专利名称：一种hcv的dna疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和感染免疫领域，具体涉及ー种丙型肝炎病毒(hepatitisC Virus, HCV)的DNA疫苗，本发明还涉及该疫苗的制备方法。
背景技术：
我国是HCV高感染率国家之一，HCV感染是导致慢性肝炎、肝癌、肝硬化的主要因素之一，严重影响人类健康。目前尚无有效的治疗和预防性HCV疫苗。HCV的最终控制将取决于疫苗预防。在抵挡病毒的入侵过程和免疫抵抗HCV攻击人体细胞中，特异性中和性抗体和细胞免疫起到了非常重要的作用。HCV包膜(envelope)糖蛋白(El和E2)能够诱使机体产生中和抗体，阻断病毒的入侵。包膜E2蛋白是诱导中和抗体的主要靶抗原，虽然E2蛋白的变异性较高，但近年在E2中鉴定出了一系列保守的中和抗体表位，这给HCV疫苗的开发带来了新希望。DNA疫苗已经广泛地应用于こ型肝炎病毒，狂犬病毒和人类获得免疫缺陷病毒的预防和治疗中。它的基本原理是将编码抗原的基因片断直接通过肌肉注射或基因枪等方法直接导入宿主体内，DNA体内摄取后，抗原蛋白的转录后修饰及立体构象和自然感染时所产生的抗原蛋白完全一祥，抗原性好，这些内生(源)性蛋白抗原经MHC I类途径呈递，诱导产生细胞毒性淋巴反应(CTL)效应性⑶8+T细胞；可溶性抗原蛋白释放到细胞外后，被专职抗原递呈细胞(APC)摄取，然后经MHC II类途径呈递，活化CD4+T细胞，及其随后产生抗体的B细胞活化，因此DNA免疫可全面诱导机体的免疫反应。HCV病毒体基因编码3011个氨基酸的长开放读码框。在病毒复制中，氨基端有三个蛋白(C、E1、E2 / NSl)，羧基端有四个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5) (Pwalotsky JM,Gastroenterology, 2002,122 (6) :1554—1568)。HCV E 区包膜糖蛋白是诱导中和抗体的主要抗原区，故HCV E区及其编码的抗原是HCV疫苗研究的重点(Fournillier，etal. J. Virol, 2001; 75:12088)。HCV的包膜蛋白El和E2在病毒识别、粘附、侵入宿主细胞过程中发挥关键作用。E1E2含有T、B细胞表位，可以诱导保护性免疫反应，是保护性抗原。糖基化是蛋白翻译后的重要修饰加工环节，可以诱导蛋白空间构象正确折叠，增加蛋白的酶亲水性，稳定性，并且可以调节蛋白的抗原性。El和E2上含有多个保守的N-糖基化位点，即在HCV的不同基因型中N-糖基化位点均是保守存在的。其中EI有5个N-糖基化位点，E2 上有 11 个(Goffard, A et al.，J. Virol, 2005，79:8400-8409 ；Slater-Handshyet al, Virology, 2004, 319(1):36-48)。尽管E1E2的功能和作用已经比较清楚,然而E1E2的免疫保护性仍然较低。另外，HCV的基因编码的El和E2蛋白的分子量大小分别是31KD和70KD，其原核表达蛋白不能形成蛋白质的糖基化，且表达困难，而真核表达的产量较低且纯化困难。因而E1E2在实际免疫保护中的应用受到了限制，不利于推广
发明内容
本发明的第一个目的在于针对上述不足，提供ー种具有更强免疫保护性的E1E2突变体。本发明的第二个目的在于提供能够产生上述突变体的DNA疫苗。本发明的第三个目的在于提供上述DNA疫苗的制备方法。为实现上述目的，本发明首先提供ー种HCV包膜 糖蛋白E1E2突变体，其为El蛋白和E2蛋白的融合蛋白，并且El蛋白的第2个糖基化位点由N突变为D，E2蛋白的第8个糖基化位点由N突变为D。即，该突变体是E1E2蛋白的N-糖基化位点突变，氨基酸由原来的天冬酰胺突变为天冬氨酸得到，具体所述突变是E1E2蛋白的E1-N209SS突变为E1-D209SS，E2-N430AS突变为E2-D430AS。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。该突变体可诱导产生比野生型HCVE1E2更强的特异性细胞免疫(CTL)和中和性抗体(neutralizingantibody, NAb)。进ー步本发明提供所述HCV包膜糖蛋白E1E2突变体的基因。为促进构建得到的DNA疫苗的激活功能，优选对该基因序列进行CpG修饰，连接上CpG序列，较佳的CpG序列为GACGTT。