芳香酶抑制剂的新用途的制作方法

专利名称：芳香酶抑制剂的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药用途，具体涉及芳香酶抑制剂在制备防治男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征的药物中的应用。
背景技术：
随着人类寿命的延长,老年男性的下尿道(lower urinary tract, LUT)越来越多的受到社会和医学界的关注。流行病学调查表明40-49岁的男性中有约26%的人具有中度和重度的下尿道综 合症(lower urinary tract syndrome, LUTS);在 70 岁的男性中有约 46% 出现 LUTS。我国的流行病调查表明，在上海市市区一般人群中抽取40岁以上男性居民1583名，通过国际前列腺症状评分(IPSS)和生活质量(QoL)评分等方法，调查该人群中LUTS的患病率及对生活质量的影响。结果在40-49岁、50-59岁、60-69岁和大于70岁年龄组中，中、重度LUTS(IPSS彡8)患病率分别为8. 7%、19. 4%、32. 3%和40. 2%，呈现随年龄增长患病率上升趋势；随着LUTS严重程度的增加，患者的QoL评分也显著上升(P < O. 01)。我国男性LUTS患病率也不断接近欧美国家，严重影响男性的生理健康和生活质量。男性的LUTS的主要病因是膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction, BOO),尿道发炎，小便失禁和膀胱癌。膀胱出口梗阻(B00)是下尿道综合症(LUTS)中最常见的一种病(Groutz etal. 2001)。B00从尿动力学定义是指膀胱颈和近端尿道处各种原因导致的尿液流出阻力升高，泌尿困难，不能排尿以及不能排空膀胱中的储尿。B00常导致膀胱逼尿肌功能异常，继而产生一系列严重的并发症，如尿流间断，泌尿困难，不能排尿以及不能排空膀胱中的储尿，严重的能引起肾积水，慢性肾功能不全，长期排尿困难导致腹压增高，还可引起腹股沟疝，内痔与脱肛，肾衰竭和猝死等。目前B00的治疗手段主要有药物治疗、手术治疗，其中I、外科手术治疗目前临床上可接受的介入性治疗主要是经尿道前列腺切除术(TURP)、开放性前列腺切除术(OS)、经尿道前列腺电气化术(TUVP)、激光气化术(VLAP)、经尿道微波治疗术(TUMT)、经尿道穿刺消融术(TUNA)、间质激光凝固术(ILC)、尿道支架术。临床上应根据病人的具体情况，选择最有利于病人的手术方式。标准的外科手术疗效明显，症状得长期改善且危险性小。但目前越来越倾向于微创治疗，在一定程度上症状得到改善，危险性(某些病例)也小于开放手术，但是目前缺乏有关持久性证据，尚未确定这些新技术在费用和疗效上是否比标准外科手术(如TURP)有更大的优势(杨勇2002)。2、药物治疗a IAR拮抗剂在前列腺中的主要亚型是a Ia AR和a Id AR, a la AR拮抗剂能够改善BPH中前列腺平滑肌收缩状态(Andersson 2000 ；Michel and Vrydag 2006),减轻前列腺对尿道的挤压，从而改善膀胱梗阻的症状。a Ia AR阻滞剂虽然能够带来前列腺平滑肌的舒张和增加尿流量，改善BPH引起的梗阻症状，但是BPH带来的LUTS的评分没有改变。只有a Ia AR和a Id AR阻滞剂联合使用，LUTS的评分才得以改变(Haynes et al. 2003 ；Sigala et al. 2004 ；Barendrecht et al. 2008)。a IAR拮抗剂其有效性和安全性已在开放扩展临床试验中得到证实。但临床现有的所有a IAR拮抗剂均与头晕、乏力和立位性低血压的发生有关。5α-还原酶抑制剂睾酮在5α-还原酶的作用下转化为双氢睾酮刺激前列腺增生，前列腺增生是引起膀胱出口梗阻的主要病因之一。在目前现有的激素治疗中，5α-还原酶抑制剂非那雄胺是唯一在随机临床试验中显示良好有效性和可接受的安全性药物。非那雄胺最常见的副作用是性功能不良，如射精减少、性欲下降和阳萎。目前已上市的药物皆是针对治疗前列腺病变引起的膀胱出口梗阻，尚未见到对雌/雄激素比例失调引起的膀胱出口梗阻的治疗。芳香酶是属于细胞色素Ρ450的一种复合酶，可氧化脱去C19雄激素(雄烯二酮和睾酮)的19-甲基，使A环芳构化，从而转变成C18雌激素(雌酮和雌二醇)。因此，芳香 酶是体内合成雌激素的重要酶。芳香酶抑制剂通过和芳香酶的结合能力，抑制芳香酶活性可降低体内雌激素的水平。