专利名称：包封uspio的隐形纳米脂质体注射液及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及ー种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液， 及其制备方法与应用。
背景技术：
目前，肿瘤依然是世界范围内死亡率最高的病因之一，每年约有1000万人发生肿瘤，而肿瘤的治疗目前主要是手木，放疗和化疗相结合。虽然约有90个化疗药物被美国FDA 批准用于癌症的临床治疗，但是由于化疗药物对病人的毒副作用和伤害过大而严重限制了化疗药物的使用。而这些毒副作用主要是由于化疗药物的靶向性及个体化较差导致。随着人们对肿瘤发生发展机制的逐渐认识，肿瘤存在着“异质性”逐渐被认识，相同类型的肿瘤可能存在不同的分子机制，原发肿瘤与转移肿瘤，肿瘤细胞之间都存在着不同的分子机制， 因此，肿瘤的治疗应当以个体化治疗为主。将肿瘤诊断与肿瘤治疗整合于一体，在进行肿瘤治疗的同吋，可以通过临床诊断设备进行实时监測，对肿瘤的标志物、药物的靶部位、肿瘤治疗的大小及疗效，实时跟踪评估，将会大大提高肿瘤治疗的效率。磁共振成像(magnetic resonance image, MRI)是临床常用的非侵入性的诊断方法，具有较高的空间时间分辨率，尤其对软组织具有较好的成像。超微超顺磁氧化铁纳米粒 (ultrasmall uperperomagnetic iron oxide, USPI0)是 MRI 的新型造影剤，属于网状内皮系统造影剤，通过造影剂的应用，增强图像的对比性，更有利于病灶的检出。其代表产品有 Combidex (AMI-227)，SHU555C, Ferumoxtran-IO 等，其基本结构主要为非化学计量的 Fii3O4 磁性单晶体組成，外面包裹低分子量的葡聚糖，其内核粒径约为5nm，水溶性粒子的粒径为 20nm。由于USPIO颗粒在体内集中分布于吞噬細胞或血管内，呈腔隙性不均勻分布。造成局部磁场不均勻。水分子(质子)扩散通过此不均勻磁场时改变质子横向磁化的相位，加速质子去相位的过程，使质子的T2值缩短，称为磁化率效应。USPIO也具缩短Tl值的效应，低浓度时Tl增强效应较明显。局部浓度和成像序列不同，可产生T1、T2和T2*增强效应。作为网状内皮系统的造影剤，目前临床上主要用于良恶性淋巴结、骨髓病变、肝脏占位性病变等的诊断。作为新型MR造影剤，USPIO相对于目前顺磁性钆类造影剤具有的优点包括①毒性小，生物相容性好；②具有一定的网状内皮系统特异性；③弛豫度高，磁场响应性高；④体内循环时间延长，半衰期延长；⑤可修饰性强，可以广泛应用于其它生物领域，如给药载体， 干細胞标记等等。尽管如此，USPIO作为MR造影剤用于病灶部位的成像诊断依然存在较大的缺陷，特别是体内靶组织选择性差，在靶组织分布浓度低，MR成像灵敏度低，使正常组织与病变组织的成像信号对比度低。因此增强USPIO在靶组织的靶向选择性，増加病变部位的信号灵敏度，从而增强病变组织与正常组织的对比性是目前MR对比剂的研究热点。为了增强灵敏性和特异性，人们针对USPIO进行了多种尝试，如减小粒径及其分布，改变表面物理化学性质，连接靶向配体等等。这些尝试多数是在USPIO单个粒子上进行改进，如对USPIO表面进行化学修饰，增强其对靶组织的选择性和灵敏性，这些改变虽然增强了单个USPIO粒子的靶向性，但是由于体内靶分子受体的表达量通常是极低的，通过
4配体与受体之间的特异性结合，靶细胞摄入USPIO的量也是极微弱的，可能达不到有效成像的浓度。并且，采用化学方法对USPIO进行表面化学修饰以联接靶向配体的方法通常会降低USPIO的原有的超顺磁性，因此如何在不改变USPIO的固有生物学特性的基础上提高 USPIO对病变组织的选择性和灵敏度，是提高肿瘤等病变组织的MR诊断效率的关键。隐形纳米脂质体(stealth nano-liposomes),又称长循环纳米脂质体(long circulating nano-liposomes)或 PEG 化纳米月旨质体(PEGylation nano—liposomes),作为肿瘤靶向的传递载体，具有显著的优势，如具有细胞亲和性，生物相容性、靶向性，降低体内毒性等。