专利名称：鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的试剂的制作方法
技术领域：
本发明属生物学和医学应用领域，涉及一种存在于淋巴细胞来源肿瘤内的microRNA家族成员miR-182，主要涉及利用miRNA_182与淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的相关性。
背景技术：
miRNA-182是2003年新发现的miRNA家族的一成员，目前有些文献报道了其在某些癌症中的功能和活性；新近研究发现其行使着抑癌基因的作用，其与DNA损伤修复相关、调控着细胞的凋亡和增殖，并可参与调节WNT信号途径相关和P53信号途径。但是，microRNA-182在淋巴细胞来源肿瘤发生发展与治疗耐药发生、预后判断等，尚未有明确报道。糖皮质激素(GCs)是血液肿瘤化疗方案中的一线用药，而糖皮质激素耐药则是化疗失败的主要原因，导致疾病的难治和复发。目前关于糖皮质激素耐药机制的研究则是临床亟待解决攻破的主要难题之一。糖皮质激素耐药机制尚有一些最新文献报道，如GR受体变异、糖酵解异常通路相关，但从RNA调控、蛋白翻译水平上的机制探讨尚无先例。并且，糖皮质激素的敏感性判断尚未有快捷、简易的手段。
发明内容
本发明的目的在于提供鉴定 淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的microRNA。在本发明的第一方面，提供一种miRNA-182的用途，包括:用于作为鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的标志物；或用于制备鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的试剂；或用于制备增加淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性或逆转淋巴细胞来源肿瘤对糖皮质激素的耐药性的试剂。在另一优选例中，所述的miRNA-182还用于一些重要的自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜等疾病中对糖皮质激素敏感性判断，亦或用于某些疾病预后评价的指标。在另一优选例中，所述的淋巴细胞来源肿瘤选自但不限于:淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。 在另一优选例中，所述的糖皮质激素是地塞米松。在另一优选例中，所述的鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的试剂是特异性识别或扩增miRNA-182的试剂(如引物或探针)。在本发明的另一方面，提供一种特异性识别或扩增miRNA-182的试剂的用途，用于制备鉴定淋巴细胞来源肿瘤(包括淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)糖皮质激素敏感性的试剂盒。在另一优选例中，所述的试剂盒是(但不限于):PCR检测试剂盒或原位杂交试剂盒。在另一优选例中，所述的特异性扩增miRNA-182的试剂是引物，所述的引物包括:SEQ ID NO:3所示的反转录引物，以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的检测引物对；或所述的特异性识别miRNA-182的试剂是探针，所述的探针特异性识别和结合miRNA-182。在本发明的另一方面，提供一种miRNA-182的下调剂的用途，用于制备增加淋巴细胞来源肿瘤(包括淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)糖皮质激素敏感性或逆转淋巴细胞来源肿瘤(包括淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)对糖皮质激素的耐药性的药物。在另一优选例中，所述的miRNA-182的下调剂是miRNA-182的反义核苷酸。在另一优选例中，所述的反义核苷酸是miRNA-182-ASO。在本发明的另一方面，提供一种抑制淋巴细胞来源肿瘤(包括淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)的药盒，其中包括:miRNA-182的下调剂；以及糖皮质激素。在另一优选例中，所述的miRNA-182的下调剂是miRNA-182的反义核苷酸；或所述的糖皮质激素是地塞米松。
在另一优选例中，所述的药盒中，所述的miRNA-182的下调剂和/或糖皮质激素是