目前常用的芳香酶抑制剂是三吡咯衍生物，是非留体类竞争性抑制剂，如阿那曲唑(Anastrozole)、来曲唑(Letrozole)、芬罗唑(Finrozole)和伏氯唑(Vorozole)等。来曲唑(Letrozole)，化学名称为1_[双(4-氰基苯基)甲基]_1，2，4_三氮唑，或者为4，4' -(IH-1,2,4-三唑-I-基亚甲基)-双苯腈，其CAS登记号为112809-51-5，是新一代芳香酶抑制剂，为人工合成的苄三唑类衍生物，来曲唑通过抑制芳香酶，使雌激素水平下降，从而消除雌激素对肿瘤生长的刺激作用。主要用于绝经后晚期乳腺癌，多用于抗雌激素治疗失败后的二线治疗。阿那曲唑(Anastrozole)，化学名(四甲基_5_(1H-1，2，4_三唑-I-基甲基)_1，3-苯二乙腈)，分子式=C17H19N5，分子量293. 37，CAS登记号为120511-73-1。为强效非甾体类芳香酶抑制剂。可降低血浆雌激素水平，产生抑制乳腺肿瘤生长的作用。临床上用于绝经后妇女的晚期乳腺癌治疗。芬罗唑(Finrozole)和伏氯唑(Vorozole),也属于芳香酶抑制剂,可用于绝经后妇女的晚期乳腺癌治疗。目前尚未见到芳香酶抑制剂在膀胱出口梗阻相关用途方面的报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种芳香酶抑制剂的新用途。本发明提供了芳香酶抑制剂在制备治疗男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征的药物中的应用。上述应用中所述膀胱出口梗阻的症状是尿频、尿急、排尿困难、淋漓不尽、排尿时间延长。所述膀胱出口梗阻由雌/雄激素比例失调导致的；所述芳香酶抑制剂为三吡咯衍生物，优选为阿那曲唑、来曲唑、芬罗唑和伏氯唑。所述芳香酶抑制剂为含有芳香酶抑制剂的制剂，该制剂可市售获得，或与药学上可接受的载体或稀释剂组成制剂。所述制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、口服液或注射剂，所述注射剂为注射液或冻干粉针。
所述药学上可接受的载体或稀释剂是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等;所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、糊精、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂选自微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素或交联羧甲基纤维素钠；所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢钠、微粉硅胶、滑石粉或硬脂酸镁；所述助悬剂选自微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、固态聚乙二醇；所述润湿剂选自甘油、吐温-80、乙氧基氢化蓖麻油或卵磷脂；所述溶剂选自乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油选自大豆油、蓖麻油、花生油、调和油等；所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、月旨肪酸山梨坦或聚山梨酯(吐温)等；所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、柠檬酸或糖精钠。所述芳香酶抑制剂的用量为l_50mg/Kg/d,优选为5_25mg/Kg/d。本发明提供的芳香酶抑制剂的新用途具有以下优点I、本发明提出了芳香酶抑制剂类药物的新用途，具体涉及在治疗男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征的新应用，该药物能够快速有效的治疗膀胱出口梗阻，为临床治疗提供理论基础，同时为治疗膀胱出口梗阻提供了一种新方法；2、实验证实用芳香酶抑制剂来治疗膀胱出口梗阻及其导致的下尿道综合征，症状减轻明显，治疗率为100%。