并且目前已经有多个抗肿瘤药物脂质体制剂在临床使用，如美国Sequus制药公司生产的盐酸阿霉素隐形脂质体注射剂(商品名D0XIL)已于1996年在美国上市销售； Nexstar公司生产的枸橼酸柔红霉素注射用脂质体,其商品名DaunoXome ；Depotech公司生产的治疗急性粒细胞白血病的阿糖胞苷注射脂质体制剂，其商品名D印ocyt，于1999年上市。阿霉素是蒽环类抗肿瘤抗生素，由于其结构中既含有脂溶性的蒽环配基，又有水溶性的柔红糖胺；并有酸性酚羟基和碱性氨基，因此它是一类作用效果较强的抗肿瘤药物。 其作用机理在于可直接作用于DNA，插入DNA的双螺旋链，使后者解开，改变DNA的模板性质，抑制DNA聚合酶从而既抑制DNA，也抑制RNA合成；此外，它还具形成超氧基自由基的功能，并有特殊破坏细胞膜结构和功能的作用。主要适用于治疗白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、 肉瘤、肺癌、膀胱癌等多种恶性疾病，对多种恶性肿瘤具有明显疗效，是目前临床常用的抗肿瘤药物之一。阿霉素具有强烈的心脏毒性和肾毒性，而阿霉素脂质体制剂能够有效降低其心脏毒性和肾毒性，提高生物利用度，目前尚无文献报道一种体内靶组织选择性好、在靶组织分布浓度高、MR成像灵敏度也高的USPIO制剂，也无文献报道利用纳米脂质体制备技术，将MR诊断与肿瘤治疗整合于一体，制备同时包封USPIO及抗肿瘤药物的纳米隐形脂质体，集肿瘤的诊断治疗于一体， 提高肿瘤的诊断治疗效率。
发明内容
本发明目的在于提供一种体内靶组织选择性好、在靶组织分布浓度高、MR成像灵敏度也高的USPIO制剂，具体为包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，本发明还提供了该隐形纳米脂质体注射液的制备方法与应用。本发明人认为，利用隐形纳米脂质体制备技术，携载USPIO传递至肿瘤组织具有以下优点①脂质体不会影响USPIO的超顺磁性；②一个脂质体囊泡可以包封多个USPI0， 避免稀释，有利于提高细胞摄入量及MR灵敏性便于表面靶向修饰，脂质体可以连接多种配体,如小分子配体、多肽、单克隆抗体等；④脂质体的体内行为已经被很好地确立,可以通过PEG化实现长循环；⑤脂质体的粒径相对可控，通过肿瘤EPR(enhanced permeability and retention, EPR)效应实现被动祀向；⑥脂质体可以同时携载药物，并且携载的药物范围很广，包括小分子化学药物、大分子蛋白药物、亲水性药物、疏水性药物等多种类型的药物，等等。本发明的具体技术方案是提供一种具有高包封率的USPIO的隐形纳米脂质体注射液。本发明采用隐形纳米脂质体制备技术，通过氧化USPIO外层葡聚糖形成醛基，与脂质体膜材中的氨基磷脂在碱性条件下形成暂时性键合的方法，提高USPIO在脂质体中的包封率和稳定性，从而提高MR体内成像的灵敏度。进ー步地，本发明提供一种高包封率的USPIO及抗肿瘤药物的隐形纳米脂质体注射液，在上述的脂质体制备过程中将抗肿瘤药物包封于脂质体之内，集肿瘤的诊断治疗于一体，提高肿瘤的诊断治疗效率。本发明提供了一种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，该注射液是通过以下方法制备得到的首先氧化USPIO外层葡聚糖形成醛基(洪盈等，《有机化学》第二版，人民卫生出版社，P199页，醇羟基的氧化反应)，然后按以下组分与配比制备隐形纳米脂质体注射液USPIO (28mg Fe/mL) :0. 05_10mL磷脂材料l-100mg/mL含伯胺基的磷脂材料0. l-50mg/mL胆固醇0.l_40mg/mLPEG 化脂质0. l-20mg/mL磷酸盐缓冲液10mmol/L，pH5-9注射用水余量。本发明还提供了一种包封USPIO及抗肿瘤药物的隐形纳米脂质体注射液，该注射液是通过以下方法制备得到的首先氧化USPIO外层葡聚糖形成醛基，然后按以下组分与配比制备隐形纳米脂质体注射液USPIO (28mg Fe/mL) :0. 