一种抗病毒中药组合物的制备方法及指纹图谱的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗病毒中药组合物的制备方法及指纹图谱的测定方法，该方法超声逆流提取法对药材进行提取，并采用超高压液相色谱法测定该中药组合物超声提取液的指纹图谱，该方法符合药物制剂质量控制的要求，可有效控制该中间体的质量。
【专利说明】一种抗病毒中药组合物的制备方法及指纹图谱的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到一种中药组合物的制备方法及指纹图谱的测定方法，属于中药制药领域。
【背景技术】
[0002]现代中药产业化过程中，提取工艺是必不可少的一个重要环节，也是中药生产区别于其他药物生产的一个显著特征。目前中药产业化提取过程中，几乎清一色采用回流提取技术(乙醇提取或水煎煮)，但该项技术有其固有缺陷，如提取用溶媒量大，生产成本高，不适合热不稳定性成分提取以及提取效率有限等。随着提取技术的不断发展，连续超声逆流提取技术无论是在生产连续性，大幅度降低生产成本，提高生产自动化程度方面均显示了巨大的优势，有望成为引领行业的提取新技术。但由于部分技术瓶颈的限制，该项技术尚未在中药产业化中大规模推广应用。本项目就是利用连续超声逆流提取技术，对本发明中药组合物的醇提工艺进行优化，解决该技术在中药提取产业化中的共性技术问题，最终实现在中药行业中的大规模推广应用。该项研究将大幅度降低中药生产企业生产成本，提高提取效率，创造良好的社会效益和经济效益。
[0003]超高效液相色谱(UPLC)是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC (高效液相色谱法)的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。
[0004]超高效液相色谱仪尤其对中药研究领域的发展是一个极大的促进。中药的组分复杂，分离困难等问题都可以通过超高效液相色谱法逐渐解决。在同样条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多。在同样条件下，UPLC的分辨率能够认出更多的色谱峰。中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。指纹图谱应该具备指纹性，即:(1)专属性强。指所制订的指纹图谱应该是该中药所独有的、能与其它中药相区别的，其反映的化学信息是具有高度的选择性的；(2)稳定性好。即中药的指纹图谱应该是从某中药的多批次中归纳出的共性，图谱中的共有峰或特征峰应相对稳定；(3)重现性好。所制订的指纹图谱在规定条件下应能再现指纹特征(如共有峰数目、大小、位置等)，其误差应在允许的范围内。只有这样，所制订的指纹图谱才具有实用价值，才可以有效控制药品的质量。采用UPLC指纹图谱方法控制药品质量具有灵敏、快速、简便、准确等特点，通过优选色谱条件测定药品制剂的指纹图谱，可以很好控制药品质量。
[0005]专利CN03143211.5公开了一种抗病毒中药组合物及制备方法，作为非典型性肺炎的治疗和预防用药，该中药组合物以清瘟解毒、宣肺泄热为原则，适当配伍芳香辟秽、益气扶正，制备这种抗病毒中药组合物有效成份的原料药包括如下重量份的:连翘、金银花、板蓝根、苦杏仁、薄荷脑、鱼腥草、大黄、广藿香、绵马贯众、红景天、麻黄、甘草、石膏。原工艺中麻黄、连翘、大黄、鱼腥草提取工艺为70%乙醇回流提取，提取液出膏率高、耗时耗能，有效成分提取率相对较低。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种抗病毒中药组合物的制备方法，该制备方法缩短了提取时间、降低了能耗，有效成分的提取率明显提高，同时，本发明人还采用了超高效液相色谱(UPLC)法对该制备工艺进行了质量控制，该中药组合物由如下重量份的原料药制成:连翘200-300、麻黄 60-100、大黄 40-60、鱼腥草 200-300、金银花 200-300、板蓝根 200-300、广藿香60-100、绵马贯众200-300、红景天60-100、薄荷脑5-9、苦杏仁60-100、甘草60-100、石膏200-300，该制备方法由以下步骤制成:
(1)按照原料药重量比例称取中药材，净选；
(2)广藿香碎断，加5-8倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残洛弃去，滤液备用；
(3)连翘、麻黄、鱼腥草、大黄采用连续超声逆流提取；
(4)金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁、煎煮2次，每次0.5-2.5小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤(2)广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60°C时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；
(5)将步骤(4)所得清膏与步骤(3)所得的连续超声逆流提取液，浓缩至在60°C时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，备用；
(6)步骤(5)所得干膏粉`、步骤(2)所得挥发油与薄荷脑共同构成该中药组合物的活性成分；
其中所述步骤(3)的连续超声逆流提取的提取溶媒为50%-85%乙醇，提取时间30-120分钟，超声波频率20-50 kHz ο
[0008]该制备方法中连续超声逆流提取的参数优选为:提取溶媒为70%乙醇，提取时间60分钟，超声波频率27kHz。
[0009]该制备方法中连续超声逆流提取的参数还优选为:提取溶媒为85%乙醇，提取时间30分钟，超声波频率50kHz。