有效量的。在本发明的另一方面，提供一种筛选增加淋巴细胞来源肿瘤(包括淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)糖皮质激素敏感性或逆转淋巴细胞来源肿瘤(包括淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)对糖皮质激素的耐药性的药物的方法，所述方法包括:(I)用候选物质处理表达miRNA-182的体系，所述候选物质是针对miRNA-182的核酸抑制物例如反义核苷酸；和(2)检测所述体系中miRNA-182的表达情况；其中，若所述候选物质可降低miRNA-182的表达，则表明该候选物质是增加淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的药物(包括潜在药物)。在一个优选例中，步骤(I)包括:在测试组中，将候选物质加入到表达miRNA-182的体系中；和/或步骤⑵包括:检测测试组的体系中miRNA-182的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miRNA-182的体系；如果测试组中miRNA-182的表达在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物是增加淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的药物。在另一优选例中，所述的核酸抑制物包括(但不限于):针对miRNA-182设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物。在另一优选例中，所述的体系选自:细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1A、人T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM中，Western Blot方法检测总Fox03a蛋白(Total_Fox03a)与磷酸化Fox03a蛋白(p_Fox03a)的表达。Dex表示地塞米松。左图为Western Blot结果，右图为左图结果以GAPDH标准化的定量结果。图1B、人T淋巴细胞白血病细胞株HUT-78中，Western Blot方法检测总Fox03a蛋白(Total_Fox03a)与磷酸化Fox03a蛋白(p_Fox03a)的表达。Dex表示地塞米松。左图为Western Blot结果，右图为左图结果以GAPDH标准化的定量结果。图1C、在T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM和HUT-78中，磷酸化Fox03a蛋白与总Fox03a蛋白的比例。图2A、人T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM的转染效率。图2B、人T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM中，RT-PCR检测miRNA-182在转染后的表达量情况。 图2C、人T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM中，转染miRNA-182-mimics后Fox03a蛋白及磷酸化的Fox03a蛋白的表达情况。图2D、人T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM中，转染miRNA-182-mimics且在转染24小时后加入地塞米松，Fox0·3a蛋白及磷酸化的Fox03a蛋白的表达情况。图3A、人T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM中，转染miRNA-182-mimics后，可拮抗DEX诱导的凋亡。图3B、人T淋巴细胞白血病细胞株各设置组中，早期凋亡下调、晚期凋亡下调的情况。图3C、通过Western blot检测凋亡分子Bim的蛋白表达水平。图4A、对糖皮质激素耐药的细胞株HUT-78，转染miRNA-182-ASO可增强细胞对DEX的敏感性。图4B、细胞株HUT-78各设置组中，早期凋亡下调、晚期凋亡下调的情况。图4C、通过Western blot检测凋亡分子Bim的蛋白表达水平图5A、用10 ii M的地塞米松处理Molt-4、Jurkat48，小时后凋亡检测情况。图5B、用药(DEX)前后野生型原代脾细胞、SUP-B15细胞的凋亡情况。图5C、人白血病细胞株Molt-4和Jurkat在不同浓度地塞米松作用下的凋亡率比较。图用CCK-8检测法对两种细胞株的耐药系数进行比较。图6、抽取多种淋巴细胞来源的肿瘤细胞株(人源性细胞株SUP-B15、Jurkat,Molt-4、CCRF-CEM、HUT-78, Daudi (A)和鼠源性细胞株脾细胞、SP2/0、EL-4、L1210(B))的RNA,反转录成cDNA，用2_a ACt方法实时定量检测miRNA-182的表达情况。
具体实施例方式本发明人经过长期的研究，意外地发现miRNA-182与淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性密切相关，其在糖皮质激素耐药性的淋巴细胞来源肿瘤(细胞)中异常高表达。基于本发明的揭示，所述的miRNA-182可用于作为鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的标志物。miRNA-182的下调剂可用于增加淋巴细胞来源肿瘤对于糖皮质激素类药物的敏感性，从而提高糖皮质激素类药物的临床疗效。miRNA-182本发明中，所述的miRNA-182是具有SEQ ID NO:1所示核酸序列的小核糖核酸:UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU(SEQ ID NO:1)miRNA-182是为一种本领域已知的microRNA (miRNA)小分子，其对于调控RNA是有用的。