05_10mL抗肿瘤药物0.05-50mg/mL磷脂材料l-100mg/mL含伯胺基的磷脂材料0. l-50mg/mL胆固醇0.l-40mg/mLPEG 化脂质0. l_20mg/mL磷酸盐缓冲液10mmol/L，pH5-9注射用水余量；所述的抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、冬凌草甲素等。上述组分及其配比可优选为USPIO (28mg Fe/mL) :0.ト5mL抗肿瘤药物0.1-lOmg/mL磷脂材料l_30mg/mL含伯胺基的磷脂材料0. 2-10mg/mL胆固醇0.2-10mg/mLPEG 化脂质1-5mg/mL磷酸盐缓冲液10mmol/L，pH5-9注射用水余量。上述组分及其配比最佳地USPIO (28mg Fe/mL) :0. 5mL
盐酸阿霉素lmg/mL磷脂材料具体是SlOO :20mg/mL含伯胺基的磷脂材料具体是DOPE 3mg/mL胆固醇3mg/mLPEG 化脂质具体是 mPEG-DSPE 6mg/mL磷酸盐缓冲液IOmmoI/L，pH6注射用水余量。上述的磷脂材料选自天然磷脂或合成磷脂，天然磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂等；合成磷脂为氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二芥酰磷脂酰胆碱、I-肉豆蘧酰基-2-棕榈酰磷脂酰胆碱或神经鞘磷脂等等，所选用的磷脂材料为其中的一种或几种的混合物，但不限于此；优选磷脂材料为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或两者的混合物。上述的含伯胺基的磷脂材料可以是磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等中的一种或两种的混合物，但不限于此；优选磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺或两者的混合物。上述的PEG化脂质可以是聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、聚乙二醇-聚乳酸、 聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-磷脂酰甘油等中的一种或几种，但不限于此；优选聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或两者的混合物。本发明还提供了一种包封USPIO及抗肿瘤药物的长循环隐形纳米脂质体注射液的制备方法，具体步骤如下(I)USPIO 的氧化取适量USPIO溶液与pH5_8的磷酸盐缓冲液混合，加入0. 2_3g的高碘酸钠混匀氧化30min，加0. I-Ig的乙二醇终止反应；过S印hadex-G25柱脱盐，得氧化并纯化的USPIO溶液；其中所用的USPIO为具有Fe3O4或与Fe2O3混合物的无机晶核，外被低分子量葡聚糖的粒径在10-30nm的纳米粒，可以通过共沉淀法、热分解法等多种文献报道方法制备 (① Massart R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media. IEEE Trans Magn 1981 ；17 1247-8.② QiaoR, Yang C, Gao M. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles from preparations to in vivo MRI applications. J Mater Chem 2009 ；19 :6274-93.)自行合成，也可以作为商品购买，商品如SHU555C(Superavist, 先灵德雅)，Combidex (Advanced Magnetics 公司)等。