猪瘟细胞适应毒、由其制得的猪瘟病毒活疫苗及制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪瘟细胞适应毒、由其制得的猪瘟病毒活疫苗及制备方法。该方法用猪瘟病毒适应毒作为制苗毒种，经传代细胞连续培养制备猪瘟细胞适应毒原始毒种、基础毒种及生产毒种，再通过猪瘟细胞适应毒生产毒种在传代细胞系增殖后连续收获合格病毒液作为猪瘟弱毒疫苗用抗原，经配苗、分装、冻干制得猪瘟细胞适应毒活疫苗，该方法在猪瘟毒种制备时不需要使用兔子传代来制备毒种，解决了为预防猪瘟而屠杀兔子等动物福利问题，并减少脾毒制备中可能携带外源因子和潜在的散毒风险。该方法制备猪瘟病毒活疫苗，病毒繁殖时间短、收获次数多，单位细胞收获的病毒液量大，病毒含量高，生产成本低。所制得的猪瘟病毒活疫苗安全性好、免疫效力高。
【专利说明】猪瘟细胞适应毒、由其制得的猪瘟病毒活疫苗及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于畜类生物制药【技术领域】，涉及一种猪瘟细胞适应毒、由其制得的猪瘟病毒活疫苗及制备方法。
【背景技术】
[0002]猪痕是由猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一种高度接触性传染病，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，死亡率高达80 %~90 %。猪瘟被国际动物卫生组织划分为A类疾病之一，我国将其划分为一类疾病。中国学者培育成功的猪瘟兔化弱毒苗是目前世界上公认的安全和有效的疫苗，借助于C株疫苗密集接种和综合防制措施，有关国家已经有效地控制了猪瘟，甚至消灭了猪瘟。在我国，猪瘟流行出现典型猪瘟与非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等，因此，猪瘟新的流行形式给我国养猪业防治本病提出了新的挑战。
[0003]疫苗接种仍是我国目前防制猪瘟的主要措施，2007年农业部出台了对猪瘟实行强制免疫的政策。我国目前生产猪痕兔化弱毒细胞苗用的细胞有牛睾丸细胞原代细胞和猪睾丸细胞系(ST细胞)。但这些疫苗在生产实践中仍需使用大量兔子来繁殖猪瘟脾毒作为毒种，在制备猪瘟脾毒时由于接毒家兔个体差异容易造成猪瘟种毒制备工艺不稳定，同时脾毒制备工艺复杂，无菌难以控制，还具有潜在散毒的危险和动物福利问题。
[0004]中国专利CN 101181637A公开了一种用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，该方法选择传代细胞系作为制苗用细胞，并对制苗用细胞的传代与培养，然后进行细胞毒种的繁殖及制苗毒液的繁殖，最后进行配苗、分装及冻干来生产猪瘟活疫苗。该方法在繁殖猪瘟病毒“C株”生产毒种时是采用ST细胞系，但在繁殖基础毒种时仍需使用大量的兔子，而且，该方法在猪瘟制苗毒液的繁殖时收毒时间较长、收获次数较少，单位细胞收获的病毒液少。此外，该方法病毒含量低，疫苗成本高。
[0005]因此，目前存在的问题是需要研究开发一种病毒含量高，成本低的猪瘟病毒活疫苗，以及一种在猪瘟毒种制备时不再使用兔子来繁殖猪瘟病毒，且病毒繁殖时间短、收获次数多，单位细胞收获的病毒液量大的猪瘟病毒活疫苗制备方法。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种猪瘟细胞适应毒、由其制得的猪瘟病毒活疫苗及制备方法，该方法使用猪瘟病毒适应毒作为制备猪瘟弱毒疫苗用毒种，经传代细胞连续培养制备猪瘟细胞适应毒原始毒种、猪瘟细胞适应毒基础毒种、猪瘟细胞适应毒生产毒种，再通过猪瘟细胞适应毒生产毒种在传代细胞系增殖后连续收获的合格病毒液作为猪瘟弱毒疫苗用抗原，再经配苗、分装、冻干制得猪瘟细胞适应毒活疫苗。该方法在猪瘟毒种制备时不再使用兔子来繁殖猪瘟病毒，且病毒繁殖时间短、收获次数多，单位细胞收获的病毒液量大，病毒含量闻，成本低廉。