然而，对于miRNA-182结合的靶点和其与糖皮质激素敏感性或糖代谢之间的关系目前并不清楚。miRNA-182可以在体内沉默Fox03a。Fox03a是一个50kD的转录因子，也称为Scurf in、JM2、IPEX。它是一个主要调节基因，也是调节性T细胞的特异性标志。Fox03a也是一种在糖皮质诱导的淋巴细胞凋亡中发挥着重要作用的核转录因子。miRNA-182可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了miRNA-182或其前体的序列后，本领域人员可以方便地制备获得miRNA-182或其前体。miRNA-182作为鉴定糖皮质激素敏感性的标志物本发明人意外地发现，miRNA-182是一个新的、与糖皮质激素敏感性密切相关的药物靶点，其通过调控与凋亡密切相关的分子Fox03a行使功能。针对miRNA-182的各种检测试剂可以用于鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性；针对miRNA-182的治疗手段可以作为提高细胞对糖皮质激素敏感性的新颖和有效的手段。如本文所用，所述的“淋巴细胞来源肿瘤”是指来源于淋巴细胞及其前体细胞的肿瘤，又称为淋巴样肿瘤。较佳地，所述的“淋巴细胞来源肿瘤”包括淋巴瘤、淋巴细胞白血病和骨髓瘤等。在外源性干预miR-182的实施例中:1)选择转染效率较高的细胞株CCRF-CEM，过表达miR-182，发现在淋巴细胞来源肿瘤中，miR-182可抑制总的Fox03a蛋白表达水平，不影响磷酸化的Fox03a蛋白表达水平，且随着转染剂量的增加，抑制效果越明显。2)过表达miRNA-182，可抵抗糖皮质激素诱导的凋亡；在CCRF-CEM细胞株中，过表达miRNA-182，I μ M浓度地塞米松作用下，与空白对照相比，凋亡率被下调，凋亡分子Bim表达量较低。3)沉默miRNA-182，可增加淋巴细胞来源肿瘤细胞株对糖皮质激素诱导的凋亡；在HUT-78细胞株中，沉默miRNA-182，10 μ M浓度地塞米松作用下，凋亡率较空白对照上调，凋亡分子Bim表达量较高。在相关淋巴细胞来源肿瘤细胞株miR-182的检测分析实施例中:1)用流式细胞术(FCM)行凋亡检测，筛选和鉴定糖皮质激素敏感淋巴细胞来源肿瘤细胞株和糖皮质激素淋巴细胞来源肿瘤耐药细胞株，以及用CCK-8法进行不同淋巴细胞来源肿瘤细胞株的糖皮质激素耐药程度比较并归类。2)检测miR-182在不同糖皮质激素敏感性的细胞株的表达谱。结果发现，在糖皮质激素耐药的细胞株中，miR-182表达量相对较高，明显高于糖皮质激素敏感细胞株。表明miR-182的异常表达，可能与淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素的耐药发生相关。基于本发明人的上述新发现，可以将miRNA-182作为鉴定糖皮质激素敏感性的标志物:(i)进行淋巴细胞来源肿瘤的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的淋巴细胞来源肿瘤治疗药物、药 物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估糖皮质激素类药物的疗效，优化治疗方案。比如，可分离出由miRNA-182基因表达异常相关的淋巴细胞来源肿瘤，从而可进行更有针对性的治疗。因此，本发明提供了 miRNA-182的用途，用于制备鉴定淋巴细胞来源肿瘤的糖皮质激素敏感性的试剂或试剂盒。可采用各种本领域已知的技术来检测细胞内miRNA-182的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如原位杂交发，聚合酶链式反应技术(PCR), Southern印迹法、DNA序列分析等,这些方法可结合使用。本发明还提供了用于在分析物中检测miRNA-182的存在与否以及表达情况的试齐U。作为一种优选方式，可以采用特异性扩增miRNA-182的引物；或特异性识别miRNA-182的探针来确定miRNA-182的存在与否。作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出miRNA-182。更优选的，所述的引物所述的引物包括:SEQ ID NO:3所示的反转录引物，以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示 的检测引物对。该引物扩增获得的扩增产物特异性高，对于复杂体系的扩增也具有良好的特异性。所述的特异性识别miRNA-182的试剂是探针，所述的探针特异性识别和结合miRNA-182。针对miRNA-182的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与miRNA-182上特定位点发生特异性结合，而不与miRNA-182以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。目前，多种淋巴细胞来源肿瘤和一些重要的自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜等疾病中，糖皮质激素是不可或缺的重要用药之一。