专利名称：一种促进成骨和血管化的生物活性因子组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物领域，涉及一种促进成骨和成血管的生物活性因子组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
骨组织的生长过程与血管化紧密相连。充分的血供是保证骨组织工程材料体内活化的决定性因素。在骨组织的胚胎发生或骨损伤愈合的过程中，优良的血管网络能够为组织提供良好的营养供给和物质运输，缺乏良好的血供将导致骨生长异常和骨愈合不良。临床植骨修复缺损时，要求植骨床具有丰富的血供，而自体骨移植时，也常通过带血管蒂或带肌瓣来增强血供，促进移植骨早期成活。因此，一个较为完善的血管网对于骨形成是 非常必要的，它不仅能提供营养和氧气，还能输送成骨前体细胞，分泌成骨细胞所需的生长因子。骨组织工程采用三维支架与种子细胞复合的策略，虽然大大促进了骨组织损伤的修复，但其三维构建时仅靠外周渗透作用吸收营养，对于小尺寸的骨修复，早期依靠组织液的渗透可获得营养；对于大尺寸骨修复，仅靠组织液的渗透远远不够，细胞多因营养缺乏而导致移植失败，因此目前大尺寸骨组织缺损修复面临着血管化不足，组织易缺血坏死的难题。如何在新骨形成的同时，促进小血管的长入以及细胞与材料复合物内血供的重建成为骨修复的关键环节。目前有关人工骨中血供重建的研究主要集中在以下方面利用显微外科技术包裹血管束、血管蒂或筋膜瓣植入形成内在的血管网络，促进血管形成；以及血管内皮细胞与成骨细胞联合培养支架后植入体内。杨新明等提出以带蒂筋膜瓣包裹复合自体红骨髓方法构造非细胞型组织工程化骨，可一期修复大段骨缺损(中国组织工程研究与临床康复，2009, 13,46:9050);裴国献等利用带蒂筋膜瓣包裹组织工程骨的方法修复兔桡骨大段骨缺损，发现早期的血管化有利于骨修复速度(中国实验外科杂志，2007，24 (6):752)。这种带血管植入的方法借用体内已经存在的血管条件来促进人工骨的血管化，手术效果明确，但存在增加机体额外创伤、受局部血管条件限制等缺点。将骨髓基质干细胞分别定向分化为成骨细胞和血管内皮细胞使二者相互促进发挥作用是血管化研究的一个方向。Kaigler等通过动物实验发现，内皮细胞和骨髓基质干细胞共移植较单独移植更有利于成骨(KaiglerD，eral, FASEB J,2005, 19 (6) :665);谭洪波等将兔骨髓诱导的内皮细胞用纤维蛋白胶接种到脱钙骨基质支架上，证实骨髓诱导的内皮细胞在脱钙骨支架内可以在体外培养成官腔样内皮样结构(谭洪波等，骨组织工程支架体外血管化初步研究，重庆医学，2007，36 (6)499 )。但是细胞策略前期细胞培养的周期长，不利于实际临床应用。因此，本领域尚需研制一种新型的可同时促进成骨和血管化的重建材料。
发明内容
本发明目的在于提供一种可同时促进成骨和血管化的生物活性因子组合物及其制备方法和应用。
本发明的第一方面，提供一种生物活性因子组合物，所述组合物包含生物活性因子和磺化多糖，所述生物活性因子选自骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)中的一种或两种以上；所述磺化多糖选自磺化壳聚糖、 磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纤维素中的一种或两种以上。在另一优选例中，所述生物活性因子为BMP-2、或BMP-7 ;或者所述生物活性因子为选自下组的因子与BMP-2或BMP-7的复合物转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)或其组合。在另一优选例中，磺化多糖的分子量在8000-350000Da，硫含量为O. 5%_20%。在另一优选例中，所述磺化多糖的分子量在10000-300000Da，硫含量为1%_20%。在另一优选例中，所述生物活性因子与磺化多糖的质量比例为O. 05 120: I。在另一优选例中，所述生物活性因子与磺化多糖的质量比例为O. f 100:1。在另一优选例中，，所述生物活性因子组合物还包含水。本发明的第二方面，提供第一方面所述的生物活性因子组合物的制备方法，所述方法包括将生物活性因子加入到磺化多糖水溶液中，混合均匀得到所述生物活性因子组合物的步骤。在另一优选例中，所述磺化多糖水溶液浓度为O. Of 150 μ g/mL。在另一优选例中，所述磺化多糖水溶液浓度为O. 02^100 μ g/mL。在另一优选例中，所述方法还包括将生物活性因子组合物进行冷冻干燥的步骤。本发明的第三方面，提供一种可成骨植入体，所述植入体包含第一方面所述的生物活性因子组合物以及医学上可接受的载体。本发明的第四方面，提供第一方面所述的生物活性因子组合物的用途，用于制备修复骨缺损、治疗骨折、或修复软骨的药物或植入体。本发明提供了一种由生长因子和磺化多糖组成的生物活性因子组合物，可同时促进成骨和促进血管化，且材料易得，成本低，应用方便。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图I为实施例8中肌袋内成骨的HE染色切片图。图2为实施例8肌袋内成骨的照片。图3为实施例9中肌袋内成骨的HE染色切片图。图4为实施例9肌袋内成骨的照片。图5为实施例10中肌袋内成骨的HE染色切片图。图6为实施例10肌袋内成骨的照片。图7为实施例11中肌袋内成骨的HE染色切片图。图8为实施例11肌袋内成骨的照片。