(2)包封USPIO及抗肿瘤药物的长循环隐形纳米脂质体混悬液的制备按上述配比取磷脂、含伯胺基的磷脂、胆固醇、PEG化脂质溶于30_50mL的氯仿 /和乙醚中，置旋转蒸发仪中37°C旋蒸30-60min去除有机溶剂得脂质膜；向脂质膜中加入适量的氧化好的USPIO溶液进行涡旋10-20min，继续加入适量的含抗肿瘤药物的磷酸盐缓冲液(PH5-8)涡旋数分钟；加入2-4倍体积的氯仿/和乙醚，置于超声器中低温超声 20-40min，得均匀不分层的初乳混合物；将上述初乳混合物置于旋转蒸发仪中37°C减压旋蒸20-40min，真空度0. 05-0. IMpa，先形成凝胶再水化成脂质体混悬液；为去除未包封的 USPIO和抗肿瘤药物(盐酸阿霉素等)，可将所得的脂质体混悬液置于离心机中SOOOg离心 10-20min,去除上清液，用适量磷酸盐缓冲液重新混悬得纯化的脂质体混悬液；(3)将纯化的脂质体混悬液进行高压均质，0. 22 μ m微孔滤膜过滤灭菌，充氮、分装即得包封USPIO及抗肿瘤药物的长循环隐形纳米脂质体注射液。本发明还提供了上述的包封USPIO及抗肿瘤药物的长循环隐形纳米脂质体注射液在制备靶向MR造影剤中的应用，特别是在肿瘤靶向治疗诊断制剂中的应用。本发明的包封USPIO及抗肿瘤药物的长循环隐形纳米脂质体注射液(以下称 PLDU)的质量评估(1)粒径及其分布平均粒径为(156. 9 士 25. 3)nm。(2)透射电镜(TEM)观察外观及形态所制备的脂质体成圆形或椭圆形，其内侧膜周及中间区域包封有大量铁粒子，说明脂质体包封了大量USPI0。(3)稳定性考察为了考察脂质体在血液中的稳定性，将IOul脂质体置于37°C、含有10%的FBS (胎牛血清)的PBS溶液中，放置lh，与脂质体的粒径几乎没有变化。(4)阿霉素的平均包封率为68. 5士5. 8%。(5)脂质体中铁的含量为0· 47士0. 05mg/mL。(6)体外磁共振成像特性PLDU与德国先灵葆雅生产的超小超顺磁氧化铁 SHU555C相比，在相同浓度下，其弛豫度没有发生改变。(7)动物模型体内磁共振评价PLDU显著增强体内肿瘤的靶向性，并且可以通过连接靶向配体进ー步增强其体内病变组织的靶向性。(8)动物模型体内抗肿瘤活性评价采用裸鼠皮下接种胰腺癌細胞的方式造肿瘤动物模型，分別考察了载USPIO及阿霉素的隐形纳米脂质体制剂(PLDU)，游离阿霉素溶液 (FD)，以及连接有间皮素单克隆抗体的PLDU(M-PLDU)的抗肿瘤活性。结果显示，PLDU给药组相对于阿霉素溶液组，肿瘤的生长显著被抑制，而表面连接有间皮素单克隆抗体的PLDU 组效果更显著。本发明的制剂经实验证明具有以下优点同时具有MR成像性和抗肿瘤活性，既可以用于肿瘤的诊断，又可以通过MR成像监测肿瘤治疗的效果；具有更高的MR灵敏度。一个脂质体包封多个USPIO粒子，避免了体液稀释，显著増加细胞摄入量，增强MR成像的灵敏度；具有更长的体内半衰期，通过PEG化可显著减少血液中调理素蛋白的吸附，减少单核吞噬细胞的清除；便于进行多种表面功能修饰，实现体内靶组织的主动靶向。USPIO包载入脂质体后，在脂质体表面可以进行多种靶向配体的修饰，配体可以是小分子，多肽，单克隆抗体等等。配体的连接方式有多种，如实施例中连接有间皮素单克隆抗体的USPIO隐形脂质体，不影响USPIO固有的超顺磁性；粒径可控，在100-200nm之间，能有效实现肿瘤EI3R效应。基于以上理论及实践，利用隐形纳米脂质体为载体，将MR诊断及治疗整合为ー 体，同时携载USPIO及抗肿瘤药物特别是(盐酸)阿霉素，制备稳定有效的隐形纳米脂质体制剂，作为MR造影剤，USPIO隐形纳米脂质体制剂不仅可以提高USPIO在体内的组织选择性，提高灵敏度，更有利于疾病的早期诊断，同时作为肿瘤治疗疗效的评估手段，实时监测肿瘤化疗的疗效，有利于减少病人的过度治疗，减少毒副作用，提高肿瘤治疗的疗效。
图I为包封USPIO并载药阿霉素的隐形纳米脂质体(PLDU)的粒径及其分布图
图2透射电镜观察PLDU的外观形态；
图3体外MRI测定；
图4动物模型体内MRI测定；
图5给药后各组模型动物的肿瘤体积变化；
图6给药后各组模型动物的体重变化曲线；
图7给药三周后各组肿瘤组织称重；
