专利名称：抗肺癌的灯台叶中药组合物、其制备方法及其在制备抗肺癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物，具体涉及一种抗肺癌的灯台叶中药组合物、其制备方法及其在制备抗肺癌药物中的应用
背景技术：
在环境污染、职业暴露等因素的多方面影响下，世界范围内肺癌发病率持续上升，已成为对人类健康危害最大的恶性肿瘤。在我国城市中肺癌占所有肿瘤死亡的17.8%，在恶性肿瘤发病率排序中已经上升为第一位。根据2010年中国卫生统计年鉴结果显示2009年中国城市肺癌死亡率为49. 6/10万人,农村肺癌死亡率为39. 64/10万人,分别占肿瘤死亡人数的29. 2%和24. 7%ο在城镇地区,每死亡4人，即有I人死于癌症,而在因癌症死去的每3-4人中，即有I人是肺癌。目前肺癌仍缺乏安全高效的治疗药物，肺癌患者预后和存活率都较差。因此研发新型抗肺癌药物是十分迫切与必要的。天然植物来源的长春碱、喜数碱等已经被开发为有效的抗肿瘤药物，继续从中药和天然药物中寻找和开发抗肺癌药物是当前的研究热点。灯台树scholaris(L.) R. Sr.，为夹竹桃科鸡骨常山属的乔木，主要含有生物碱、黄酮、三萜类等成分，性味甘、淡、平，具有清热解毒、消肿止痛、平喘止咳、截疟、发汗、健胃等作用。灯台树根、茎、皮、叶均可入药，以皮和叶用药为主。近年来，随着对其化学成分、药理活性等方面研究的逐步展开，发现其活性成分丰富，在抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗糖尿病和降血脂等方面显示出重要的潜在药用价值。灯台叶是灯台树的干燥叶，传统常用于治疗肺热、咳嗽、痰多等症。灯台叶主要含有生物碱类、黄酮类、三萜类等成分。专利已有报道灯台叶治疗咳嗽哮喘、咽炎的制剂(200710063724. O公开了一种治疗咳嗽哮喘的中药组合物；201010171142. 6公开了一种治疗咽炎的药物)，关于灯台叶抗肺癌的专利未有报道。据文献报道，灯台树皮85%乙醇提取物具有很好的抗肿瘤活性，从其分离得到的不同极性溶剂部位，对HeLa细胞的细胞毒作用以甲醇溶解后的不溶部位、总提取物和氯仿部位最好，而这些部位生物碱含量丰富。(参见Jagetia GC, Baliga MS. The effectof seasonal variation on the antineoplastic activity of Alstonia scholarisR. Br, in HeLa cells [J]. J Ethnopharmaco1. 2005, 96(1-2) :37-42.)从灯台树中分离得到的灯台碱(echitamine)是灯台树的主要生物碱成分之一,它在体外对HeLa、HepG2、HL60、KB、MCF-7、Vero、纤维肉瘤和艾氏腹水癌细胞都具有细胞毒作用，体内对大鼠纤维肉瘤，S180肉瘤和小鼠艾氏腹水瘤有抑制生长的作用(参见Jagetia GC, Baliga MS, VenkateshP, et al. Evaluation of the cytotoxic effect of the monoterpene indole alkaloidechitamine in-vitro and in tumour-bearing mice[J]. J Pharm Pharmacol. 2005, 57(9)1213-1219.)。灯台叶和灯台树皮、根类似，也含有大量类似的生物碱等成分，因此从灯台叶中提取具有抗肿瘤活性的有效组分并开发抗肺癌药物是一条可行的途径，且有利于灯台树资源的充分利用和可持续发展。但是现有技术对从灯台叶中提取抗肿瘤药物的研究还是初步的，尚未有能够实现产业化的具体药物的报道，更未见从灯台叶中提取的具体用于抗肺癌药物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗肺癌的灯台叶中药组合物、其制备方法及其在制备抗肺癌药物中的应用，以实现抗肺癌 药物的产业化。完成上述第一个发明任务的方案是一种抗肺癌的灯台叶中药组合物，其特征在于，该组合物的原料药为中药灯台叶。进一步优化，上述抗肺癌的灯台叶中药组合物是由灯台叶提取物中的总生物碱组分和总三萜组分组成，所述的总生物碱组分和总三萜组分，是按其原料生药量的质量比1:0. I 1:10 组合；