[0010]该制备方法中连续超声逆流提取的参数还优选为:提取溶媒为50%乙醇，提取时间120分钟，超声波频率20kHz。
[0011]该制备方法中所述中药组合物的重量比例优选为:
连翘200、金银花300、板蓝根200、大黄60、广藿香60、绵马贯众300、红景天60、薄荷脑9、麻黄60、苦杏仁100、鱼腥草200、甘草100、石膏200。
[0012]该制备方法中所述中药组合物的重量比例还优选为:
连翘300、金银花200、板蓝根300、大黄60、广藿香100、绵马贯众200、红景天60、薄荷脑5、麻黄100、苦杏仁60、鱼渥草300、甘草60、石骨300。
[0013]该制备方法中所述中药组合物的重量比例:
连翘278、金银花294、板蓝根285、大黄55、广藿香95、绵马贯众290、红景天87、薄荷脑8.5、麻黄88、苦杏仁80、鱼腥草284、甘草95、石膏277 ;该制备方法中所述中药组合物的重量比例还优选为:
连翘255、金银花255、板蓝根255、大黄51、广藿香85、绵马贯众255、红景天85、薄荷脑7.5、麻黄85、苦杏仁85、鱼渥草255、甘草85、石骨255。
[0014]本发明的另一个目的是提供上述该中药组合物的制备方法中步骤(3)连续超声逆流提取液的指纹图谱测定方法，色谱条件及测定方法如下:色谱条件:色谱柱为C18柱，柱流速0.2-0.8 ml.min-1，检测波长225-232nm，流动相B为乙腈，A为0.1%磷酸；梯度洗脱:O ~4min，14% ~14%B，4 ~7min，14% ~35%B，7 ~9.5min，35% ~70%B，9.5 ~12min，70% ~75%B, 12~12.5min, 75%~14%B，12.5~14.5min, 14%B ;供试品溶液的制备:取超声逆流提取液，用0.22 ym滤膜过滤，即得；测定法:精密吸取供试品溶液0.1-1.5μ1，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
[0015]指纹图谱测定方法优选为:色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mmX 100mm, 1.7 μ m);检测波长:228nm ；;流速为0.4 ml.mirT1 ;供试品溶液的制备:取超声逆流提取液，用0.22 ym滤膜过滤，即得；测定法:精密吸取供试品溶液0.4μ1，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
[0016]一、连续超声逆流提取工艺考察 I 试验条件:
1.1仪器设备
1.1.1连续超声逆流提取成套设备:型号:⑶C-TQ/3/C2N1 (济宁金百特工程机械有限公司)
工作原理:连续超声逆流提取技术是基于高效的连续逆流浸出原理并叠加超声强化提取原理，在连续逆流提取设备基础上增加了独特设计的超声波强化提取装置。动态逆流提取技术，药材与溶剂在浸出容器中沿相反方向运动，连续而充分地进行接触提取，尽量在提取过程中创造有效的浓度差，从而增加提取效率。此外，超声提取技术是利用超声波在提取介质中产生空化效应和多级效应，使细胞壁破壁，从而大大提高药物有效成分的溶出扩散过程，因此也大大提高了提取效率。
[0017]分析仪器:Agilent 1100高效液相色谱仪，METTLER TOLEDO AG135型电子天平。
[0018]试剂与对照品连翘苷(批号:110821-201112)，连翘酯苷A(批号:111810_201001)，大黄素(批号:110756-200110)，大黄酚(批号:110796_201017)，大黄素甲醚对照品(批号:110758-201013)均购于中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；其它试剂均为分析纯。
[0019]药材麻黄、连翘、大黄、鱼腥草药材购于安徽井泉集团中药饮片有限公司，经石家庄以岭药业股份有限公司质检科检验，均符合《中国药典》2010版(一部)有关项下规定。
[0020]评价指标测定方法
2.1 出膏率测定:取不同提取工艺下制备的醇提液，回收乙醇经减压浓缩，干燥，得干膏，称重，计算出膏率。
[0021]有效成分含量测定方法
2.2.1连翘酯苷A含量测定方法按《中国药典》2010版一部收载的高效液相色谱法测定，色谱柱:Waters Symmetry C18 5 μ m 4.6*250mm,流动相:乙臆-0.4% 冰乙酸(15:85)，检测波长:330 nm，流速:1 mL.mirT1，柱温:25°C，进样量:10 μ L，理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000。
[0022]连翘苷含量测定方法按《中国药典》2010版一部收载的高效液相色谱法测定，色谱柱:Waters Symmetry C18 5 μ m 4.6*250mm,流动相:乙腈-水(25:75),检测波长:277nm,流速:1 mL.mirT1,柱温:25°C,进样量:10 μ L,理论板数按连翅苷峰计算应不低于3000。
[0023]大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量测定方法按《中国药典》2010版一部收载的高效液相色谱法测定，色谱柱:资生堂C18 5ym 4.6*250mm，流动相:甲醇-0.1%磷酸溶(85:15)，检测波长为254nm,流速:1 mL.mirT1，柱温:25°C,进样量:10 μ L，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。
[0024]超声逆流提取工艺参数考察
[0026]3.1连续超声逆流提取溶媒考察
