专利名称：一种基于分步凝胶化原理的三维细胞组装方法
技术领域：
本发明涉及一种基于离散/堆积成形及分步凝胶化原理的三维细胞组装方法，属于组织工程技术领域。
背景技术：
由于复杂器官人工制造科学和技术发展的强劲要求，如何将细胞组装成稳定的三维结构日益成为学术界、技术界乃至工程界关注的热点。所谓细胞组装，其物理本质为用某种仿生的细胞外基质材料(ECMs,Extra-Cellular Matrixs)将细胞固定在某一空间要求的点位上。空间的各点、各种细胞及其它生命物质均在ECMs的固结下形成一个空间网络，一种空间微环境，所有细胞在其中进行各种生理代谢活动。这种人工仿生外基质材料与各种功能细胞和生命物质形成的结构物被称为类组织前体或计算机辅助成形的人工组织前体 (AnalogyTissue Precursor 或 Artificial Tissue Precursor, ATP)。细胞在 ATP 中分裂并随着仿生ECMs的降解而由细胞分泌的ECMs完成复杂三维细胞组装结构的进一步塑型， 继续体外或植入体内培养形成具有某种功能的组织或器官(原始器官)。ECMs固定细胞形成ATP的原理无非是物理交联(通过控制物理条件使含有细胞的人工ECMs凝胶化化)和化学交联(通过控制化学条件使人工ECMs凝胶化化)以及他们的组合。目前的交联工艺有许多种I. Clemson大学的Cell Printing。这是一种深度的物理交联方式，即控制适合的物理参数(温度，湿度等等)，采用完全物理凝胶化而无其它步骤。用类似喷墨打印机喷头将以合适黏度的细胞团簇/水凝胶共混材料低温下喷射堆积成形，待细胞自行粘连后，升温，水凝胶自行解体而去除。2. EnvisionTec公司的Bio-Plotting。这是一种化学交联与物理交联相结合的方式。将上述含有细胞的共混成形材料直接喷入具有交联作用的化学溶剂中，使之凝胶化。由于随喷随凝胶化，因而凝胶化是伴随成形的实时过程。当然，该技术也可控制交联化学溶剂的温度等物理参数，使物理交联的过程与上述化学交联过程同时进行。3.“原位交联凝胶化”。即在喷射或挤出含有细胞团簇的ECMs微滴(Droplets)的着陆点(沉积位置)附近，触发相应的凝胶化条件(在空间中充满雾化的触发剂或者喷射触发剂)，材料迅速发生溶胶-凝胶转变，形成具有一定的形态和强度的细胞-材料凝胶。同时，还可以控制成形室的温度，使物理粘连的作用也产生影响，从而达到更佳的固化水平。纵观各种各具特色的细胞组装方法，可以发现它们的共同特点是采用了一种单步式凝胶化原理(模式)，即用一种物理的或化学的，或物理-化学或化学-物理的方法，使液态的(富含细胞的)物质转变成凝胶态的(保证细胞生存所需的良好生理、化学物理条件)结构。在人们接触此类科学和技术问题初期，由于对此种成形要求认识有限，此种技术路线指导理念是十分自然的。中国发明专利(申请号200410009787.4)公开了一种“一种细胞-材料单元的三维受控堆积成形方法”，该方法以“原位交联凝胶化”的技术路线为指导理念，采用离子浓度敏感材料为海藻酸钠，触发离子为Ca离子，整个成形过程及方法只是考虑了堆积过程几何结构成形要求，并没有考虑堆积后ATP在体外培养过程中几何结构的保持能力，而几何结构的保持能力是ATP体外培养或者体内植入的重要特性。这一过程中，膨胀和离子置换是影响培养过程中结构体不稳定的主要因素，而存在于培养过程中这两大因素是不可避免的。由于对ATP的要求是多方面的，首先是几何结构成形，从形状随意的、液态、胶态等物理状态变成形状，结构和尺寸固定的形态，细胞才有可能完成空间排布的第一步。这种物理状态的转变伴随着复杂结构的成形。它是ATP制造的先决步骤，作为细胞团簇生长的微环境的生理、化学、物理性质如表面形状，弹性，材料降解率，生物相容性以及耐久性等等，则是结构形成后才谈得上的要求。故将诸多的要求分步来实施，以减少技术和工程上的冲突，保证成形质量、降低成本、减少交叉感染、提高成形效率、降低控制的复杂程度，则是更加合理的ATP制造模式。将凝胶化分成多步完成，比如分为两步第一步仅以形态、梯度结构、尺寸大小和孔隙率方面即几何要素方面为目标；而成形结构的弹性、强度、耐久性、表面形状、仿生 ECMs的降解率、对生物材料和细胞的活性的支持等为第二步凝胶化调控的主要目标。当然， 分步的方式与被成形材料和细胞种类有关还含有多种分步方法。