较好的组合为两种组分按其原料生药量质量比1:0. 5 1:5组合；
最理想的组合为两种组分按其原料生药量质量比1:1组合。其中所述的总生物碱组分以鸭脚树叶碱为代表性成分；所述的总三萜组分以齐墩果酸和熊果酸为代表性成分。HPLC图谱见
。其中灯台叶，性味苦，凉，具有止咳、祛痰、消炎的功效。更具体地说，本发明的抗肺癌中药组合物，是指按照以下制备方法得到的组合物
步骤(I):灯台叶用乙醇回流提取，回收溶剂，得到提取浓缩液；
步骤(2):将提取浓缩液上于大孔树脂上，先用水、低浓度乙醇洗去杂质，再用中浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总生物碱组分，最后用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总三萜组分，分别真空干燥，即得总生物碱组分和总三萜组分；
步骤⑶将步骤⑵中的总生物碱组分和总三萜组分组合在一起(混合均匀)，得本发明的药物组合物。步骤(3)中，总生物碱组分和总三萜组分是其原料生药量的质量比1:0. f 1:10组合；较好的组合比例为按其原料生药量质量比1:0.5 1:5组合；最理想的组合比例为按其原料生药量质量比1:1组合。两种组分的组合比例超出1:1时，可以用另外的原料药，提取总生物碱组分或者总三職组分补充到组合物中。本发明采用大孔树脂把灯台叶的乙醇提取物分离成不同的组分，通过体内外实验对其抗肺癌活性组分进行筛选，得到灯台叶抗肺癌活性组分为总生物碱和总三萜组分，并将两个组分进行组合，得到灯台叶的抗肺癌组合物。这样的研究未经报道，而且能进行大规模生产，适宜开发成抗肺癌中药新药。完成本发明第二个发明任务的方案是，上述灯台叶的抗肺癌中药组合物的制备方法，包括如下步骤
步骤(I):灯台叶用乙醇回流提取，回收溶剂，得到提取浓缩液；
步骤(2):将提取浓缩液上于大孔树脂上，先用水、乙醇洗去杂质，再用中浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总生物碱组分，最后用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总三萜组分，分别真空干燥，即得总生物碱组分和总三萜组分；步骤⑶将步骤⑵中的总生物碱组分和总三萜组分组合在一起(混合均匀)，得本发明的药物组合物。步骤(3)中，总生物碱组分和总三萜组分是其原料生药量的质量比1:0. f 1:10组合；较好的组合比例为按其原料生药量质量比1:0. 5 1:5组合；最理想的组合比例为按其原料生药量质量比1:1组合。两种组分的组合比例超出1:1时，可以用另外的原料药，提取总生物碱组分或者总三職组分补充到组合物中以上制备方法的进一步优化，具体操作步骤是
步骤⑴灯台叶用6 15倍量的体积百分比709Γ95%乙醇回流提取广4次，每次f4h，回收溶剂，得到提取浓缩液；
步骤(2):将提取浓缩液上于HPD400A、NKA-9、DlOl、DA201、AB-8型大孔树脂上，先用2 6BV的水及2 6BV的体积百分比20% 40%乙醇洗去杂质，再用4 10BV的体积百分比50%飞5%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总生物碱组分，最后用Γ ΟΒν的体积百分比709Γ95%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总三萜组分，分别真空干燥，即得总生物碱组分和总三萜组分；
步骤(3):将步骤(2)中的总生物碱组分和总三萜组分混合均匀，得本发明的抗肺癌中药组合物。本发明中药组合物制备方法的优化方案是