miRNA182则可成为是糖皮质激素敏感性判断的一个标准，可成为这些疾病预后判断的指标。因此，本发明将miRNA-182作为诊断淋巴细胞来源肿瘤的标志物，具有较强的理论意义和临床价值。本发明人在多种不同糖皮质激素敏感性的淋巴细胞来源肿瘤的miRNA-182表达谱中均发现了其与糖皮质激素敏感性程度相关的规律性。证明了 miRNA-182对于鉴定糖皮质激素敏感性的重要性，本发明具有检测方便、有效、经济、安全、技术难度低等特点，进一步可以适用于判断其它自身免疫性疾病以及作为预后评价的指标等。本发明提供了一种可以有效、经济、安全、技术难度低的检测指标。检测miRNA-182的试剂盒本发明还提供了用于在分析物中检测miRNA-182的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括:特异性识别或扩增miRNA-182的试剂。该试剂盒可用于鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性。作为一种优选方式，所述的试剂盒是PCR检测试剂盒，其中包括特异性扩增miRNA-182的引物。更佳地，所述的引物具有5’ CGGCGGTTTGGCAATGGTAGAACT 3’和5’ CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT3’ 所示的核苷酸序列。作为一种优选方式，所述的试剂盒是:PCR检测试剂盒或原位杂交试剂盒。其中包括特异性识别miRNA-182的探针，所述的探针具有5’_AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA_3’所示的核苷酸序列，且还具有可检测信号。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于:抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。miRNA-182为靶点的药物筛选在得知了 miRNA-182与糖皮质激素敏感性的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制miRNA-182的物质。之后，可从所述的物质中找到对于提高细胞对糖皮质激素敏感性真正有用的药物。因此，本发明提供一种筛选增加淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性(逆转淋巴细胞来源肿瘤对糖皮质激素的耐药性)的药物的方法，所述的方法包括:用候选物质处理表达miRNA-182的体系；和检测所述体系中miRNA-182的表达情况；其中，若所述候选物质可降低miRNA-182的表达，则表明该候选物质是增加淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的药物(包括潜在药物)。所述的表达miRNA-182的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miRNA-182的细胞；或可以是重组表达miRNA-182的细胞。所述的表达miRNA-182的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miRNA-182的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miRNA-182的体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于提高糖皮质激素敏感性真正有用的物质。基于miRNA-182的作用机理为:通过抑制Fox03a蛋白表达,进而发挥提高糖皮质激素敏感性的作用。因此还可以在筛选体系中表达Fox03a蛋白。从而，可通过进一步观察所述体系中Fox03a蛋白的表达 情况来分析候选药物的有效性。若Fox03a蛋白表达发生下调，则表明该候选物质是提高糖皮质激素敏感性的物质；或者，检测所述体系中miRNA-182与Fox03a基因的相互作用(结合或互补)，若相互作用减弱，则表明该候选物质是提高糖皮质激素敏感性的物质。另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的提高糖皮质激素敏感性的物质。miRNA-182下调剂及其用途基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种miRNA-182下调剂的用途，用于制备提高糖皮质激素敏感性的药物。如本文所用，所述的“miRNA-182下调剂”包括了核酸抑制物、拮抗剂、抑制剂、阻滞齐U、阻断剂等，只要它们能够下调miRNA-182或其前体的表达水平。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。所述的miRNA-182下调剂是指任何可阻止miRNA-182或其前体与其靶向序列结合、降低miRNA-182或其前体的活性、降低miRNA-182或其前体的稳定性、下调miRNA-182或其前体的表达、减少miRNA-182或其前体有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调miRNA-182有用的物质，从而可用于提高细胞对于糖皮质激素的敏感性。