发明内容
本发明的目的在于降低细胞组装过程复杂程度和提高组装后ATP的长期结构稳定性。提供一种基于分步凝胶化原理的三维细胞组装方法，实现一种或多种细胞在复杂CAD 模型的直接驱动下通过准确定位进而组装成设计的三维结构体，保证整个组装过程中细胞具有高的存活率及可调控的生存微环境，构建组织器官雏形并实现其长期稳定培养。本发明的技术方案如下一种基于分步凝胶化原理的三维细胞组装方法，其特征在于该方法按如下步骤进I)将温度敏感和一种或多种离子浓度敏感的生物可降解材料制备成水溶液，浓度为20 100g/L，其中的温度敏感与离子浓度敏感的生物可降解材料的质量比为I : O. 5 I，将所述溶液灭菌备用；2)选定一种或多种细胞，分别与灭菌的溶液混合均匀，制备成细胞-材料溶液的混合物并装入不同的料腔中；置于无菌4°C 10°C环境下5min 20min预凝胶化，凝胶化时间由材料的浓度决定；3)根据预先设计的CAD结构模型，在计算机控制下，将所述的各个细胞-材料凝胶的料腔装载在成形设备上并配以相应的喷头，通过挤压或喷射形成离散的微滴或连续的微流状细胞-材料微组装单元，在成形平台的同步运动下逐点逐层堆积成与预设计结构一致的 ATP ；4)在堆积成形的过程中，细胞-材料单元在有温控的成形环境下，保持凝胶状态， 故此过程堆积形成的ATP是一个亚稳态结构；5)将堆积成形的亚稳态结构ATP在离子触发条件下先进行一定程度的离子交联，3/5页
缓冲液冲洗，再在终交联剂中交联，最终形成长期稳定培养的结构体。本发明所述的温度敏感物可降解材料为明胶；所述的离子浓度敏感的生物可降解材料采用蛋白质、多糖、糖蛋白、蛋白多糖、氨基酸或生长因子的单一一种或者共混材料，如海藻酸钠、壳聚糖等，触发离子为Ca离子、Na离子等；所述的交联剂为戊二醛交联剂，浓度为O. 8% I %，交联时间为15s 60s ;缓冲液为灭菌的磷酸缓冲液或者是O. 9%的生理盐水。本发明具有以下优点及突出性效果I)通过分步控制共混材料的温敏和化学交联双重特性，既避免了单纯物理交联后的热稳定性和力学稳定性不高的问题，同时也避免了成形过程中完全化学交联形成的界面特性使后继材料难以粘结和不完全化学交联控制复杂的问题。成形过程易于控制，成形结构体具有高的细胞存活率。2)本发明所采用的工艺方法能够保持结构体的长期宏观稳定性，通过控制交联剂浓度及交联时间，可调控成形结构体的强度、降解性等，解决了困扰细胞组装结构体长期体外培养不稳定的问题。
图I为基于分步凝胶化原理的三维细胞组装方法的工艺流程示意图。图2为实现本发明的工艺方法的成形系统示意图。图I为本发明的工艺路线。将温度敏感和一种或多种离子浓度敏感的生物可降解材料，在室温下制备成浓度为20 100g/L水溶液，其中的温度敏感材料与离子浓度敏感材料质量比为I : O. 5 1，将所述溶液灭菌备用；所选择的温度敏感材料能够溶解于水形成溶胶，在0°C 10°C之间具有敏锐的温度敏感性，能够快速发生溶胶-凝胶转变，所选择的离子浓度敏感材料能够溶解于水形成溶胶，具有特殊的离子浓度敏感特征，能够在特定的离子的触发条件下发生溶胶-凝胶转变，所有触发条件都在细胞的生理条件之内。图2为实现本发明的工艺方法的成形系统示意图。选定一种或多种细胞，分别与灭菌后的溶液混合均匀，制备成细胞-材料溶胶溶液混合物；将一种或多种混合物装入挤压/喷射组装成形设备中，其系统组成示意图如图2所示。整个装置包括挤压/喷射喷头组(21);三维运动平台(22)、挤压/喷射驱动装置(23)、温控成形室(24)、控制软硬件(25) 等；在计算机CAD模型直接驱动下，通过控制各喷头的挤压喷射运动及三维运动平台的运动，将上述细胞-材料混合物通过不同的喷头挤压/喷射出的细胞材料微单元堆积到空间指定位置；在相应的温控环境条件下保持亚稳态结构，通过逐点逐层的堆积，得到具有一定的结构的组织器官雏形。