图8给药后各组肿瘤照片
具体实施例方式现结合实施例和附图对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例I :包封USPIO的盐酸阿霉素隐形脂质体静脉注射液组成为大豆卵磷脂500mg，磷脂酰乙醇胺lOOmg，胆固醇300mg，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺lOOmg，USPIO 15mL，盐酸阿霉素lOOmg。制备方法取USPIO溶液与pH = 6的磷酸盐缓冲液混合，加入300mg的高碘酸钠混匀氧化 30min,加200mg的乙二醇终止反应,过Sephadex_G25柱脱盐纯化。按上述配比取大豆卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶于30mL的氯仿中，置旋转蒸发仪中37°C旋蒸40min，去除有机溶剂得脂质膜；向其中加入USPIO溶液进行涡旋 20min,继续加入含盐酸阿霉素的磷酸盐缓冲液(pH8) 20mL涡旋IOmin ;加入60mL的氯仿和乙醚混合溶剂(I 3，V/V)，置于超声器中低温超声20min，得均匀不分层的初乳混合物；将此混合物继续37°C减压旋蒸40min,真空度0. 06Mpa,先形成凝胶再水化成脂质体混悬液； 于离心机中8000g离心20min，去除上清液，用30mL磷酸盐缓冲液(pH8)重新混悬得纯化的脂质体，用注射用水定容至IOOmL ;最后进行高压均质,0. 22 ii m微孔滤膜过滤灭菌,充氮、 分装即得。实施例2 :包封USPIO的盐酸阿霉素隐形脂质体静脉注射液组成为蛋黄卵磷脂500mg，磷脂酰乙醇胺lOOmg，二油酰磷脂酰乙醇胺lOOmg，胆固醇 400mg,聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱150mg, USPIO 15mL,盐酸阿霉素lOOmg。制备方法取USPIO溶液与pH = 6的磷酸盐缓冲液混合，加入300mg的高碘酸钠混匀氧化30min,加200mg的乙二醇终止反应，过Sephadex_G25柱脱盐纯化。按上述配比取蛋黄卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱溶于50mL的乙醚中，置旋转蒸发仪中40°C旋蒸30min，去除有机溶剂得脂质膜；向其中加入 USPIO溶液进行涡旋20min，继续加入含盐酸阿霉素的磷酸盐缓冲液(pH8) 20mL涡旋IOmin ； 加入90mL的氯仿和乙醚混合溶剂(I 2，V/V)，置于超声器中低温超声20min，得均匀不
9分层的初乳混合物；将此混合物继续40°C减压旋蒸40min，真空度0. 08Mpa，先形成凝胶再水化成脂质体混悬液；于离心机中6000g离心30min，去除上清液，用30mL磷酸盐缓冲液 (pH8)重新混悬得纯化的脂质体，用注射用水定容至IOOmL ；最后进行高压均质，0. 22μπι微孔滤膜过滤灭菌，充氮、分装即得。实施例3 包封USPIO的盐酸阿霉素隐形脂质体静脉注射液组成为蛋黄卵磷脂300mg，氢化大豆卵磷脂300mg，，ニ肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺150mg，胆固醇400mg，聚乙ニ醇-聚乙交酯丙交酯150mg，USPIO 20mL，盐酸阿霉素lOOmg。制备方法取USPIO溶液与pH = 6的磷酸盐缓冲液混合，加入300mg的高碘酸钠混勻氧化 40min，加300mg的乙ニ醇终止反应，过kphadex-G25柱脱盐纯化。按上述配比取蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、ニ肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇、聚乙ニ醇-聚乙交酯丙交酯溶于30mL的氯仿中，置旋转蒸发仪中37°C旋蒸40min，去除有机溶剂得脂质膜；向其中加入 USPIO溶液进行涡旋20min，继续加入含盐酸阿霉素的磷酸盐缓冲液(pH8)20mL涡旋IOmin ； 加入SOmL的氯仿和乙醚混合溶剂(1 1八八)，置于超声器中低温超声20!