例如，所述的下调剂是:核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调miRNA-182的表达。作为本发明的一种优选方式，所述的下调剂是核酸抑制物。较佳地，所述的核酸抑制物通过阻止miRNA-182与其祀向序列结合,从而发挥作用。所述的核酸抑制物例如选自(但不限于):miRNA-182的反义核酸，miRNA-182的锁核酸反义核酸；肽核酸；siRNA(沉默miRNA-182 前体)。作为本发明的优选方式，所述的miRNA的抑制剂是miRNA-182的反义核酸。如本文所用，“反义核酸”又称为“反义核酸”或“反义寡核苷酸(AS-ONs，AS0,AntiSense-Oligonucleotides) ”或“反义药物”，是指长度约为15-30个碱基的DNA分子、RNA分子它们的经修饰的形式或它们的类似物，可与mRNA互补。本领域人员均了解，根据本发明提供的反义核酸，可以进行适当的变化并保留其活性，这些变化形式均可用于本发明。任何可起到抑制或沉默miRNA-182的作用的反义核酸都是可用于本发明的，其类型不限于DNA或是RNA。例如，所述的miRNA的反义核酸是与miRNA-182的序列基本上(较佳地为完全)互补的序列。例如，所述的miRNA-182的反义核酸与SEQ ID NO:1所示的序列或其互补序列具有80%以上的相同性，较佳地具有85%以上的相同性，更佳地具有90 %以上的相同性，最佳地具有95 %以上的相同性，如具有96 %、97%、98%或99%以上的相同性。现有技术中已经指出了一些反义核酸的变化形式是可取的，它们也可以针对相应的革巴序列发挥抑制作用。如 Improved targeting of miRNA with antisenseoligonucIeotides (2294-2304Nucleic `Acids Research, 2006, Vol.34，N0.8)文献中提到，在反义核酸的两个末端截短I个碱基是可以保留其活性的。又如Designand delivery of antisenseoligonucleotides to block microRNA function in culturedDrosophila and humancells (NATURE PROTOCOLS ；V0L.3 N0.10 ；2008 ;1537_1549)文献综述了多个研究，认为一般而言，在反义核酸的两边延长一些碱基是可以的。而在反义核酸和miRNA间亲和性很高(如锁核酸修饰)时，反义核酸可以被截短到约2/3长度。如本文所用，所述的“严格条件”是指:(I)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC，0.1% SDS,60°C ;或(2)杂交时加有变性剂，如50% (v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1% Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。在本发明中，所述的“反义核酸”还包括经修饰的反义核酸，所述的修饰基本不改变反义核酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义核酸的活性、稳定性或治疗效果。对反义核酸的修饰包括但不限于:锁核酸修饰、甲氧基化修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸骨架由磷脂连接骨架代替，这些修饰均是本领域技术人员易于实现的。优选地，所述的修饰为锁核酸修饰。药盒本发明还提供了一种药盒，它含有有效量的所述的miRNA-182的下调剂(较佳地其还与药学上可接受的载体相混合)；以及有效量的糖皮质激素。所述miRNA-182的下调剂可用于提高糖皮质激素敏感性，从而它们联合给药可以降低细胞对于糖皮质激素的敏感性，提闻糖皮质激素的疗效。糖皮质激素是一种激素，主要影响正常物质代谢过程，是维持机体自体稳定的重要物质。地塞米松是糖皮质激素中的一种，具有抗炎、抗过敏、抗风湿、免疫抑制作用，主要用于治疗严重细菌感染和严重过敏性疾病、各种血小板减少性紫癜、粒细胞减少症、严重皮肤病、器官移植的免疫排斥反应、肿瘤治疗及对糖皮质激素敏感的眼部炎症等。如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在药物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。所述的miRNA-182下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的miRNA-182下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、地塞米松活性与Fox03a表达水平的相关性本发明人选取了人T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM (购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库，对地塞米松敏感)、HUT-78 (购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库，对地塞米松不敏感)，使用50nM地塞米松(Dex)预孵育这些肿瘤细胞株，48小时后收取细胞蛋白，应用特异性抗Fox03a蛋白的抗体(兔抗,购自Cell Signaling公司)与特异性抗磷酸化Fox03a蛋白的抗体(兔抗,购自Cell Signaling公司)，通过常规的Western Blot方法检测总Fox03a蛋白与磷酸化Fox03a蛋白的表达。