步骤⑴灯台叶用8 12倍量的体积百分比809Γ90%乙醇回流提取广3次，每次
I.5^3h,回收溶剂，得到提取浓缩液；
步骤(2):将提取浓缩液上于D101、DA201、AB-8型大孔树脂上，先用3 5BV的水及3 5BV的体积百分比30% 40%乙醇洗去杂质，再用5 8BV的体积百分比55% 60%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总生物碱组分，最后用5 8BV的体积百分比759Γ85%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总三萜组分，分别真空干燥，即得总生物碱组分和总三萜组分；
步骤(3):将步骤(2)中的总生物碱组分和总三萜组分混合均匀，得本发明的抗肺癌中药组合物。中药组合物制备方法的优化方案中，本发明推荐的条件是
步骤(I):灯台叶用10倍量的体积百分比85%乙醇回流提取2次，每次2h，回收溶剂，得到提取浓缩液；
步骤(2):将提取浓缩液上于AB-8型大孔树脂上，先用4BV的水及4BV的体积百分比40%乙醇洗去杂质，再用6BV的体积百分比60%乙醇洗脱，收集体积百分比60%乙醇洗脱液，回收乙醇，得到总生物碱组分，最后用6BV的体积百分比80%乙醇洗脱，收集体积百分比80%乙醇洗脱液，回收乙醇，得到总三萜组分，分别真空干燥，即得总生物碱组分和总三萜组分；
步骤(3):将步骤(2)中的总生物碱组分和总三萜组分混合均匀，得本发明的抗肺癌中药组合物。完成本发明第三个发明任务的方案是，上述灯台叶的抗肺癌中药组合物在制备抗肺癌药物中的应用。本发明的组合物所制备抗肺癌药物在使用时为口服给药。
可通过混合，填充，压片等常规的方法制备固体口服组合物。灯台叶提取物药理实验的数据
1.不同溶剂提取物的制备 取200 g灯台叶各5份，分别加10倍量85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水回流提取，(2次，2 h/次)，滤过，合并滤液，分别回收溶剂，浓缩至一定体积，60 °C减压干燥。五个溶剂部位分别记为DTY-85-T，DTY-70-T，DTY-50-T，DTY-30-T，DTY-W-T。取不同提取物干燥粉末，称重，计算提取得率，结果见表I。表I灯台叶药材提取物结果
2.体外细胞活性筛选
细胞株Α549和SPC-A-I肺癌细胞
取对数生长期Α549、SPC-A-I细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液分别配成6Χ104、9X IO4的单细胞悬液接种于96孔板中，每孔100 μ L。实验组加90 μ L不含牛血清的培养基，另加入灯台叶药液10 μ L，使其最终生药浓度分别为10 mg/mL, 5 mg/mL,
2.5 mg/mL, I mg/mL,阳性对照组加顺钼(1:10) 10 μ L，空白对照组加100 μ L终浓度为
O.5%DMS0:乙醇(I: I)溶液。每组设6个平行孔，另设本底对照孔(等体积含相应浓度药物的无细胞培养液)，置于37°C 5%C02培养箱中培养36 h，每孔加入MTT液10 4 1^，培养4 11，弃去每孔中的液体，每孔加DMSO 100 μ L，振荡10 min后置于570 nm (检测波长)和630nm (参比波长)酶联免疫检测仪测定OD值，计算细胞生长抑制率(按以下公式)，用SPSS
11.5软件求其半数抑制浓度(IC5tl)。以上实验重复3次。细胞生长抑制率=(对照组OD均值-实验组OD均值)/对照组OD均值 X 100%
表2 A549和SPC-A-I细胞药效评价结果
_A549 细胞__SPC-A-I 细胞_
提取物IC50IC50IC50IC50
(mg生药/mL)(呢提取物/mL) (mg生药/mL) (_提取物/mL) DTY-85-T2M275.483.17297.03
DTY-70-T3.723 27.361 84340.56