^11，得均勻不分层的初乳混合物；将此混合物继续37°C减压旋蒸40min，真空度0. IMpa，先形成凝胶再水化成脂质体混悬液；于离心机中SOOOg离心25min，去除上清液，用30mL磷酸盐缓冲液(pH8) 重新混悬得纯化的脂质体，用注射用水定容至IOOmL ；最后进行高压均质，0. 22 μ m微孔滤膜过滤灭菌，充氮、分装即得。实施例4 包封USPIO的盐酸阿霉素隐形脂质体静脉注射液组成为氢化大豆卵磷脂300mg，氢化蛋黄卵磷脂200mg，ニ硬脂酰磷脂酰乙醇胺200mg，胆固醇400mg，聚乙ニ醇-聚乳酸lOOmg，USPIO 15mL，盐酸阿霉素80mg。制备方法取USPIO溶液与pH = 6的磷酸盐缓冲液混合，加入300mg的高碘酸钠混勻氧化 30min，加200mg的乙ニ醇终止反应，过kphadex_G25柱脱盐纯化。按上述配比取氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、ニ硬脂酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇、聚乙ニ醇-聚乳酸溶于60mL的氯仿中，置旋转蒸发仪中37°C旋蒸40min，去除有机溶剂得脂质膜；向其中加入USPIO溶液进行涡旋20min，继续加入含盐酸阿霉素的磷酸盐缓冲液(pH8) 30mL涡旋IOmin ；加入60mL 的氯仿和乙醚混合溶剂(1 3，V/V)，置于超声器中低温超声20min，得均勻不分层的初乳混合物；将此混合物继续37°C减压旋蒸40min，真空度0. 06Mpa，先形成凝胶再水化成脂质体混悬液；于离心机中7000g离心40min，去除上清液，用30mL磷酸盐缓冲液(pH8)重新混悬得纯化的脂质体，用注射用水定容至IOOmL ；最后进行高压均质，0. 22 μ m微孔滤膜过滤灭菌，充氮、分装即得。实施例5 包封USPIO的盐酸阿霉素隐形脂质体静脉注射液组成为ニ硬脂酰磷脂酰胆碱300mg、ニ癸酰磷脂酰胆碱300mg，ニ油酰磷脂酰乙醇胺 50mg, ニ棕榈酰磷脂酰乙醇胺lOOmg，胆固醇400mg，聚乙ニ醇-磷脂酰乙醇胺60mg，聚乙ニ 醇-聚己内酯50mg，USPIO 20mL，盐酸阿霉素120mg。
制备方法取USPIO溶液与pH = 6的磷酸盐缓冲液混合，加入300mg的高碘酸钠混匀氧化 30min,加300mg的乙二醇终止反应,过Sephadex_G25柱脱盐纯化。按上述配比取二硬脂酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己内酯溶于50mL的氯仿中，置旋转蒸发仪中40V旋蒸45min，去除有机溶剂得脂质膜；向其中加入USPIO溶液进行涡旋20min，继续加入含盐酸阿霉素的磷酸盐缓冲液(pH8)20mL涡旋IOmin ;加入60mL的氯仿和乙醚混合溶剂(I 2， V/V)，置于超声器中低温超声30min，得均匀不分层的初乳混合物；将此混合物继续40°C减压旋蒸40min,真空度0. 08Mpa,先形成凝胶再水化成脂质体混悬液；于离心机中9000g离心 20min，去除上清液，用30mL磷酸盐缓冲液(pH8)重新混悬得纯化的脂质体，用注射用水定容至IOOmL ;最后进行高压均质，0. 22 微孔滤膜过滤灭菌，充氮、分装即得。实施例6 :其余同实施例1，阿霉素替换为紫杉醇。实施例7 :其余同实施例2，紫杉醇替换为冬凌草甲素。实施例8 实施例I制备得到的本发明的PLDU的质量评估(I)粒径及其分布采用马尔文Nano-S型激光粒度分析仪测量所制备的脂质体的粒径。具体方法为吸取IOii L PLDU，加入比色皿中，用去离子水稀释至1-1. 5mL，放入测量槽中，预平衡2min后测定，结果如附图I所示，平均粒径为(156. 9±25. 3)nm。(2)透射电镜(TEM)观察外观及形态将脂质体用蒸馏水稀释后，点样于铜网上， 用2%的磷钨酸负染，然后用透射电镜观察其形态，见附图2.可见所制备的脂质体成圆形或椭圆形，其内侧膜周及中间区域包封有大量铁粒子，说明脂质体包封了大量USPI0。(3)稳定性考察为了考察脂质体在血液中的稳定性，将IOul脂质体置于37°C、含有10%的FBS (胎牛血清)的PBS溶液中，放置lh，观察脂质体的粒径变化，结果见表I.可见，在水及模拟血液中孵育Ih后，脂质体的粒径几乎没有变化。表I.脂质体在水及37°C含10% FBS的PBS孵育Ih后的粒径变化