较佳的所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本发明所述的核酸疫苗(DNA疫苗)即包含上述基因，其被构建于表达载体上，例如病毒载体，优选所述载体为pVAX-1 (美国FDA认可用于人体的DNA疫苗的载体)。在HCV野生型E1E2基因(例如以HCV病毒基因型Ia的E1E2的真核表达质粒 pcDNA3_ElE2 为模板，PCR 获得的 E1E2 基因序列(Chen F，et al. , Antimicrobialagents and Chemotherapy, 2010，p3355_3364))两端分别引入CpG序列以及酶切位点BamHI+EcoRI，将该片段构建到质粒载体上，再用定点突变PCR方法将E1E2上相应的糖基化位点的天冬酰胺密码子突变为天冬氨酸密码子，BamHI+EcoRI双酶切该质粒载体及表达载体(例如pVAX-1 )，连接，筛选正确连接的重组载体即得。本发明构建的N-糖基化位点突变的HCV的E1E2糖基化突变体能产生更强的免疫原性，能诱导比野生型更强的细胞免疫和中和性抗体产生，因而可以有效地清除病毒，在体外能有效地中和病毒感染。本发明DNA疫苗以真核表达质粒DNA为免疫原，直接和CpG佐剂联合免疫，克服了糖基化蛋白质在原核和真核表达上的困难，有效地中和病毒进ー步感染。
图I显示的是采用乳酸脱氢酶释放实验(LDH实验)检测小鼠细胞毒性T细胞(CTL)特异性杀伤活性的結果。CpG增强了小鼠的的特异性CD8+T杀伤活性即CTL，其中CpG-N2N8诱导产生的CTL活性最高，与WT - E1E2组相比*p < 0. 05。E:T代表效靶细胞的比例。图2显示的是定量RT-PCR检测病毒感染Huh7. 5. I细胞的病毒RNA表达情況。结果CpG-N2N8免疫小鼠的血清抑制JHl(2a)HCVCC感染Huh7. 5. I细胞的中和能力最強。与对照和WT组相比*p〈0. 05。图3显示的是免疫印迹(Western Blot)检测病毒感染Huh7. 5. I细胞的病毒蛋白表达情況。与野生型HCVE1E2组相比，CpG-N2N8免疫小鼠后获得的血清对HCVcc感染有更明显的中和作用。(A) WB检测血清中和抑制HCV的NS3的表达(不同突变体免疫小鼠的的抗血清按照1:200的比例稀释，C代表CpG) ; (B) WB检测血清中和抑制HCV的E2的表达。
图4显示的是免疫后小鼠血清对HCVpp感染的抑制情況。结果CpG_N2N8免疫小鼠后获得的血清均能有效抑制7个基因型的HCVpp感染Huh7. 5. I细胞，与WT-E1E2组相比*p < 0. 05。表I显示的为各组突变体免疫小鼠后，小鼠的抗体水平，以及血清学转换情況。
具体实施例方式以下实施例用于进ー步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。实施例I一、构建含有E1E2野生型及突变体的真核重组质粒载体为pVAX_l,pcDNA3.1-E1E2质粒载体(Chen F，et al. , Antimicrobial agentsand Chemotherapy, 2010, p3355_3364)含有完整la型HCV的E1E2的全长基因序列(基因序列号为AY958062),由BamHI+EcoRI酶切插入pVAX-1 (Invitrogen)载体。。再用定点突变PCR方法将E1E2上相应的糖基化位点的天冬酰胺突变为天冬氨酸。BamHI+EcoRI双酶切pVAX-1，和E1E2及糖基化突变体片段，连接，获得重组质粒分别命名为平pVAX-CpG-N2N8，CpG-N8, CpG-Nl3, CpG_N2N4，CpG_N2N8，CpG_N2N14。构建中所需引物如下E1E2-P1:5’ -CGGGATCCGCCACCATGGGTTCCTCTTTTTCTATE1E2-P2:5’ -CGGAATTCTACGCCTCCGCTTGGGATAE1E2-P3:5， -CAATACTCGAGTCAGGGCAATCATE1E2-P4:5’ -TGATTGCCCTGACTCGAGTATTGTE1E2-P5:5， -GTAGATAGAGCAGTCGCAGTCTTGCGTE1E2-P6:5’ -ACGCAAGACTGCGACTGCTCTATCTACE1E2-P7:5， -TGTCGAGGCTCGCATCACAGTTCAAGGCE1E2-P8:5’ -GCCTTGAACTGTGATGCGAGCCTCE1E2-P9: ATCCAGATGAGTCCATCCAGGTGCAACCGE1E2-P10:CACCTGGATGGACTCATCTGGATTTE1E2-P11:5’ -CAAGGTGTTGTCGCCCACTCCTCCE1E2-P12:
5， -GAGGAGTGGGCGACAACACCTTGE1E2-P13: 5’ -CGGGATCCGACGTTATGGGTTCCTCTTTTTCTATCTE1E2-P14:5’ -AATGAATTCGACGTTCTACGCCTCCGCTTGGGATAT其中，E1E2-P1和E1E2-P2用来构建E1E2全长的质粒，E1E2-P3和E1E2-P4引物用来突变N2位点，E1E2-P5和E1E2-P6用来突变N4位点，E1E2-P7和E1E2-P8用来突变N8位点，E1E2-P9和E1E2-P10用来突变N13位点，E1E2-P11和E1E2-P12用来突变N14位点，E1E2-P13和E1E2-P14用来引入CpG序列。下面以突变N2位点为例，反应体系如下上游产物的获取下游产物的获取模板质粒pcDNA3. 1/E1E2 :lu I 模板质粒 pcDNA3. 1/E1E2 :lu IIOmm dNTP:2iilIOmm dNTP:2iilE1E2-Pl:lu IE1E2-P4:lu IE1E2-P3:lu IE1E2-P2:lu IIOXpfu buffer:5 U IIOXpfu buffer:5 U IPfu 酶I u IPfu 酶I u IddH20:39 u IddH20:39 U I全长PCR产物的获取模板上游产物2 ill+下游产物2 U IIOmm dNTP:2lilE1E2-P1:1 U IE1E2-P2:1 U IIOXpfu buffer:5 U IPfu 酶2 U IddH20:35 U I反应条件如下
940C，5min
94TJ, 30 s ヽ
55°C, 40 s > 30 循环
72'C , 4 min ン
72 C，IOminニ、DNA疫苗免疫小鼠抗血清抗体效价比较采用OMEGA Biotek公司的提取质粒DNA试剂盒，将重组的E1E2野生型质粒以及糖基化突变体质粒提取，纯化，去除内毒素后，以20ii g的量和500U IL-2(免疫佐剂)，通过基因导入仪将不同质粒分别导入小鼠大腿肌肉内，每周一次，共免疫三次，E2蛋白加强免疫一次，最后一次免疫后10天时取小鼠血清，酶联免疫吸附法检测针对E2蛋白的抗体效价(见表I)。表I.质粒DNA免疫后小鼠总I gG抗体效价
E2蛋白
分血清转换数效价 IgG2a:IgGl
权利要求
1.HCV包膜糖蛋白E1E2突变体，其为El蛋白和E2蛋白的融合蛋白，并且El蛋白的第2个糖基化位点由N突变为D，E2蛋白的第8个糖基化位点由N突变为D。
2.根据权利要求I所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNo. I所示。
3.编码权利要求I或2所述HCV包膜糖蛋白E1E2突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，该基因还连接有CpG序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
6.—种核酸疫苗,其包括权利要求3、任一项所述的基因。
7.根据权利要求6所述的核酸疫苗，其特征在于，所述基因构建于表达载体上。
8.根据权利要求7所述的核酸疫苗，其特征在于，所述表达载体为pVAX-1。
9.ー种制备权利要求7或8所述核酸疫苗的方法，该方法包括如下步骤 在HCV野生型E1E2基因两端引入CpG序列以及酶切位点及 HI+&ORI，将该片段构建到质粒载体上，再用定点突变PCR方法将E1E2上相应的糖基化位点的天冬酰胺密码子突变为天冬氨酸密码子，Bamm+EcoRI双酶切该质粒载体及表达载体，连接，筛选正确连接的重组载体即得。
全文摘要
本发明公开了一种HCV的DNA疫苗及其制备方法，该疫苗具有CTL细胞免疫和中和病毒感染能力。其制备方法为首先构建含有E1E2野生型基因的重组质粒；其次是利用定点突变PCR突变E1E2上相应的糖基化突变体(E1-N209SS突变为E1-D209SS，E2-N430AS突变为E2-D430AS)，并采用PCR方法偶联CpG序列，该突变体命名为CpG-N2N8。该DNA疫苗免疫小鼠后可获得中和HCVcc的抗血清。本发明方法简便，成本低，DNA疫苗可表达病毒基因，免疫后可诱导比野生型E1E2更强的CTL细胞免疫及中和性抗体的体液免疫应答，具有显著的经济效益。
文档编号A61P31/14GK102746387SQ20121025825
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者任玉珊, 林苗, 章晓联 申请人:武汉大学