具体实施例方式实施例I :通过该工艺方法制造的软骨细胞-明胶-海藻酸钙三维结构。将明胶和海藻酸钠混合物制备成水溶液，浓度为100g/L，其中海藻酸钠和明胶的质量比为3 7， 70°C烘箱中间歇式灭菌2小时备用；将5g氯化钙溶于IOOmL的磷酸缓冲液中形成5%氯化钙溶液，PH调节至7. 4，高温灭菌备用；将50%的戊二醛用灭菌的磷酸缓冲液稀释50倍形成I %戊二醛溶液，O. 22 um滤膜过滤后备用；取浓度为2 X 106/mL软骨细胞悬液200 μ L与灭菌好的上述明胶海藻酸钠共混物材料800 μ L均匀共混，得到浓度约为2 X IOfVmL的软骨细胞-海藻酸钠明胶基共混材料；将细胞-材料混合物装入料腔并配装喷头；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述混合物在温控成形室通过微流挤压的方法堆积成形； 将成形的结构体在5%氯化钙溶液中交联5分钟后，用灭菌的O. 9%生理盐水冲洗3次，1% 戊二醛交联15s，0. 9%生理盐水冲洗3次，得到最终可用于体外培养或者体内植入的含有软骨细胞的三维结构体。实施例2 :通过该工艺方法制造的肝实质细胞-明胶-壳聚糖三维结构体。将壳聚糖溶于醋酸缓冲溶液(O. lmol/L, CH3COOH)中，用lmol/L NaOH溶液调整其pH值到5，然后用磷酸缓存溶液(PBS)定容，得到2%壳聚糖溶液。将明胶溶于PBS缓冲液中，形成18% 的明胶溶液，将两种溶液按I : I的比例均匀共混，PH调节至7.2，70°C烘箱中间歇式灭菌 2小时；将3g多聚磷酸钠溶于IOOmL的磷酸缓冲液中形成3%多聚磷酸钠溶液，pH调节至
7.4，高温灭菌备用；将50%的戊二醛用灭菌的磷酸缓冲液稀释50倍形成I %戊二醛溶液， O. 22 um滤膜过滤后备用；取浓度为5 X IOVmL肝实质细胞悬液200 μ L与灭菌好的上述明胶壳聚糖共混物材料800 μ L均匀共混，得到浓度约为I X IOVmL的肝实质细胞-壳聚糖明胶基共混材料；将细胞-材料混合物装入料腔并配装喷头；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述混合物在温控成形室通过微流挤压的方法堆积成形；将成形的结构体在 3%多聚磷酸钠溶液中交联5分钟后，PBS冲洗3次，1%戊二醛交联30s，PBS冲洗3次，得到最终可用于体外培养或者体内植入的含有肝实质细胞的三维结构体。实施例3 :通过该工艺方法制造的肝细胞-明胶-壳聚糖三维结构体。将壳聚糖溶于醋酸缓冲溶液(O. lmol/L, CH3COOH)中，用lmol/L NaOH溶液调整其pH值到5，然后用磷酸缓存溶液(PBS)定容，得到2%壳聚糖溶液。将明胶溶于PBS缓冲液中，形成18%的明胶溶液，将两种溶液按I : I的比例均匀共混，PH调节至7. 2，70°C烘箱中间歇式灭菌2小时；将 3g多聚磷酸钠溶于IOOmL的磷酸缓冲液中形成3%多聚磷酸钠溶液，pH调节至7. 4，高温灭菌备用；将50%的戊二醛用灭菌的磷酸缓冲液稀释50倍形成1%戊二醛溶液，O. 22μπι滤膜过滤后备用；将肝实质细胞与肝基质细胞按7 I混合，形成浓度为5 X IOVmL肝细胞悬液，取浓度为5 X IOVmL肝细胞悬液200 μ L与灭菌好的上述明胶壳聚糖共混物材料800 μ L 均匀共混，得到浓度约为I X IOVmL的肝实质细胞-壳聚糖明胶基共混材料；将细胞-材料混合物装入料腔并配装喷头；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述混合物在温控成形室通过微流挤压的方法堆积成形；将成形的结构体在3%多聚磷酸钠溶液中交联5 分钟后，PBS冲洗3次，1%戊二醛交联30s，roS冲洗3次，得到最终可用于体外培养或者体内植入的含有肝细胞的三维结构体。实施例4 :通过该工艺方法制造的心肌细胞-内皮细胞-明胶-海藻酸钙三维结构。