Stfsj
样本孵育介质 -——；-——-
孵育前孵育后_
Water157.3 士 5.2162.3 士 4.3
PLDU
PBS+FBS156.7±5.6162.4±5.0(4)阿霉素的包封率阿霉素脂质体的药物包封率通过离心及UV方法进行测定和评价。首先，取一定体积的脂质体混悬液在SOOOg下离心持续20min，并且脂质体层用PBS洗两次后，收集每次的上清液，测量总的游离药物的量(DOXu);同时，取等量脂质体混悬液，用TritonX-IOO (5 %，
V/V)破乳，测量总的阿霉素的含量(D0XT)，则阿霉素的包封率计算公式为
r nDOSt - DOM-
权利要求
1.一种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，其特征在于，该注射液是通过以下方法制备得到的首先氧化USPIO外层葡聚糖形成醛基，然后按以下组分与配比制备隐形纳米脂质体注射液USPIO(28mg Fe/mL) :0. 05_10mL 磷脂材料l-100mg/mL 含伯胺基的磷脂材料0. l-50mg/mL 胆固醇0. l-40mg/mL PEG 化脂质0. l-20mg/mL 磷酸盐缓冲液10mmol/L，pH 5-9 注射用水余量。
2.根据权利要求1所述的ー种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，其特征在干，制备隐形纳米脂质体注射液时包封USPIO和抗肿瘤药物，其组分与配比如下USPIO(28mg Fe/mL) 0. 05-10mL 抗肿瘤药物0. 05-50mg/'mL 磷脂材料l-100mg/mL 含伯胺基的磷脂材料0. l-50mg/mL 胆固醇0. l-40mg/mL PEG 化脂质0. l-20mg/mL 磷酸盐缓冲液10mmol/L，pH 5-9 注射用水余量；所述的抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、紫杉醇或冬凌草素。
3.根据权利要求2所述的ー种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，其特征在干，制备隐形纳米脂质体注射液的组分及其配比为USPIO(28mg Fe/mL) :0.ト5mL 抗肿瘤药物0. 1-lOmg/mL 磷脂材料l-30mg/mL 含伯胺基的磷脂材料0. 2-10mg/mL 胆固醇0. 2-10mg/mL PEG 化脂质l-5mg/mL 磷酸盐缓冲液10mmol/L，pH 5-9 注射用水余量。
4.根据权利要求2所述的ー种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，其特征在干，制备隐形纳米脂质体注射液的组分及其配比为USPIO(28mg Fe/mL) 0. 5mL 盐酸阿霉素lmg/mL SlOO :20mg/mL DOPE :3mg/mL 胆固醇dmg/mL mPEG-DSPE :6mg/mL磷酸盐缓冲液10mmol/L, pH 6注射用水余量。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的一种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，其特征在于，脂质体表面修饰有配体，配体是小分子、多肽或单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的一种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，其特征在于，配体是间皮素单克隆抗体。