图9为实施例12中肌袋内成骨的HE染色切片图。图10为实施例12肌袋内成骨的照片。图11为实施例13中肌袋内成骨的HE染色切片图。图12为实施例13肌袋内成骨的照片。图13为实施例14中肌袋内成骨的HE染色切片图。图14为实施例14肌袋内 成骨的照片。图15为对比例I中肌袋内移植区组织HE染色切片图。图16为对比例2肌袋内成骨的照片。
具体实施例方式本申请的发明人经过广泛而深入的研究，意外发现包含生物活性因子和磺化多糖的生物活性因子组合物在促进成骨的同时能够促进血管生成。在此基础上，完成了本发明。生物活性因子所谓生物活性因子，是指来自生物体内的对生命现象具有影响的微量或少量物质，主要是生物活性多肽和细胞因子两大类。生物活性肽(biologicalactivepeptides, bap)指的是一类分子量小于6000d,具有多种生物学功能的多肽。其分子结构复杂程度不一，可从简单的二肽到环形大分子多肽，而且这些多肽可通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰。细胞因子(cytokine,简称ck)是指由活化免疫细胞或非免疫细胞(包括骨髓、胸腺中的基质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等)合成分泌的能调节细胞生理功能，介导炎症反应、参与免疫应答和组织修复等多种生物学效应的小分子多肽，它们与免疫球蛋白和补体一样属于分泌型免疫分子。生长因子属于细胞因子，是一类刺激细胞生长和增殖的细胞外多肽信号分子。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMP)是一种能够通过诱导成骨修复骨缺损的生物材料，是一类生长分化因子家族，包括ΒΜΡ-1、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-7等，作用具有浓度依赖性，与相应感受器结合会产生一系列骨形态发生蛋白反应基因的信号表达和转录，诱导间质细胞分化为骨或软骨。在近20年中，人们不仅从多种动物骨组织中分离和纯化出天然的BMP-1、BMP-2、BMP-3和BMP-4，而且还通过基因重组技术进一步在中国仓鼠的卵母细胞和大肠杆菌中表达出了人类基因重组的骨形态发生蛋白(rh BMPs)。目前已有超过15种骨形态发生蛋白被克隆并在人和鼠体内表达。转化生长因子(transforming growth factor, TGF)是可作用于细胞生长、转化等的生长因子。包括转化生长因子-a (TGF-α )和转化生长因子-β (TGF-β )两类。TGF-a是由巨噬细胞，脑细胞和表皮细胞产生，可诱导上皮发育。TGF-β是一多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。TGF-β可以结合到细胞表面的TGF-β受体结合而激活其受体。TGF-β受体是丝氨酸/苏氨酸激酶受体。其信号传递可以通过SMAD信号通路和/或DAXX信号通路。血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)属血小板源性生长因子家族的生长因子，刺激血管内皮细胞的有丝分裂和血管的发生，提高单层内皮的通透性，能与胎盘生长因子形成异二聚体。VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。喊性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一个传递发育信号，能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽。具有强烈的血管生成作用。在体夕卜，能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原。成骨蛋白(osteogenin protein, 0GP)是诱导骨形成的蛋白质(小于50kDa),与细胞外基质和肝素结合，是多功能细胞因子，属于转化生长因子超家族。磺化多糖多糖(polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。包括壳聚糖、淀粉、氨基聚糖、和纤维素等。磺化多糖是多糖经磺化反应得到的产物。磺化是一种向有机分子中引入磺酸基(一SO3H)或磺酰氯基(一SO3Cl)的反应过程。所用磺化剂通常有三氧化硫，浓硫酸，发烟硫酸等。有时也用氯磺酸、二氧化硫加氯气、二氧化硫加氧以及亚硫酸钠等作为磺化剂。