按处方比例称取麻黄、连翘、大黄、鱼腥草，五份，分别用50%、60%、70%、80%、85%乙醇进行超声逆流提取，提取时间分别设定60min，收集提取液，回收乙醇，减压真空浓缩，干燥，得干膏，称重，计算出膏率。测定不同样品中连翘酯苷A、连翘苷、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。
[0025]表1提取溶媒考`察结果
【权利要求】
1.一种抗病毒中药组合物的制备方法，该中药组合物由如下重量份的原料药制成:连翘200-300、麻黄60-100、大黄40-60、鱼腥草200-300、金银花200-300、板蓝根200-300、广藿香60-100、绵马贯众200-300、红景天60-100、薄荷脑5-9、苦杏仁60-100、甘草60-100、石膏200-300，该制备方法由以下步骤制成: (1)按照原料药重量比例称取中药材，净选； (2)广藿香碎断，加5-8倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残洛弃去，滤液备用； (3)连翘、麻黄、鱼腥草、大黄采用连续超声逆流提取，得连续超声逆流提取液； (4)金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁、煎煮2次，每次0.5-2.5小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤(2)广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60°C时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用； (5)将步骤(4)所得清膏与步骤(3)所得的连续超声逆流提取液，浓缩至在60°C时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，备用； (6)步骤(5)所得干膏粉、步骤(2)所得挥发油与薄荷脑共同构成该中药组合物的活性成分； 其特征在于:所述步骤(3)的连续超声逆流提取的提取溶媒为50%-85%乙醇，提取时间30-120分钟，超声波频率20-50 kHz ο
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述连续超声逆流提取的提取溶媒为70%乙醇，提取时间60分钟，超声波频率27kHz。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述连续超声逆流提取的提取溶媒为85%乙醇，提取时间30分钟，超声波频率50kHz。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述连续超声逆流提取的提取溶媒为50%乙醇，提取时间120分钟，超声波频率20kHz。
5.如权利要求1-4中任一所述的制备方法，其特征在于所述中药组合物制剂是由如下重量份的原料药制成: 连翘200、金银花300、板蓝根200、大黄60、广藿香60、绵马贯众300、红景天60、薄荷脑9、麻黄60、苦杏仁100、鱼腥草200、甘草100、石膏200。
6.如权利要求1-4中任一所述的制备方法，其特征在于所述中药组合物制剂由下列重量份的原料药制成: 连翘300、金银花200、板蓝根300、大黄60、广藿香100、绵马贯众200、红景天60、薄荷脑5、麻黄100、苦杏仁60、鱼渥草300、甘草60、石骨300。
7.如权利要求1-4中任一所述的制备方法，其特征在于所述中药组合物制剂由下列重量份的原料药制成: 连翘278、金银花294、板蓝根285、大黄55、广藿香95、绵马贯众290、红景天87、薄荷脑8.5、麻黄88、苦杏仁80、鱼腥草284、甘草95、石膏277。
8.如权利要求1-4中任一所述的制备方法，其特征在于所述中药组合物制剂由下列重量份的原料药制成: 连翘255、金银花255、板蓝根255、大黄51、广藿香85、绵马贯众255、红景天85、薄荷脑7.5、麻黄85、苦杏仁85、鱼渥草255、甘草85、石骨255。
9.如权利要求1-4中任一所述制备方法中步骤(3)所得连续超声逆流提取液的指纹图谱测定方法，其特征在于:色谱条件及测定方法如下: 色谱条件:色谱柱为C18柱，柱流速0.2-0.8 ml.min—1，检测波长225_232nm，流动相B为乙腈，A为0.1%磷酸；梯度洗脱:0~4min，14%~14%B ；4~7min，14%~35%B ；7 ~9.5min, 35% ~70%Β ;9.5 ~12min,70% ~75%B ； 12 ~12.5min, 75% ~14%B ； 12.5 ~14.5min,14%B ； 供试品溶液的制备:取权利要求1-4中任一所述制备方法中的步骤(3)中超声逆流提取液，用0.22 μ m滤膜过滤，即得； 测定法:精密吸取供试品溶液0.1-1.5 μ 1，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
10.如权利要求9所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述色谱柱为ACQUITYUPLC BEH C18 色谱柱，色谱柱规格:2.1mmX100mm，1.74 μm;检测波长:228nm;流速为0.4ml.min-1 ； 供试品溶液的制备:取上述制备方法中步骤(3)中超声逆流提取液，用0.22 ym滤膜过滤，即得； 测定法:精密吸取供试品溶液0.4μ 1，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
【文档编号】A61K33/06GK103800523SQ201210450660
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月13日 优先权日:2012年11月13日
【发明者】刘敏彦, 李正杰, 张永锋, 许红辉, 粘立军, 武景路 申请人:河北以岭医药研究院有限公司