7.根据权利要求1、2、3或4所述的一种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，其特征在于，所述的磷脂材料选自天然磷脂或合成磷脂，天然磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂； 合成磷脂为氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二芥酰磷脂酰胆碱、 I-肉豆蘧酰基-2-棕榈酰磷脂酰胆碱或神经鞘磷脂，所选用的磷脂材料为其中的一种或两种以上的混合物。
8.根据权利要求1、2、3或4所述的一种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，其特征在于，所述的的含伯胺基的磷脂材料是磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或两种以上。
9.根据权利要求1、2、3或4所述的一种包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液，其特征在于，所述的的PEG化脂质是聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚己内酯或聚乙二醇-磷脂酰甘油中的一种或两种以上。
10.一种如权利要求I或2所述的包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液的制备方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下A、USPIO的氧化取适量USPIO溶液与pH5-8的磷酸盐缓冲液混合，加入0. 2-3g的高碘酸钠混匀氧化 30min，加0. I-Ig的乙二醇终止反应；过S印hadex-G25柱脱盐，得氧化并纯化的USPIO溶液；B、包封USPIO的隐形纳米脂质体混悬液的制备按配比取磷脂、含伯胺基的磷脂、胆固醇、PEG化脂质溶于30-50mL的氯仿/和乙醚中， 置旋转蒸发仪中37°C旋蒸30-60min去除有机溶剂得脂质膜；向脂质膜中加入适量的USPIO 溶液进行涡旋10-20min，如需加入抗肿瘤药物可继续加入适量的含抗肿瘤药物的磷酸盐缓冲液涡旋数分钟；加入2-4倍体积的氯仿/和乙醚，置于超声器中低温超声20-40min，得均匀不分层的初乳混合物；将上述初乳混合物置于旋转蒸发仪中37°C减压旋蒸20-40min，真空度0. 05-0. IMpa，先形成凝胶再水化成脂质体混悬液；C、纯化脂质体混悬液，进行高压均质，0.22um微孔滤膜过滤灭菌，充氮、分装即得。
11.一种如权利要求I或2所述的包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液在制备MR造影剂中的应用。
12.—种如权利要求I或2所述的包封USPIO的隐形纳米脂质体注射液在制备肿瘤靶向治疗诊断制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，目前尚无文献报道一种体内靶组织选择性好、在靶组织分布浓度高、MR成像灵敏度也高的USPIO制剂。本发明利用隐形纳米脂质体为载体，将MR诊断及治疗整合为一体，同时携载USPIO及抗肿瘤药物，制备稳定有效的隐形纳米脂质体制剂，作为MR造影剂，USPIO隐形纳米脂质体制剂不仅可以提高USPIO在体内的组织选择性，提高灵敏度，更有利于疾病的早期诊断，同时作为肿瘤治疗疗效的评估手段，实时监测肿瘤化疗的疗效，有利于减少病人的过度治疗，减少毒副作用，提高肿瘤治疗的疗效。
文档编号A61K31/704GK102526771SQ20121001612
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者丛锐军, 何志颖, 张佳良, 柯兴发, 王鹏龙, 邓莉, 陈建明 申请人:中国人民解放军第二军医大学