图I :芳香酶表达载体的结构示意图。图2 :PCR鉴定结果，6号为阳性，+为阳性对照。图3 Southern Blot筛选结果，I为阳性对照，是回收的探针，6为southern blot阳性鼠。图4 :小鼠生殖泌尿系统表型的鉴定左边两鼠分别1是为阳性转基因小鼠的尿潴留小鼠，2为阴性对照组的野生型小鼠，右边一鼠为图3s0Uthern blot分析的含有转芳香酶基因的阳性鼠的解剖学分析为尿潴留引起的膀胱的形态学变化。图5 :膀胱组织HE染色及Van Gieson染色结果，A为HE染色结果，B为Van Gieson染色结果；其中，I为野生型小鼠，2为阳性转基因小鼠；&表示胶原纤维，b表示肌纤维。图6 :芳香酶基因的半定量RT-RCR，AU A2为芳香酶转基因小鼠，WT1，WT2为野生型小鼠。
图7 :芳香酶抑制剂Western Blot检测结果，A1，A2为阳性转基因小鼠，WT为野生
型小鼠。图8 :芳香酶抑制剂处理的转基因鼠和阳性对照鼠A为来曲唑处理的转基因鼠；B为阿那曲唑处理的转基因鼠；C为芬罗唑处理的转基因鼠，图中A:WT为阴性对照组，AROM+为尿潴留小鼠，AROM+latrozol为来曲唑组；AROM+Anastrozole为阿那曲唑组；AROM+Finrozole为芬罗唑组。图9:组织病理学分析，其中A为阴性对照组(即WT)，为野生型鼠尿道口的括约肌；B为尿潴留小鼠(即AROM+)为转基因鼠尿道口的括约肌；C为来曲唑组(即AROM+latrozol) ;D为为阿那曲唑组(AROM+Anastrozole) ;E为为芬罗唑组(AR0M+Finrozole)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I:小鼠模型的制备参考文献Molecular mechanisms of bladder outlet obstruction intransgenic male mice over expressing aromatase(Cypl9al). Linff, Rahman NA, Lin J,Zhang H, Gou K, Yu ff, Zhu D, Li N, Huhtaniemi I, Li X. Am J Pathol. 201IMar ；178 (3)1233-44. PMID :21356374。试验动物C57BL/6小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心。C57BL/6是国外引进的近交系，是B6F129和B6JEiF78杂交，而后经过129代的同胞兄妹近交而生产的近交系，相关基因型是a/a。试验试剂pUB6/V5_HisA(Cat. No. V25020),购自 Invitrogen, Carlsbad, CA ；pRC/CMV (Cat. No. 10131027)，购自 Invitrogen, Carlsbad, CA。用C57BL/6小鼠构建膀胱出口梗阻动物模型，具体方法如下一、重组表达载体(或为芳香酶表达载体)的构建UUbiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I的获得用限制性内切酶BglII和HindIII酶切pUB6/V5_HisA，回收Ubiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I片段，其中Ubiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I及该片段在载体pUB6/V5-HisA上两端的酶切位点的核苷酸序列如序列表中人工序列I所示；人工序列I自5'末端起第1-6位核苷酸为BglII的识别序列(AlGATCT)，人工序列I自5'末端起第1218-1223位核苷酸为HindIII的识别序列(A|AGCTT);人工序列I自5'末端起第7-1217位核苷酸为片段Ubiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I的序列，其人工合成序列见序列表中的人工序列I所示。2、人芳香酶编码基因的cDNA的获得两端带有酶切位点的人芳香酶编码基因的cDNA全长序列如序列表中人工序列2所示，其中序列2自5’末端第1-6位核苷酸为HindIII的识别序列(A | AGCTT)，第2155-2160位核苷酸为XbalI的识别序列(T I CTAGA)，第7-2154位核苷酸为人芳香酶编码基因的cDNA全长序列，其人工合成序列见序列表中的人工序列2所示。3、牛生长激素基因的polyA /[目号序列
