/ 单抗的摩尔比10 1取PEG连接的APTES修饰的Fe3O4纳米磁流体和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm ；加分散剂(油酸.用量0. 2% )超声分散30分钟后，得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/mL·实施例12 取0. 5mmoL氯化亚铁和1. 2mmoL氯化铁水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸钠(DBS)溶液05mM)，待溶液成为乳白色后，加入75mL甲苯，高速搅拌30min 让溶液混合均勻，滴加浓度为2. 5M的NaOH溶液调pH值至8_9，继续搅拌lh。将混合溶液转入分液漏斗静置分层，可见颗粒分散于上层甲苯溶液中，分掉水层，将上层黑液转入三口瓶中，此时先通氩气除氧，然后缓慢升温，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小时，再与 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩尔比20 1，溶解于水中进行混合。将该混合物置于纯氩气环境中，回流半小时，使磁铁矿结晶，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子。产生颗粒均勻的纳米微粒，然后与PEG连接臂按照摩尔比20 1反应半小时，进行共价偶联，再以!^e3O4/ 单抗的摩尔比100 1取PEG连接的APTES修饰的!^e3O4纳米磁流体和LMPl,Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，搅拌过夜。借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，用超纯水和无水乙醇交替洗涤4-5遍，经透析除去杂质后分散于超纯水中，就得到鼻咽癌抗体修饰的!^e3O4 纳米磁流体，粒径20-30nm ；加分散剂(油酸.用量0. 2% )超声分散30分钟后，得到所述的磁共振对比剂的浓度为0. 25mmol/mL·
权利要求
1.一种鼻咽癌靶向磁共振对比剂，其特征在于，是用3-氨丙基三乙氧基硅烷包覆或连接到超顺磁性四氧化三铁上，使狗304表面氨基化，得到!^3O4-APTES表面改性微粒，再将聚乙二醇作为!^3O4-APTES表面改性微粒与EB病毒潜伏膜蛋白1单克隆抗体之间的连接臂， 将二者连接起来，得到的分散稳定的i^OfAPTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4胶体溶液。
2.根据权利要求1所述的鼻咽癌靶向磁共振对比剂，其特征在于，所述的超顺!^e3O4是采用化学共沉淀的方法合成的粒径为10-15nm颗粒。
3.根据权利要求1所述的鼻咽癌靶向磁共振对比剂，其特征在于， Fe3O4-APTES-PEG-LMPl, Clone CS. 1-4 胶体微粒粒径为 20_30nm。
4.根据权利要求1或2或3所述的鼻咽癌靶向磁共振对比剂，其特征在于，所述的鼻咽癌靶向磁共振对比剂是将超顺磁性!^e3O4与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反应，通过离心， 超滤，和透析纯化纳米粒子；得到!^e3O4-APTES表面改性微粒，然后与PEG连接；再将LMP1， Clone CS. 1_4和带有PEG连接臂的!^3O4-APTES表面改性微粒混合，冰浴中搅拌过夜；借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，再经过洗涤，分散得到的磁共振对比剂。
5.根据权利要求4所述的鼻咽癌靶向磁共振对比剂，其特征在于，Fe3O4与APTES反应摩尔比为0.1 1-20 1 ；两者反应30分钟-1小时。
6.根据权利要求4所述的鼻咽癌靶向磁共振对比剂，其特征在于，Fe3O4-APTES表面改性微粒与PEG的反应摩尔比为0. 1 1-20 1 ；两者反应30分钟-1小时。
7.根据权利要求4所述的鼻咽癌靶向磁共振对比剂，其特征在于，带有PEG连接臂的 Fe3O4-APTES 表面改性微粒和 LMPl，Clone CS. 1_4 以!^e3O4/单抗的摩尔比 1 1-100 1 混合反应。
8.—种鼻咽癌靶向磁共振对比剂的制备方法，其特征在于，将超顺磁性狗304与3_氨丙基三乙氧基硅烷混合反应，通过离心，超滤，和透析纯化纳米粒子；得到!^3O4-APTES表面改性微粒，然后与PEG连接；再将LMP1，Clone CS. 1-4和带有PEG连接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒混合，冰浴中搅拌过夜；借助于外磁场的作用对产物进行磁性分离，再经过洗涤， 分散得到磁共振对比剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的超顺!^e3O4是采用化学共沉淀的方法合成的粒径为10-15nm颗粒。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，！^e3O4与APTES反应摩尔比为 0. 1 1-20 1 ；两者反应30分钟-1小时Je3O4-APTES表面改性微粒与PEG的反应摩尔比为0. 1 1-20 1 ；两者反应30分钟-1小时；带有PEG连接臂的Fe3O4-APTES表面改性微粒和LMP1，Clone CS. 1_4以Fii3O4/单抗的摩尔比1 1-100 1混合反应。
全文摘要
本发明公开了一种鼻咽癌靶向磁共振对比剂及其制备方法，该对比剂是采用化学共沉淀的方法合成粒径约10-15nm的超顺磁性Fe3O4，用APTES包覆或连接到10-15nm的Fe3O4上，使Fe3O4表面氨基化，得到Fe3O4-APTES表面改性微粒，聚乙二醇作为Fe3O4-APTES与EB病毒潜伏膜蛋白1单克隆抗体(LMP1，Clone CS.1-4)之间的连接臂，将二者连接起来，得到分散稳定的Fe3O4-APTES-PEG-LMP1，Clone CS.1-4胶体溶液，本发明的对比剂与现有常规对比剂相比，具有低毒，高稳定性，好的生物相容性，高敏感性，对LMP1+鼻咽癌具有好的特异靶向性，可以用于鼻咽癌筛查和特异性磁共振诊断。
文档编号A61K49/16GK102552944SQ20121001607
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者刘晟, 周科朝, 容鹏飞, 张声旺, 曾文彬, 王维, 邹蟠 申请人:中南大学