[0007]为此，本发明提供了一种猪瘟细胞适应毒，是由猪瘟兔化弱毒株经过传代细胞系连续培养后获得，并且，将其耳源静脉接种健康家兔Iml后，其体温无反应或仅出现轻热反应。
[0008]根据本发明，所述适应毒为猪瘟兔化弱毒株的猪瘟病毒细胞适应CC株(Classical Swine Fever Cell Adapted Virus strain CC),其保藏编号为:CCTCC NO:V201224，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期:2012年06月08日。
[0009]本发明中所述猪瘟病毒细胞适应CC株有以下特性:
[0010]i)在传代细胞系中的稳定性:所述细胞适应毒在传代细胞系20~40代范围增值病毒含量不小于107_°TCID5(l/ml ；
[0011]ii)兔子体温反应性:所述细胞适应毒以107_°TCID5(l/ml耳源静脉接种健康家兔Iml后，其体温无反应或仅出现轻热反应；
[0012]iii)免疫原性:所述细胞适应毒对猪的最小免疫原性≤10_7_°/ml，以I个TCID5tl免疫剂量肌肉接种猪瘟抗体阴性健康猪，免疫两周后攻Iml猪瘟石门系血毒(IO5MLD/ml) 100%保护；
[0013]iv)安全性:将所述细胞适应毒以107_°TCID5Q/ml肌肉注射仔猪或妊娠母猪IOml注射不引起发病或死亡，母猪不引起流产或死胎。
[0014]本发明进一步提供了一种根据本发明所述猪瘟细胞适应毒的制备方法，其将猪瘟兔化弱毒株接入传代细胞系连续培养至少20代，所述培养时间为24h~72h/代。
[0015]本发明还提供了一种根据本发明所述猪瘟细胞适应毒制得的猪瘟病毒活疫苗。
[0016]本发明还进一步提供了一种根据本发明所述猪瘟病毒活疫苗的制备方法，包括:
[0017]步骤A，制备弱毒疫苗用抗原；
[0018]步骤B，将制备猪瘟弱毒疫苗用抗原加入适当冻干保护剂，充分混匀后定量分装，冻干，制得猪瘟病毒活疫苗；
[0019]其中，在步骤A中，将猪瘟细胞适应毒生产毒种接入传代细胞系进行培养，连续收获细胞上清液检验合格后作为制备猪瘟弱毒疫苗用抗原。
[0020]根据本发明方法，在步骤A中，猪瘟细胞适应毒生产毒种在传代细胞系培养适应不超过I代。所述连续收获包括将猪瘟细胞适应毒生产毒种接入传代细胞，培养2~5日后收获细胞上清液，并补加维持液继续培养的循环操作，所述循环的次数为8~10次。
[0021]在本发明的一个实施方案中，还包括在步骤A之前的以下步骤:
[0022]步骤1，制备原始毒种:将猪瘟细胞适应毒接入传代细胞系进行培养，收获细胞上清液检验合格后作为猪痕细胞适应毒原始毒种；
[0023]步骤2，制备基础毒种:将猪瘟细胞适应毒原始毒种接入传代细胞系进行培养，收获细胞上清液检验合格后作为猪瘟细胞适应毒基础毒种；
[0024]步骤3，制备生产毒种:将猪瘟细胞适应毒基础毒种接入传代细胞系进行培养，收获细胞上清液检验合格后作为猪瘟细胞适应毒生产毒种。
[0025]并且，在步骤I中，猪瘟细胞适应毒在传代细胞系中的培养不超过3代。在步骤2中，猪瘟细胞适应毒原始毒种在传代细胞系中的培养不超过3代。在步骤3中，猪瘟细胞适应毒基础毒种在传代细胞系中的培养不超过3代。所述培养时间为24h~72h/代。
[0026]本发明中，所述传代细胞系为ST细胞系、PK15细胞系、STK细胞系或BT细胞系。优选所述传代细胞系为BT细胞系。具体说来，本发明在培养猪瘟细胞适应毒以及制备猪瘟细胞适应毒原始毒种、猪瘟细胞适应毒基础毒种和猪瘟细胞适应毒生产毒种过程中，采用细胞系进行传代培养，传代细胞系为ST细胞系、PK15细胞系、STK细胞系或BT细胞系。优选所述传代细胞系为BT细胞系。
[0027]本发明同时还提供了一种培养猪瘟病毒的方法，其采用传代细胞系进行传代培养，其中，所述传代细胞系为BT细胞系。
[0028]本发明中用家兔对疫苗效力进行效检。按所规定的头份用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释7500倍，耳静脉注射体重为1.5~3kg家兔2只，每只1ml。家兔接种后，上下午各测体温I次，48小时后，每隔6小时测体温I次，其体温反应标准如下:
[0029]定型热反应:潜伏期48~96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3个温次超过常温1°C以上，并稽留18~36小时。如稽留42小时以上，必须攻毒，攻毒后无反应可判为定型热反应。
[0030]轻热反应:潜伏期48~96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过常温
0.50C以上，并稽留12~36小时。
[0031]无反应:体温正常。
[0032]此外，体温反应呈二次高峰，有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+)标准者，均须攻毒。攻毒后无反应时，该兔体温反应可判为定型热反应或轻热反应。
[0033]本发明使用猪瘟病毒适应毒作为制备猪瘟弱毒疫苗用毒种，经传代细胞连续培养制备猪瘟细胞适应毒原始毒种、猪瘟细胞适应毒基础毒种、猪瘟细胞适应毒生产毒种，再通过猪瘟细胞适应毒生产毒种在传代细胞系增殖后连续收获的合格病毒液作为猪瘟弱毒疫苗用抗原，再经配苗、分装、冻干制得猪瘟细胞适应毒活疫苗，该方法在猪瘟毒种制备时不再需要使用兔子传代来制备毒种，解决了为预防猪瘟而屠杀兔子等动物福利问题并减少脾毒制备中可能携带外源因子和潜在散毒`的风险。根据本发明方法制备猪瘟病毒活疫苗，病毒繁殖时间短、收获次数多，单位细胞收获的病毒液量大，病毒含量高，并能降低疫苗生产成本。所制得的猪瘟病毒活疫苗安全性好、免疫效力高。
[0034]mmm
[0035]猪痕病毒细胞适应CC 株(Classical Swine Fever Cell Adapted Virus straincc)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称:CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2012年06 月 08 日，保藏编号:CCTCC NO:V 201224。
[0036]为获得免疫性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮鉴定合格后冻干保存并保藏。【具体实施方式】
[0037]下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
[0038]实施例
[0039]实施例1:猪瘟兔化弱毒适应细胞的筛选
[0040]1.病毒与细胞株
[0041]猪瘟兔化弱毒为P480代脾毒(中国兽医药品监察所)，BT细胞(中国兽医药品监察所)作为适应病毒用细胞系。ST细胞(ATCC, American type culture collection,美国模式培养物集存库)，PK15细胞(中国兽医药品监察所)，IBRS-2细胞(中国兽医药品监察所)，牛睾丸原代细胞(自制)，SK6细胞(ATCC)。
[0042]2.实验方法
[0043](I)猪瘟兔化弱毒在细胞中增殖试验
[0044]①牛睾丸细胞的制备方法
[0045]无菌取新生犊牛的睾丸I对，浸泡于含有1000U/ml青霉素的Hank’s液中，在无菌条件下去除包囊和睾丸囊膜，然后加入0.25wt%胰酶消化液进行消化，消化后加入含血清的培养基终止消化，然后用吸管将细胞吹散。最后细胞悬液用无菌纱布过滤，取过滤后的细胞悬液进行细胞计数，然后调整细胞密度为50万细胞/ml铺于培养瓶中，置于37°C含5%CO2的培养箱中培养。培养成单层后即为原代细胞，可用于接毒或传代。
[0046]②制备6种细胞单层细胞
[0047]细胞用含0.25Wt%或0.5Wt%EDTA(乙二胺四乙酸)的胰酶消化后，以l: 2~I: 4的比例分到新的细胞培养瓶，加入细胞生长液(含5wt%胎牛血清的MEM培养基)，在37°C含5% CO2的培养箱中培养2~3日，细胞形成单层。