在载体PRC/CMV上具有牛生长激素基因的polyA信号序列，其核苷酸序列见序列表中的人工序列3所示；4、重组表达载体的构建用限制性内切酶BglII和HindIII酶切载体pRC/CMV，回收大片段(即去除CMV启动子的载体片段)，将其与步骤(I)中酶切获得的Ubiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I片段连接，得到重组载体pRC/Ubiquitin C ；用限制性内切酶HindIII/Xbal酶切重组载体pRC/Ubiquitin C，回收大片段；用限制性内切酶Hindlll/Xbal酶切人芳香酶编码基因的cDNA片段，连接，得到重组表达载体pRC/Ubiquitin C/cDNA(即芳香酶表达载体)，其结构如图1所示,得到0嫩片段“1113丨911；[1:;[11C基因的启动子、外显子I和内含子I+人芳香酶编码基因的cDNA+bGH polyA”，其核苷酸序列见序列表中的人工序列4所示。二、转基因小鼠的构建将构建的芳香酶表达载体用Bgl II和Dra I进行双酶切，回收DNA片段，SPUbiquitin C基因的启动子、外显子I和内含子I+人芳香酶编码基因的cDNA+bGH polyA,将上述DNA片段制成2ng/l·! L的悬液，显微原核注射入C57BL/6小鼠受精卵中；胚胎移植入待孕母体子宫中；生产转基因小鼠，得到的转基因小鼠计作H)代。具体的实验步骤如下(一 )超数排卵(超排)与取卵I、超数排卵取4-6周龄的母鼠作超排卵供体，腹腔注射孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵，二者注射时间间隔为45h，排卵发生在注射hCG后13h，注射剂量为每鼠8ul。注射hCG后每只母鼠置于一个单独饲养的正常公鼠笼内，次日晨检查阴道栓。2、取卵用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠，把完整的输卵管带一小段子宫剪下，置于PBS平衡盐溶液中，在解剖镜下找出输卵管伞部，用带针头的注射器将受精卵冲出，用透明质酸酶去除包围着的颗粒细胞后立即将卵子换至新鲜培养液内洗涤4次即可用于显微注射。( 二 )注射外源 DNA 显微注射需用显微操作仪，用来控制显微持卵针和显微注射针。取已制备好的受精卵细胞和外源DNA悬液，在倒置显微镜下做显微注射。注射时先用持卵针吸住受精卵，再用注射针吸取外源DNA悬液，然后推动注射针，使其刺入受精卵的雄原核，将1-2μ L DNA注入(DNA浓度2ng/l·! L)。注射完毕，慢慢抽出注射针，将受精卵放入新的培养液中，使其恢复。50-80%的受精卵在显微注射后仍保持健康。(三)注射后受精卵(或胚胎)的移植将注射有外源DNA的受精卵在显微操作当天移植到交配后O. 5d假孕雌鼠的输卵管内。外源DNA可直接导入原核内，导入的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合。待假孕母鼠产出幼仔后，可用幼鼠尾巴提取基因组DNA进行检测。本实验采用如下移植方法用戊巴比妥钠麻醉受体鼠，从假孕鼠阴道向子宫颈管 道插入外径10毫米的粗导管，然后将直径5毫米的细导管插入粗导管内侧，伸入到子宫体或一侧子宫角。将囊胚连同2毫升保存液一起通过细导管移植进去，具体是用干冰产生出来的二氧化碳经过导管将囊胚吹入到子宫内1-3分钟。
也可以采用如下移植方法用戊巴比妥钠麻醉受体鼠，沿受体鼠背部中线最后一根肋骨水平切Icm左右切口，轻轻拨开切口，可见位于卵巢上方的白色脂肪垫.用小镊子夹住白色脂肪垫将其拉到体外，用小血管夹夹住，并靠其重力起固定作用，以防输卵管缩回体腔。用移卵管吸15-20个受精卵准备移植.将小鼠转到解剖镜下仔细寻找到输卵管。可见输卵管被一层呈半透明的囊膜所包绕，将囊膜撕破而暴露输卵管，将移卵管内受精卵移植到输卵管膨大部。将输卵管小心放回，缝合。实验设3次重复。三、转基因小鼠的筛选阳性小鼠的鉴定及繁育运用PCR及Southern Blot方法筛选阳性转基因小鼠； ( 一 ) PCR 筛选方法模板DNA为假孕母鼠所产Founder幼鼠的鼠尾DNA，(假孕母鼠生产的转基因动物称为Founder)正向引物见序列表中的人工序列5，反向引物见序列表中的人工序列6，扩增572bp片段，不能扩增出该片段的为阴性，能扩增出该片段并通过测序正确的为阳性。结果如图2所示，6号为阳性，+为阳性对照，将PCR阳性的PCR产物进行测序，测得的序列如序列表中的人工序列4的自5'末端起第853-1424位核苷酸所示，表明PCR产物结果正确。(二)Southern Blot 筛选方法I、基因组DNA的制备按常规鼠尾提取DNA的方法制备DNA ；2、基因组DNA的限制酶切在I. 5ml 离心管中依次加入 20μ g DNA(1 μ g/μ I)，4· Ομ I IOX 酶切 buffer，