磺化方法有液相磺化法和气相磺化法。磺化过 程中磺酸基取代碳原子上的氢称为直接磺化；磺酸基取代碳原子上的卤素或硝基，称为间接磺化。本发明中的磺化多糖选自磺化壳聚糖、磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纤维素中的一种或两种以上。采用本领域已知的方法以壳聚糖、葡聚糖等为原料，经磺化后制得。如参考氯磺酸磺化法或浓硫酸磺化法制备磺化壳聚糖和磺化葡聚糖(吉林化工学院学报，2007, 24(2) :20.西华师范大学学报，2006，27 (1):95)。磺化多糖的硫含量通过元素分析仪测定(Elementar,德国Vario Macro公司)。生物活性因子组合物及其制备本发明的生物活性因子组合物，包含生物活性因子和磺化多糖，所述生物活性因子选自骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)中的一种或两种以上；所述磺化多糖选自磺化壳聚糖、磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纤维素中的一种或两种以上。所述生物活性因子的来源可以是人基因重组，经发酵、分离得到，也可以直接从动物体内提取得到。在另一优选例中，所述生物活性因子为BMP-2。在另一优选例中，所述生物活性因子为BMP-7。在另一优选例中，所述生物活性因子为BMP-2与选自下组的因子的复合物转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)或其组合。在另一优选例中，所述生物活性因子为BMP-7与选自下组的因子的复合物转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)或其组合。磺化多糖的分子量在8000-350000Da，硫含量为0. 5%_20%。在另一优选例中，所述磺化多糖的分子量在10000-300000Da，硫含量为1%_20%。所述生物活性因子与磺化多糖的质量比例为0. 05 120: I。
在另一优选例中，所述生物活性因子与磺化多糖的质量比例为O. f 100:1。所述生物活性因子组合物可以为冻干制剂，以固体形式存在；或者溶于水中，以溶液形式存在。所述的生物活性因子组合物的制备方法，包括将生物活性因子加入到磺化多糖水溶液中，混合均匀得到所述生物活性因子组合物的步骤。在另一优选例中，所述磺化多糖水溶液浓度为O. Of 150 μ g/mL，较佳地，所述磺化多糖水溶液浓度为O. 02^100 μ g/mL。在另一优选例中，所述生物活性因子与磺化多糖的质量比例为O. 05 120:1，较佳地，所述生物活性因子与磺化多糖的质量比例为O. f 100:1。在另一优选例中，所述方法还包括将生物活性因子组合物进行冷冻干燥的步骤。
冷冻干燥又称升华干燥。将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法，是本领域惯常使用的制备冻干制剂的方法。本发明中没有特别的限制，可以采用常规的操作条件进行冻干，如将溶液在_20°C冷冻，水转变为冰后置于冷冻干燥机中干燥得到冻干制剂。可成骨植入体在本发明中，可成骨植入体是指包含上述生物活性因子组合物和医学上可接受的载体的移植物，用于修复骨缺损、治疗骨折、或修复软骨。本发明的生物活性因子组合物，包含生物活性因子和磺化多糖，与单纯使用生物活性因子相比，具有增效协同作用，即促进成骨的同时，促进血管的生成。由于促进血管生成作用显著，血管的生成同时也促进骨的生成。可用于本发明的可成骨植入体的医学上可接受的载体是医学上可接受的生物材料，包括(但不限于)(I)无机材料，例如羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸钙骨水泥、生物玻璃、硅酸钙、硫酸 丐等;(2)合成高分子，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐、聚乙二醇、聚己内酯等；(3)天然高分子,例如胶原、明胶、糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸、葡聚糖等；(4)上述材料的混合物或复合材料。将本发明生物活性因子组合物置于医学上可接受的载体上构成可成骨植入体，将可成骨植入体植入到体内，生物活性因子和磺化多糖协同作用，促进成骨和血管生成。医学上可接受的载体可以是可降解的生物相容性材料，在体内逐渐降解，同时释放出生长因子组合物，促进新骨的形成。随着材料的逐步降解，新生骨渐渐取代原有材料从而加速材料的体内降解过程。当本发明的医学上可接受的载体为可注射性材料(如可注射骨水泥)时，将该液体材料与本发明的生物活性因子组合物混合，注射到骨损伤部位，进行原位成骨。