DTY-50-T4.20__371.28__4J7__412.83
DTY-30-T7.13536.897.87592.61
DTY-W-T-
表示没有活性
在给药 36h 后，DTY-85-T、DTY-70-T、DTY-50-T 对 A549 细胞模型的 IC5tl 分别为 275. 48、327. 36,371. 28 μ g提取物/mL，对 SPC-A-1 细胞模型的 IC5tl 分别为 297. 03,340. 56,412. 83μ g提取物/mL，均 小于药物抗肿瘤活性评价的国际标准500 μ g提取物/mL，其中以85%乙醇提取得到的灯台叶提取物的体外抗肺癌的活性最好。本发明中的药物组合物在抗肺癌方面的作用，以下为组合物药理实验的数据
I. 在细胞水平上筛选有效组分
细胞活性筛选组分的制备取灯台叶药材5 kg，加10倍量85%乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，回收乙醇至浸膏。将浸膏上于AB-8大孔树脂，依次用水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，将这10个洗脱部位分别回收溶剂，60°C减压干燥，得10个洗脱组分。十个溶剂组分分别记为DTY-水组分、DTY-10%乙醇组分、DTY-20%乙醇组分、DTY-30%乙醇组分、DTY-40%乙醇组分、DTY-50%乙醇组分、DTY-60%乙醇组分、DTY-70%乙醇组分、DTY-80%乙醇组分、DTY-95%乙醇组分。细胞活性筛选
细胞株A549和SPC-A-I肺癌细胞
取对数生长期A549、SPC-A-I细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液分别配成6X104、9 X IO4的单细胞悬液接种于96孔板中，每孔100 μ L。实验组加90 μ L不含牛血清的培养基，另加入灯台叶药液10 μ L，使其最终生药浓度分别为25 mg/mL, 12. 5 mg/mL,5 mg/mL, 2. 5 mg/mL，阳性对照组加顺钼(I: 10) 10 μ L，空白对照组加100 μ L终浓度为
O.5%DMS0:乙醇(I: I)溶液。每组设6个平行孔，另设本底对照孔(等体积含相应浓度药物的无细胞培养液)，置于37°C 5%C02培养箱中培养36 h，每孔加入MTT液10 μ L，培养4h，弃去每孔中的液体，每孔加DMSO 100 μ L，振荡10 min于570 nm (检测波长)和630 nm(参比波长)波长酶联免疫检测仪测定OD值，计算细胞生长抑制率(按以下公式)，用SPSS
11.5软件求其半数抑制浓度(IC5tl)。以上实验重复3次。细胞生长抑制率=(对照组OD均值-实验组OD均值)/对照组OD均值 X 100%
表3 A549和SPC-A-I细胞药效评价结果
权利要求
1.一种抗肺癌的灯台叶中药组合物，其特征在于，该组合物的原料药为中药灯台叶。
2.根据权利要求I所述的抗肺癌的灯台叶中药组合物，其特征在于，所述的抗肺癌的灯台叶中药组合物是由灯台叶提取物中的总生物碱组分和总三萜组分组成；所述的总生物碱组分和总三萜组分按其原料生药量的质量比1:0. f 1:10组合。
3.根据权利要求2所述的抗肺癌的灯台叶中药组合物，其特征在于，所述的总生物碱组分和总三萜组分按其原料生药量的质量比1:0. 5 1:5组合。
4.根据权利要求3所述的抗肺癌的灯台叶中药组合物，其特征在于，所述的总生物碱组分和总三萜组分按其原料生药量的质量比1:1组合。
5.根据权利要求1-4之一所述的抗肺癌的灯台叶中药组合物，其特征在于，所述的抗肺癌的灯台叶中药组合物是按照以下方法制备得到的组合物 步骤(I):灯台叶用乙醇回流提取，回收溶剂，得到提取浓缩液； 步骤(2):将提取浓缩液上于大孔树脂上，先用水、低浓度乙醇洗去杂质，再用中浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总生物碱组分，最后用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总三萜组分，分别真空干燥，即得总生物碱组分和总三萜组分； 步骤(3):将步骤(2)中的总生物碱组分和总三萜组分混合均匀，得本发明的药物组合物。