5.0μ I EcoRI (IOU/μ I)，加 ddH20 至 500 μ 1，37°C 消化过夜。3、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳制备O. 8%凝胶一般用于Southern杂交的电泳胶取O. 8%。电泳电泳样品中加入IOXLoading缓冲液,混勻后上样，留一或两泳道加DNA Marker。l_2V/cm,DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带。4、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物(毛细管法)I)试剂准备变性液0. 5M NaOH ；I. 5M NaCl ;中和液1M Tris-HCl (pH 7. 4)；
I.5M NaCl ;转移液(20 X SSC) :175. 3g NaCl ;82. 2g柠檬酸三钠，NaOH调 pH至 7· 0，加 ddH20至 IOOOml02)操作步骤碱变性室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30分钟。中和将凝胶转移到中和液15分钟。转移按凝胶的大小剪裁带正电尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5分钟。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。转移过程一般需要8-24小时，每隔数小时换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20XSSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其它污物。转移结束后取出膜，浸入6X SSC溶液数分钟，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80°C烘2小时，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。5、探针标记进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记
I)取25_50ng模板DNA(EcoRI酶切构建完成的质粒载体，回收2. 7K片段)于O. 5ml离心管中，100°C变性5分钟，立即置冰浴。2)在另一个O. 5ml离心管中加入10 μ I Labeling 5Xbuffer (含有随机引物，随机引物是小的核苷酸序列)，2 μ I dNTPmix(含dATP、dGTP、dTTP各O. 5πιΜ)，2μ I BSA(小牛血清白蛋白)，3μ 1[α -32PJdCTP, 5U Klenow 酶。3)将步骤I)中的变性模板DNA加入到步骤2)中的离心管中，加ddH20至50 μ 1，混匀，室温内放置90分钟。4)加50 μ I终止缓冲液终止反应。6、杂交 预杂交膜浸入2XSSC中5分钟，在杂交瓶中加入杂交液(8cmX8cm的膜加5ml即可)，将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42°C杂交炉中，使杂交体系升到42°C，得到预杂交的杂交液。杂交倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42°C的杂交液。将探针100°C加热5分钟，使其变性，迅速加到杂交瓶中，42 °C杂交过夜。7、洗膜与检测取出膜，在2XSSC溶液中漂洗5分钟，然后按照下列条件洗膜2XSSC/0. 1% SDS,42°C, 10 分钟；1XSSC/0. 1% SDS,42°C, 10 分钟；O. 5XSSC/0. 1% SDS,42°C, 10 分钟；O. 2XSSC/0. 1% SDS,56°C, 10 分钟；O. 1XSSC/0. 1% SDS，56°C，10 分钟。在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2XSSC中2分钟，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入磷板中，三天后扫描磷板，结果如图3(1为阳性对照，是回收的芳香酶基因的探针，6为southern blot分析的含有转芳香酶基因的阳性鼠)。