结果如图1，对50nM地塞米松敏感的CCRF-CEM，用地塞米松处理后，总的Fox03a被明显上调，磷酸化Fox03a表达被明显下调,二者呈负相关(A、C);而对50nM地塞米松耐药的HUT-78，总的Fox03a和磷酸化Fox03a 二者未发现明显改变，没有显著的统计学差异(*P > 0.05) (B、C)。因此，在地塞米松发挥活性功能的过程中，Fox03a是不可或缺的参与者。并且，本发明人发现，在不同的淋巴细胞来源肿瘤细胞株，上调Fox03a总蛋白表达量决定着细胞株本身对激素的敏感程度，改变Fox03a的总体表达水平与改变其磷酸化状态，一样很重要。实施例2、miRNA-182的功能与Fox03a相关选择人T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM，其转染效率可达84.57% (图2A)。用INTERFERinTM向细胞内转染miRNA-182-mimics，转染量分别为20nM和50nM，72h后收集细胞，抽提细胞中的RNA，逆转录为cDNA，利用特异性检测miRNA-182的引物通过RT-PCR检测CCRF-CEM细胞miRNA-182的表达情况。设miRNA阴性对照(miRNA-N.C.)，选18S RNA作为内参。miRNA-182mimics、miRNA对照的序列以及RT-PCR引物如下:miRNA-182-mimics(图中示为 miR-182 或 miR182)序列:正义:5’UUUGGCAAUGGUAGAACUCACA CU 3’ (SEQ ID NO:1)；反义:3’UGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA UU 5’ ；miRNA-N.C.(NC mimics)序列:AGUGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA(SEQ ID NO:2)。miRNA-182 引物:反转录(RT)引物:5’ GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGTG3’ (SEQ ID NO:3)；检测引物:正向:5’CGGCGGTTTGGCAATGGTAGAACT 3’ (SEQ ID NO:4);反向:5’ CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT 3’ (SEQ ID NO:5)；miRNA-N.C.
正向:5’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3’ (SEQ ID NO:6)；反向:5，ACGUGACACGUUCGGAGAATT3，(SEQ ID NO:7)；18S RNA:正向:5，GTAACCCGTTGAACCCCATT-3’(SEQ ID NO:8)；
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反向:5’CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’ (SEQ ID NO:9)。如图2B所示，随着miRNA-182转染量的增加，miRNA-182表达量上调。本发明人将转染miRNA-182 20nM和50nM，72h后收集细胞，Western blot检测总Fox03a蛋白、磷酸化Fox03a蛋白的表达情况，选GAPDH作为内参。结果如由图2C，可以看到，与NC相比，转染miRNA-182后Fox03a蛋白表达量可下降，50nM的转染量抑制效果最明显，但磷酸化Fox03a蛋白未明显改变；地塞米松组则在转染24小时后加入，使药物终浓度为I μ M (图2D)，孵育48小时后收蛋白，与NC相比，转染miRNA-182后Fox03a蛋白表达量可下降，50nM的转染量抑制效果最明显；但磷酸化Fox03a蛋白未见明显改变。上述结果提示，在淋巴细胞来源肿瘤细胞株中，miRNA-182发挥着不容忽视的角色作用，它可通过调控与凋亡密切相关的分子Fox03a行使功能。实施例3、肿瘤内过表达miR182可拮抗地塞米松诱导的凋亡选择用高转染效率、对糖皮质激素敏感的细胞株CCRF-CEM，取对数生长期细胞，参照INTERFERin 24孔板转染方案，分别转染50nMmiRNA-182-mimics和NC-mimics，设立地塞米松组和无水乙醇组，对应每组有三个实验复孔。在细胞转染24小时后，分别加入地塞米松(DEX)和无水乙醇(ethanol)，孵育48小时后，收集细胞用流式细胞仪行凋亡检测。