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何被提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的优点在于(I)本发明提供了一种由生长因子和磺化多糖组成的生物活性因子组合物，其作用是可同时促进成骨和促进血管化，避开了使用多因子所带来的潜在风险以及使用带血管植入所产生的创伤。(2)本发明材料易得，制备条件温和，所制备的生物活性因子组合物可以方便地加入到医学上可接受的载体中一同使用，并可采用植入或注射方法置入体内，应用方便。(3)本发明适用范围广，能适应不同形状的缺损修复和重建。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I将分子量为10万，硫含量为8%的磺化壳聚糖溶解于去离子水中，配制成IOyg/HiL磺化壳聚糖水溶液。按生物活性因子与磺化多糖的质量比例1:1加入人骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)，混合均匀，即得到生物活性因子组合物。实施例2将分子量为30万，硫含量为5%的磺化壳聚糖溶解于去离子水中，配制成50μ g/mL磺化壳聚糖水溶液。按生物活性因子与磺化多糖的质量比例2:1加入人骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)，混合均匀，即得到生物活性因子组合物。实施例3将分子量为20万，硫含量为15%的磺化葡聚糖溶解于去离子水中，配制成
O.02 μ g/mL磺化壳聚糖水溶液。按生物活性因子与磺化多糖的质量比例1:10加入人骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)，混合均匀，即得到生物活性因子组合物。实施例4将分子量为I万，硫含量为12%的硫酸化肝素溶解于去离子水中，配制成100 μ g/mL磺化壳聚糖水溶液。按生物活性因子与磺化多糖的质量比例100:1加入质量均等的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和转化生长因子(TGF)，混合均匀，即得到生物活性因子组合物。实施例5将分子量为12万，硫含量为1%的磺化壳聚糖溶解于去离子水中，配制成20 μ g/mL磺化壳聚糖水溶液。按生物活性因子与磺化多糖的质量比例I:I加入质量均等的骨形态发生蛋白-7(BMP-7)和血管内皮生长因子(VEGF)，混合均匀，即得到生物活性因子组合物。实施例6将分子量为10万，硫含量为10%的磺化葡聚糖溶解于去离子水中，配制成50μ g/mL磺化壳聚糖水溶液。按生物活性因子与磺化多糖的质量比例1:2加入质量均等的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和成骨蛋白(OGP)，混合均匀，即得到生物活性因子组合物。实施例7
将分子量为10万，硫含量为11%的硫酸纤维素溶解于去离子水中，配制成150 μ g/mL硫酸纤维素水溶液。按生物活性因子与磺化多糖的质量比例50:1加入质量均等的骨形态发生蛋白-7(BMP-7)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，混合均匀，即得到生物活性因子组合物。实施例8将含10 μ g生长因子BMP-2的生物活性因子组合物(实施例I)滴加到可吸收明胶海绵上，冻干，封装，于-20°C储存待用。将生长2周的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒。将如上制备的含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物植入右大腿肌袋中。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察(见图1)，发现横纹肌组 织中可见骨组织，包括骨小梁及骨髓。骨组织周围出现比较粗壮的毛细血管。其余小鼠解剖其右腿取出新长的骨头(见图2)，新骨的平均鲜重为160mg ;把新骨放在高温炉中600°C下煅烧6h，随炉冷却后，取出称其灰分平均重量为lOOmg，证实生物活性因子组合物具有很好的诱导成骨活性，并且有利于成骨过程的血管化。实施例9将含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物(实施例2)滴加到磷酸钙支架上，冻干，封装，于_20°C储存待用。将生长2周的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒。将如上制备的含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物植入右大腿肌袋中。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察(见图3)，发现横纹肌组织中可见骨组织，包括骨小梁及骨髓。骨组织周围出现比较粗壮的毛细血管。