将明胶和海藻酸钠混合物制备成水溶液，浓度为100g/L，其中海藻酸钠和明胶的质量比为3 7，70°C烘箱中间歇式灭菌2小时备用；将5g氯化钙溶于IOOmL的磷酸缓冲液中形成5%氯化钙溶液，pH调节至7. 4，高温灭菌备用；将50%的戊二醛用灭菌的磷酸缓冲液稀释50倍形成I %戊二醛溶液，0.22 um滤膜过滤后备用；取浓度为I X 106/mL心肌细胞悬液 200 μ L与灭菌好的上述明胶海藻酸钠共混物材料800 μ L均匀共混，得到浓度约为I X IO6/ mL的心肌细胞-海藻酸钠明胶基共混材料；取浓度为I X IOVmL内皮细胞悬液200 μ L与灭菌好的上述明胶海藻酸钠共混物材料800 μ L均匀共混，得到浓度约为I X IOVmL的内皮细胞-海藻酸钠明胶基共混材料；分别将心肌细胞-海藻酸钠明胶基共混材料和内皮细胞-海藻酸钠明胶基共混材料装入料腔并配装喷头；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述混合物在温控成形室通过微流挤压的方法堆积成形；将成形的结构体在5%氯化钙溶液中交联5分钟后，O. 9%生理盐水冲洗3次，I %戊二醛交联15s，O. 9%生理盐水冲洗3次，得到最终可用于体外培养或者体内植入的含有心肌细胞-内皮细胞的多种细胞三维结构体。
权利要求
1.一种基于分步凝胶化原理的三维细胞组装方法，其特征在于该方法按如下步骤进行1)将温度敏感和一种或多种离子浓度敏感的生物可降解材料制备成水溶液，浓度为 20 100g/L，其中温度敏感与离子浓度敏感的生物可降解材料的质量比为I : O. 5 1，将所述溶液灭菌备用；2)定一种或多种细胞，分别与灭菌的溶液混合均匀，制备成细胞-材料溶液的混合物并装入不同的料腔中；置于无菌4°C 10°C环境下5min 20min预凝胶化，具体凝胶化时间由材料的浓度决定；3)根据预先设计的CAD结构模型，在计算机控制下，将所述的各个细胞-材料凝胶的料腔装载在成形设备上并配以相应的喷头，通过挤压/喷射形成离散的微滴或连续的微流状细胞-材料微组装单元，在成形平台的同步运动下逐点逐层堆积成与预设计一致的结构体；4)在堆积成形的过程中，细胞-材料单元在有温控的成形环境下，保持凝胶状态，故此过程堆积形成的结构体是一个亚稳态结构，结构体的强度会敏感温度；5)将堆积成形的亚稳态结构体在离子触发条件下先进行一定程度的离子交联，缓冲液冲洗，再在终交联剂中交联并缓冲液冲洗，最终形成长期稳定培养的结构体。
2.按照权利要求I所述的三维细胞组装方法，其特征在于所述的温度敏感生物可降解材料为明胶。
3.按照权利要求I所述的三维细胞组装方法，其特征在于所述离子浓度敏感生物可降解材料为海藻酸钠或壳聚糖，相应触发离子为Ca离子或Na离子。
4.按照权利要求I所述的三维细胞组装方法，其特征在于所述交联剂为戊二醛交联剂，浓度为O. 8% 1%，交联时间为15s 60s。
5.按照权利要求I所述的三维细胞组装方法，其特征在于所述缓冲液为灭菌的磷酸缓冲液或者是O. 9%的生理盐水。
全文摘要
本发明公开一种基于分步凝胶化原理的三维细胞组装成形方法，该方法将物理与化学凝胶化分步执行，第一步将温敏和离子浓度敏感的生物可降解材料制备成水溶液，灭菌备用；选定一种或多种细胞，分别与灭菌的溶胶混合均匀，制备成细胞-材料共混物，置于无菌4℃～10℃环境下预凝胶化；在CAD模型的直接驱动下，将制备的共混物分别通过不同的喷头挤压/喷射，形成细胞-材料微流/微滴单元，在温控成形环境下堆积成具有一定结构的组织器官雏形；第二步在相应的离子交联触发条件下，将这一雏形进一步凝胶化。本发明基于离散/堆积成形方法及分步凝胶化原理，能够实现含有一种或多种细胞的三维结构体的成形及其体外长期稳定培养。
文档编号A61L27/52GK102600512SQ201210042990
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月22日 优先权日2012年2月22日
发明者刘海霞, 宋凝芳, 戴相国, 蒋鹞飞, 高爽 申请人:北京航空航天大学