结果发现，加入DEX的组，miRNA-182-mimics实验孔细胞可拮抗DEX诱导的凋亡，早期凋亡和晚期凋亡均被下调(见图3A)，与加入DEX的NC-minics实验孔相比，早期凋亡下调5% ±1.04%，晚期凋亡下调7% ±0.91%，*Ρ、#Ρ均<0.05，差别具有统计学意义(见图 3Β)。同时，本发明人收集细胞蛋白，通过Western blot检测凋亡分子Bim的蛋白表达水平(见图3C)，NC-mimics与miRNA-182-mimics无明显差别；地塞米松孵育后，miRNA-182-mimics实验孔凋亡蛋白Bim表达水平明显被下调。可见，淋巴细胞来源的肿瘤内过表达miR182可拮抗地塞米松诱导的凋亡。实施例4、肿瘤细胞株中抑制miR-182增加细胞株对地塞米松的敏感性选择用较高转染效率、对糖皮质激素耐药的细胞株HUT-78，取对数生长期细胞，参照INTERFERinTM 24孔板转染方案，分别转染50nMmiRNA-182_AS0 (购自Ambion公司)和NC-ASO (购自Ambion公司)，设立地塞米松组和无水乙醇组，对应每组有三个实验复孔。在细胞转染24小时后，分别加入地塞米松和无水乙醇，孵育48小时后，收集细胞用流式细胞仪行凋亡检测。本发明人发现，转染miRNA-182-ASO可增强细胞对DEX的敏感性，早期凋亡和晚期凋亡均高于NC-ASO(见图4A)，早期凋亡上调4% ±0.14%，晚期凋亡上调2% ±0.24%,*P、**P均< 0.05，差别具有统计学意义(见图4B)。同时，本发明人收集细胞蛋白，通过Western blot检测凋亡分子Bim的蛋白表达水平(见图4C)，并用Multi Gauge扫描其灰度发现无水乙醇作用下，NC-ASO与miRNA-ASO无明显差别，差别无统计学意义；地塞米松处理后，miRNA-ASO实验孔凋亡蛋白表达水平明显高于NC-ASO实验孔(见图4D)。可见，淋巴细胞来源的肿瘤细胞株中抑制miR-182可增加细胞株对地塞米松的敏感性。实施例5、淋巴细胞来源肿瘤激素耐药的发生与细胞异常高表达miRNA-182密切相关分析多种淋巴细胞来源肿瘤细胞株的miRNA-182表达水平:Molt_4(购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库)、Jurkat(购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库)、CCRF-CEM、HUT-78、SUP-B15(购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库)、Daudi细胞(购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库)、以及野生型淋巴细胞脾细胞。抽取各淋巴细胞来源的肿瘤细胞株的RNA，反转录成cDNA，用2_Δ "ct方法实时定量检测，发现miRNA-182在淋巴细胞来源肿瘤中的表达各异。定量检测的引物是miRNA-182引物:RT 引物:5，GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGTG 3，(SEQ IDNO:3)；正向:5，CGGCGGTTTGGCAATGGTAGAACT3，(SEQ ID NO:4)；反向:5，CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT3，(SEQ ID NO:5)；人源性细胞株中(见图6A)糖皮质激素耐药细胞株T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat> Molt-4中miRNA-182的表达丰度较高,且Jurkat表达量明显高于Molt_4,而糖皮质激素敏感细胞SUP-B15最低。鼠源性淋巴细胞中(见图6B)，小鼠慢性淋巴细胞白血病细胞株L1210(购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库)中miRNA-182表达丰度最高，淋巴瘤细胞株EL-4 (购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库)仅次，骨髓瘤细胞SP2/0表达丰度相对较低，野生型细胞脾细胞表达量极低。
之后，本发明人验证了多种瘤细胞株的耐药性，如下:多种淋巴细胞来源肿瘤细胞株:Molt_4(购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库)、Jurkat (购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库)、CCRF-CEM、HUT-78、SUP-B15(购自中国科学院上海生物化学与细胞研究所细胞库)以及野生型淋巴细胞脾细胞，分别给予不同浓度的地塞米松作用于细胞，采用凋亡检测的方法，进行凋亡率比较。用10 μ M的地塞米松处理Molt-4、Jurkat, 48小时后行凋亡检测(图5A)，发现用地塞米松实验组与用DMSO对照组相比，凋亡无明显增加，Molt-4对照组与实验组凋亡分别为 2.63% ±0.12%和 2.64% ±0.14%，Jurkat 用药前后凋亡分别为 3.39% ±0.28%和3.40% ±0.34%，两组差别无统计学意义。