以上结果表明，筛选得到的阳性转基因小鼠正确。四、遗传稳定性检测将步骤三筛选得到的阳性雌鼠与野生型C57BL/6公鼠配对，繁育得到Fl代；对卩1代小鼠进行筛选，方法同步骤三所述。以此类推，繁育F2代，F3代，F4代，每一代都进行阳性筛选，阳性转基因鼠中均能检测到该插入的基因。五、阳性转基因鼠的表型鉴定及组织学分析和基因表达分析将按照上述方法得到的Fl代和F2代阳性转基因公鼠成年后进行生殖泌尿系统表型鉴定、组织病理学分析、基因表达分析。(一)表型鉴定结果阳性转基因公鼠成年后生殖泌尿系统表型鉴定结果如图4所示，左边两鼠分别为I为阳性转基因的尿潴留小鼠，(2)表示阴性对照组的野生型小鼠，右边一鼠为图3Southern blot分析的含有转芳香酶基因的阳性鼠的解剖学分析为尿潴留引起的膀胱的形态学变化。(二)组织学分析解剖获取所述转基因小鼠的膀胱及尿道，放入到4%的多聚甲醛溶液中固定48小时，水洗4小时后进行组织包埋，HE染色及胶原Van Giesan染色，具体步骤如下I、将固定好的组织用PBS洗涤2次，每次10分钟。然后进行脱水和浸蜡，方法如下70%乙醇(I小时)，80%乙醇(I小时)，90%乙醇(I小时)，95%乙醇(I小时)，无水乙醇(I小时X2), 二甲苯(15分钟一次,5分钟一次)，石腊一 (30分钟)，石腊二(30分钟)，石蜡三(30分钟)；2、将处理过的组织放在包埋盒底部中央，倒入融化的蜡，室温中冷却；3、切片 I)将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上；2)将护刀盖推至打开位置；3)摇动快速进退手轮，使石蜡块与刀口贴近，但不超过刀口 ；4)调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15-30度；5)调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般5μπι;6) 一切调整好后就可以切片，此时右手摇动大手轮，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度以每分钟40-50转为宜。7)切成的蜡带到20-30厘米时，右手用另一支毛笔将蜡带挑起，平放在蜡带盘上(注意靠刀面的一面较光滑朝下)。4、贴片切好的蜡带置于捞片机温水中(注意蜡片光面向下)，待其完全展开后，取一清洁的以粘片剂处理的载玻片捞取至片上中间部位。并作好标记。5、烤片把玻片标本置于片架上，37°C温度烤片24小时。6、HE 染色I)组织芯片置于二甲苯中浸泡15分钟；2)更换二甲苯后再浸泡7分钟；3)无水乙醇I中浸泡5分钟；4)无水乙醇II中浸泡5分钟；5) 95%乙醇中浸泡5分钟；6) 90%乙醇中浸泡5分钟；7) 80%乙醇中浸泡5分钟；8) 70%乙醇中浸泡5分钟；9)苏木精中浸泡15分钟；10)水洗2分钟；11)盐酸酒精分化10秒；12) 80%乙醇中2分钟；13) 70%乙醇中2分钟；14)伊红中79秒；15) 90%乙醇中浸泡3分钟；16) 95%乙醇中浸泡3分钟；
17)无水乙醇II中浸泡3分钟；18)无水乙醇I中浸泡5分钟； 19) 二甲苯II中3分钟；20) 二甲苯I中3分钟；21)中性树胶封片，镜检。7、Van Gieson 染色I)试剂的配制Weigert 氏苏木素A 液lg 苏木素(haematoxylin), IOOml 无水酒精；B 液:4ml30%三氯化铁(ferric chloride),95ml 蒸懼水，Iml 盐酸。Van Gieson 氏液A 液Ig 酸性品红(acid fuchsin), IOOml 蒸懼水。B 液1. 22%苦味酸饱和水溶液(picric acid)。Weigert氏苏木素临用前取A液和B液等份混合,几个小时内用完,最长不得超过一天。苏木素配后经二十多天才能成熟，必须提前配制。该液能抵抗弱酸性染液，对已着染的细胞核在酸性染液的作用，不易被脱去颜色，如果不特别深染，则无须分化。Van Gieson氏液取B液9ml,加入A液Iml,即可使用。2)操作方法切片脱蜡至水；用Weigert氏苏木素染20min ;水洗；必要时可分化；流水冲洗IOmin ;染VanGieson氏液Imin ;用95%酒精快速分化；无水酒精脱水,二甲苯透明，封固。染色结果如图5所示(A表示HE染色结果，B表示胶原纤维染色(Van Gieson染色)结果，其中，I表示野生型小鼠，2表示阳性转基因小鼠；粉红的部分表示胶原纤维，b橙色的部分表示肌纤维，结果表明，阳性转基因小鼠膀胱尿潴留，膀胱中固有层增厚，逼尿肌排列紊乱。