其余小鼠解剖其右腿取出新长的骨头(见图4)，新骨的平均鲜重为150mg ;把新骨放在高温炉中600°C下煅烧6h，随炉冷却后，取出称其灰分平均重量为95mg，证实所制备的生物活性因子组合物具有很好的诱导成骨活性，并且有利于成骨过程的血管化。实施例10将含IOyg生长因子的生物活性因子组合物(实施例3)滴加到可注射壳聚糖凝胶中，冻干，封装，于-20°C储存待用。将生长2周的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒。将如上制备的含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物注入右大腿肌袋中。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察(见图5)，发现横纹肌组织中可见骨组织，包括骨小梁及骨髓。骨组织周围出现比较粗壮的毛细血管。其余小鼠解剖其右腿取出新长的骨头(见图6)，新骨的平均鲜重为162mg ;把新骨放在高温炉中600°C下煅烧6h，随炉冷却后，取出称其灰分平均重量为150mg，制备的生物活性因子组合物具有很好的诱导成骨活性，并且有利于成骨过程的血管化。实施例11将含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物(实施例4)滴加到可吸收明胶海绵上，冻干，封装，于_20°C储存待用。将生长2周的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒。将如上制备的含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物植入右大腿肌袋中。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察(见图7)，发现横纹肌组织中可见骨组织，包括骨小梁及骨髓。骨组织周围出现比较粗壮的毛细血管。其余小鼠解 剖其右腿取出新长的骨头(见图8)，新骨的平均鲜重为130mg ;把新骨放在高温炉中600°C下煅烧6h，随炉冷却后，取出称其灰分平均重量为90mg，制备的生物活性因子组合物具有很好的诱导成骨活性，并且有利于成骨过程的血管化。实施例12将含IOyg生长因子的生物活性因子组合物(实施例5)滴加到磷酸钙支架中，冻干，封装，于-20°C储存待用。将生长2周的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒。将如上制备的含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物植入右大腿肌袋中。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察(见图9)，发现横纹肌组织中可见骨组织，包括骨小梁及骨髓。骨组织周围出现比较粗壮的毛细血管。其余小鼠解剖其右腿取出新长的骨头(见图10)，新骨的平均鲜重为123mg ;把新骨放在高温炉中600°C下煅烧6h，随炉冷却后，取出称其灰分平均重量为85mg，制备的生物活性因子组合物具有很好的诱导成骨活性，并且有利于成骨过程的血管化。实施例13将含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物(实施例6)滴加到硅基干凝胶中，冻干，封装，于_20°C储存待用。将生长2周的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒。将如上制备的含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物植入右大腿肌袋中。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察(见图11)，发现横纹肌组织中可见骨组织，包括骨小梁及骨髓。骨组织周围出现比较粗壮的毛细血管。其余小鼠解剖其右腿取出新长的骨头(见图12)，新骨的平均鲜重为142mg ;把新骨放在高温炉中600°C下煅烧6h，随炉冷却后，取出称其灰分平均重量为llOmg，制备的生物活性因子组合物具有很好的诱导成骨活性，并且有利于成骨过程的血管化。实施例14将含IOyg生长因子的生物活性因子组合物(实施例7)滴加到可注射壳聚糖凝胶中，冻干，封装，于-20°C储存待用。将生长2周的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒。将如上制备的含10 μ g生长因子的生物活性因子组合物注入右大腿肌袋中。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察(见图13)，发现横纹肌组织中可见骨组织，包括骨小梁及骨髓。骨组织周围出现比较粗壮的毛细血管。其余小鼠解剖其右腿取出新长的骨头(见图14)，新骨的平均鲜重为127mg ;把新骨放在高温炉中600°C下煅烧6h，随炉冷却后，取出称其灰分平均重量为108mg，制备的生物活性因子组合物具有很好的诱导成骨活性，并且有利于成骨过程的血管化。对比例I