[0048]③取猪瘟兔化弱毒脾毒，按0.3%~0.5% (v/v)接入已长满单层的6种细胞，在37°C含5% CO2培养箱培养48~72日直接冻存，冻融2次后分别进行第二次继代，连续继代20次。病毒每继代5代用相同的ST细胞进行病毒含量的测定，比较猪瘟病毒在不同细胞连续继代后的使用能力,确定繁殖猪瘟细胞适应毒适宜细胞系。
[0049](2)间接免疫法测定病毒含量
[0050]取待测病毒液做十倍系列稀释，接入96孔细胞培养板，然后用吸管滴入消化后的ST细胞，每孔2.0万细胞，然后将细胞培养板置于37°C培养3日，进行荧光染色判定。出现荧光的即判定该孔细胞感染，按R-M法计算TCID5tlt5
[0051]3.实验结果
[0052]猪瘟兔化弱毒在6种细胞中的增值能力测定结果见表1。
[0053]表1猪瘟兔化弱毒在不同细胞增值病毒含量的差异
[0054]
【权利要求】
1.一种猪瘟细胞适应毒，是由猪瘟兔化弱毒株经过传代细胞系连续培养后获得，并且，将其耳源静脉接种健康家兔Irnl后，其体温无反应或仅出现轻热反应。
2.根据权利要求1所述的适应毒，其特征在于:所述适应毒为猪瘟兔化弱毒株的猪瘟病毒细胞适应CC株(Classical Swine Fever Cell Adapted Virus strain CC)，其保藏编号为:CCTCC NO:V201224，保藏于中国典型培养物保藏中心。
3.一种根据权利要求1或2所述猪瘟细胞适应毒的制备方法，其特征在于:将猪瘟兔化弱毒株接入传代细胞系连续培养至少20代，所述培养时间为24h~72h/代。
4.一种根据权利要求1或2所述猪瘟细胞适应毒制得的猪瘟病毒活疫苗。
5.一种根据权利要求4所述猪瘟病毒活疫苗的制备方法，包括: 步骤A，制备弱毒疫苗用抗原； 步骤B，将制备猪瘟弱毒疫苗用抗原加入适当冻干保护剂，充分混匀后定量分装，冻干，制得猪瘟病毒活疫苗； 其特征在于:在步骤A中，将猪瘟细胞适应毒生产毒种接入传代细胞系进行培养，连续收获细胞上清液检验合格后作为制备猪瘟弱毒疫苗用抗原。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 在步骤A中，猪瘟细胞适应毒生产毒种在传代细胞系培养适应不超过I代； 所述连续收获包括将猪瘟细胞适应毒生产毒种接入传代细胞，培养2~5日后收获细胞上清液，并补加维持液继续培养的循环操作，所述循环的次数为8~10次。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:还包括在步骤A之前的以下步骤: 步骤1，制备原始毒种:将猪瘟细胞适应毒接入传代细胞系进行培养，收获细胞上清液检验合格后作为猪痕细胞适应毒原始毒种； 步骤2，制备基础毒种:将猪瘟细胞适应毒原始毒种接入传代细胞系进行培养，收获细胞上清液检验合格后作为猪瘟细胞适应毒基础毒种； 步骤3，制备生产毒种:将猪瘟细胞适应毒基础毒种接入传代细胞系进行培养，收获细胞上清液检验合格后作为猪瘟细胞适应毒生产毒种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于: 在步骤I中，猪瘟细胞适应毒在传代细胞系中的培养不超过3代； 在步骤2中，猪瘟细胞适应毒原始毒种在传代细胞系中的培养不超过3代； 在步骤3中，猪瘟细胞适应毒基础毒种在传代细胞系中的培养不超过3代； 所述培养时间为24h~72h/代。
9.根据权利要求3、5~8中任意一项所述的方法，其特征在于:所述传代细胞系为ST细胞系、PK15细胞系、STK细胞系或BT细胞系。
10.一种培养猪瘟病毒的方法，其采用传代细胞系进行传代培养，其特征在于:所述传代细胞系为BT细胞系。
【文档编号】A61K39/187GK103571797SQ201210278688
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月7日 优先权日:2012年8月7日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司