逼尿肌层萎缩。尿道括约肌萎缩。Van Gieson染色显示胶原增多。(三)基因表达分析快速解剖获取转基因小鼠的膀胱于液氮中速冻，-80°C保存，留待提取RNA和蛋白质，通过RT-PCR和Western Blot方法做基因表达检测，具体方法如下I、RT-PCR :I)总RNA的提取及检测A迅速从液氮中取出膀胱，剪取50mg左右，剪碎放入匀浆杯中，加入Iml Trizol,用匀浆器匀浆l_2min，将组织匀浆液转入I. 5ml离心管中，室温放置5min。B加入200μ I体积比为I : 24的异戊醇/氯仿，充分混匀，务必成乳白色，冰中放置 IOmin0C 4°C,以 12000 转/min 离心 lOmin。D取上清，加入等体积异丙醇(预冷)混匀。E-20°C放置 Ih 后，4°C，10000 转 /min 离心 IOmin0F弃上清，沉淀溶于800 μ I 75%的乙醇，室温放置lOmin，4°C，10000转/min离心IOmin0G重复步骤6) —次。
H小心弃上清，在恒温箱中65°C烘干；核酸分析仪测定总RNA的0D26(l/0D28(l，根据A260值计算RNA样品浓度RNA样品浓度(ng/ μ I) = A260 XDNA稀释倍数X 50。痕量DNA的消化A 向 RNA 水溶液中加入 10 μ I 的 IOxDNase-I 缓冲液，O. 5 μ IRnsin (40-200U/ μ I)，2. 0μ I DNase-1 (5U/μ I)，4.0 μ 10. 1MDTT，用 DEPC 水调至 100ml，37。。保温 15min。B加入等体积的酚氯仿(I I)混匀。C 4°C, 12000r/min 离心 lOmin。D取上清，加入1/10体积的3mol/l的NaAc和2. 5倍体积的预冷的乙醇混匀。E_20°C沉淀 30min 以上，10000r/min, 4°C离心 15min。F沉淀用乙醇淋洗两次，烘干，溶于无核酸酶水中，存于_70°C备用。G紫外分光光度计检测所提RNA的含量。2)反转录合成cDNA第一条链A反转录体系如表I所示表I:反转录体系
权利要求
1.芳香酶抑制剂在制备治疗男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征的药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述男性膀胱出口梗阻的症状是尿频、尿急、排尿困难、淋滴不尽、排尿时间延长。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述男性膀胱出口梗阻是由雌/雄激素比例失调引起的。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述芳香酶抑制剂为三吡咯衍生物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述芳香酶抑制剂为阿那曲唑、来曲唑、芬罗唑和伏氯唑。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述芳香酶抑制剂为含芳香酶抑制剂的制剂，由芳香酶抑制剂与药学上可接受的载体或稀释剂组成。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、口服液或注射剂。
8.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述芳香酶抑制剂类的用量为l_50mg/Kg/d。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述芳香酶抑制剂类的用量为5-25mg/Kg/d。
全文摘要
本发明涉及芳香酶抑制剂的新用途，具体涉及芳香酶抑制剂在制备治疗男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征的药物中的应用。该药物能够快速有效的治疗雄性小鼠膀胱出口梗阻，更好的切合临床应用，为临床治疗提供理论基础，为治疗膀胱出口梗阻提供了一种新方法。
文档编号A61P13/02GK102641502SQ20121012533
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者于万鹏, 张华 , 李向东, 林蔚 申请人:中国农业大学