而用IOOnM的地塞米松处理野生型原代脾细胞8小时后，凋亡明显发生，凋亡率达55.4% ±1.28% (地塞米松组)，与用药前20.2%±0.28% (无水乙醇组)的凋亡率相比，差别显著，具有统计学意义(图5B);用IOOnM的地塞米松处理SUP-B15细胞36小时后行凋亡检测，凋亡明显发生，凋亡率达63.9%±1.08%，与非用地塞米松组10.1% ±0.98%的凋亡率相比，差别显著，具有统计学意义(图5B)。可见SUP-B15细胞、野生型原代脾细胞明显对地塞米松敏感，而Molt-4、Jurkat明显较之耐药。同时，本发明人对比了人白血病细胞株Molt-4和Jurkat在不同浓度地塞米松作用下的凋亡率比较，横坐标是不同浓度的地塞米松，纵坐标是凋亡率，由趋势图可见，Jurkat明显比Molt-4耐药(图5C)。本发明人又用CCK-8法检测，对两种细胞株的耐药系数相比，横坐标为不同浓度的地塞米松，纵坐标表示细胞存活率，由趋势图走向比较明显可见，CCRF-CEM明显敏感于HUT-78 (图 OT)。上述结果可见，淋巴细胞来源的肿瘤激素耐药的发生与细胞异常高表达miRNA-182密切相关。通过检测细胞内的miRNA-182可以准确地反映细胞对于地塞米松的敏感性情况。实施例6、临床用药指导获得临床淋巴细胞 来源肿瘤患者的肿瘤组织，分离出肿瘤细胞。常规方法培养，抽取各淋巴细胞来源肿瘤细胞 的RNA，反转录成cDNA，用2_δδμ方法实时定量检测细胞内miRNA-182表达丰度，并以敏感性中等的Daudi细胞作为对照细胞。若检测结果，miRNA-182表达丰度显著高于Daudi细胞，则认为该肿瘤患者的肿瘤是糖皮质激素耐药性的，不适用糖皮质激素类药物的治疗；若检测结果miRNA-182表达丰度显著低于Daudi细胞，则认为该肿瘤患者的肿瘤是糖皮质激素敏感性的，适用糖皮质激素类药物治疗。上述方法初步用于临床20名患者，根据临床医师用药效果跟踪，发现该方法可较为准确地界定适用糖皮质激素类药物治疗的患者，准确率高于80%。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种miRNA-182的用途，包括: 用于作为鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的标志物；或 用于制备鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的试剂；或 用于制备增加淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性或逆转淋巴细胞来源肿瘤对糖皮质激素的耐药性的试剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的淋巴细胞来源肿瘤选自:淋巴细胞白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖皮质激素是地塞米松。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的试剂是特异性识别或扩增miRNA-182的试剂。
5.一种特异性识别或扩增miRNA-182的试剂的用途，用于制备鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的试剂盒。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的特异性扩增miRNA-182的试剂是引物，所述的引物包括:SEQ ID NO:3所示的反转录引物，以及SEQID NO:4和SEQ ID N0:5所示的检测引物对；或 所述的特异性识别miRNA-182的试剂是探针，所述的探针特异性识别和结合miRNA-182。
7.—种miRNA-182的下调剂的用途，用于制备增加淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性或逆转淋巴细胞来源肿瘤对糖皮质激素的耐药性的药物。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的miRNA-182的下调剂是miRNA-182的反义核苷酸。
9.一种抑制淋巴细胞来源肿瘤的药盒，其中包括: miRNA-182的下调剂；以及 糖皮质激素。
10.如权利要求9所述的药盒，其特征在于，所述的miRNA-182的下调剂是miRNA-182的反义核苷酸；或 所述的糖皮质激素是地塞米松。
全文摘要
本发明涉及鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的试剂。本发明首次揭示miRNA-182与淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性密切相关，其在糖皮质激素耐药性的淋巴细胞来源肿瘤中异常高表达。因此，所述的miRNA-182可用于作为鉴定淋巴细胞来源肿瘤糖皮质激素敏感性的标志物。miRNA-182的下调剂可用于增加淋巴细胞来源肿瘤对于糖皮质激素类药物的敏感性，从而提高糖皮质激素类药物的临床疗效。
文档编号A61P35/00GK103243151SQ20121002672
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月7日 优先权日2012年2月7日
发明者谢彦晖, 杨阿碰 申请人:谢彦晖