6.权利要求I所述抗肺癌的灯台叶中药组合物的制备方法，其特征在于，步骤如下 步骤(I):灯台叶用乙醇回流提取，回收溶剂，得到提取浓缩液； 步骤(2):将提取浓缩液上于大孔树脂上，先用水、低浓度乙醇洗去杂质，再用中浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总生物碱组分，最后用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总三萜组分，分别真空干燥，即得总生物碱组分和总三萜组分； 步骤(3):将步骤(2)中的总生物碱组分和总三萜组分混合均匀，得本发明的抗肺癌中药组合物。
7.根据权利要求6所述抗肺癌的灯台叶中药组合物的制备方法，其特征在于具体操作步骤是 步骤⑴灯台叶用6 15倍量的体积百分比709Γ95%乙醇回流提取广4次，每次f4h，回收溶剂，得到提取浓缩液； 步骤(2):将提取浓缩液上于HPD400A、NKA-9、DlOl、DA201、AB-8型大孔树脂上，先用2 6BV的水及2 6BV的体积百分比20% 40%乙醇洗去杂质，再用4 10BV的体积百分比50%飞5%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总生物碱组分，最后用Γ ΟΒν的体积百分比709Γ95%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总三萜组分，分别真空干燥，即得总生物碱组分和总三萜组分； 步骤(3):将步骤(2)中的总生物碱组分和总三萜组分混合均匀，得本发明的抗肺癌中药组合物。
8.根据权利要求7所述抗肺癌的灯台叶中药组合物的制备方法，其特征在于步骤(I)、(2)的操作条件是 步骤(I):灯台叶用10倍量的体积百分比85%的乙醇回流提取2次，每次2h，回收溶齐U，得到提取浓缩液； 步骤(2):将提取浓缩液上于AB-8型大孔树脂上，先用4BV的水及4BV的体积百分比40%乙醇洗去杂质，再用6BV的体积百分比60%乙醇洗脱，收集体积百分比60%乙醇洗脱液，回收乙醇，得到总生物碱组分，最后用6BV的体积百分比80%乙醇洗脱，收集体积百分比80%乙醇洗脱液，回收乙醇，得到总三萜组分，分别真空干燥，即得总生物碱组分和总三萜组分。
9.权利要求I所述的抗肺癌的灯台叶中药组合物在制备抗肺癌药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的抗肺癌的灯台叶中药组合物在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于，所述的组合物所制备的抗肺癌药物在使用时为口服给药。
全文摘要
抗肺癌的灯台叶中药组合物、其制备方法及其在制备抗肺癌药物中的应用。该组合物的原料药为中药灯台叶。该组合物是由灯台叶提取物中的总生物碱组分和总三萜组分组成；总生物碱组分和总三萜组分分别按其原料生药量的质量比1:0.1~1:10组合。本发明还提供了该组合物的制备方法，以及其在制备抗肺癌药物中的应用。本发明对C57BL/6荷瘤小鼠有很好的抑瘤作用，能够显著提高小鼠的免疫力，与环磷酰胺组相比，灯台叶组合物能够显著提高荷瘤小鼠的免疫指数(胸腺指数、脾指数和肝指数)及小鼠体内细胞因子(TNF-a和IL-6)，因此灯台叶组合物具有较强的抗肺癌活性，较低的毒副作用，疗效安全可靠，是有效的抗肺癌药物。
文档编号A61P35/00GK102631396SQ20121014175
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者刘璇, 张振海, 杜萌, 陈彦 申请人:江苏省中医药研究院