将磺化壳聚糖水溶液滴加到可吸收明胶海绵中，冻干，封装，得到含10μ g磺化壳聚糖的移植物，于_20°C储存待用。将生长2周的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒。将如上制备的含10 yg磺化壳聚糖的移植物植入右大腿肌袋中。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察(见图15)，发现横纹肌组织中未见异物及炎症反应，同时未见骨组织、骨小梁及骨髓。其余小鼠解剖其右腿取出移植部位，均未见骨组织形成。单纯的磺化多糖不能诱导新骨生成。对比例2将骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)水溶液滴加到可吸收明胶海绵中，冻干，封装，得到含 ο μ g骨形态发生蛋白-2的移植物于-20°c储存待用。将生长2周的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒。将如上制备的含10μ g骨形态发生蛋白-2的移植物植入右大腿肌袋中。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察，发现横纹肌组织中可见骨组织，包括骨小梁及骨髓。骨组织周围未出现比较粗壮的毛细血管。其余小鼠解剖其右腿取出新长的骨头(见图16)，新骨的平均鲜重为105mg ;把新骨放在高温炉中600°C下煅烧6h，随炉冷却后，取出称其灰分平均重量为60mg，结果表明，单一的生长因子无法同时兼顾成骨和成血管功能，新生组织中没有较好的血管生成。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种生物活性因子组合物，其特征在于，所述组合物包含生物活性因子和磺化多糖，所述生物活性因子选自骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成骨蛋白中的一种或两种以上；所述磺化多糖选自磺化壳聚糖、磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纤维素中的一种或两种以上。
2.根据权利要求I所述的生物活性因子组合物，其特征在于，所述生物活性因子为BMP-2、或 BMP-7 ;或者 所述生物活性因子为选自下组的因子与BMP-2或BMP-7的复合物转化生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成骨蛋白或其组合。
3.根据权利要求I所述的生物活性因子组合物，其特征在于，磺化多糖的分子量在8000-350000Da，硫含量为 O. 5%_20%。
4.根据权利要求I所述的生物活性因子组合物，其特征在于，所述生物活性因子与磺化多糖的质量比例为O. 05 120:1。·
5.根据权利要求I所述的生物活性因子组合物，其特征在于，所述生物活性因子组合物还包含水。
6.根据权利要求f5任一项所述的生物活性因子组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括将生物活性因子加入到磺化多糖水溶液中，混合均匀得到所述生物活性因子组合物的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述磺化多糖水溶液浓度为O.Of 150μ g/mL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括将生物活性因子组合物进行冷冻干燥的步骤。
9.一种可成骨植入体，其特征在于，所述植入体包含权利要求I所述的生物活性因子组合物以及医学上可接受的载体。
10.如权利要求I所述的生物活性因子组合物的用途，其特征在于，用于制备修复骨缺损、治疗骨折、或修复软骨的药物或植入体。
全文摘要
本发明公开了一种促进成骨和血管化的生物活性因子组合物，包含生物活性因子和磺化多糖，所述生物活性因子选自骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成骨蛋白中的一种或两种以上；所述磺化多糖选自磺化壳聚糖、磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纤维素中的一种或两种以上。本发明还公开了该组合物的制备方法以及含有该组合物的移植物。本发明的组合物，促进成骨的同时还能促进血管生成，与医学上可接受的载体复合，采用植入或注射等方式应用于骨缺损修复等领域。
文档编号A61K31/727GK102895704SQ20121025820
公开日2013年1月30日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者刘昌胜, 曹玲燕, 王靖 申请人:华东理工大学