专利名称：一种高纯度云芝糖肽的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及兽用或人用药品生产技术领域，特别涉及一种高纯度云芝糖肽的制备方法及制药用途。
背景技术：
细菌及病毒性传染病是危害畜牧业生产的大敌，随着畜牧业日趋集约化，传染病的预防显得更加重要。对于病毒性疾病，如何选择合适的药物治疗一直是令养殖者头疼的问题，同时病毒性疾病的药物治疗又很难奏效，必须进行免疫接种加以预防。但在生产过程中，动物的免疫失败现象又经常发生，如疫苗运输、保存不当、免疫程序不合理、接种方法有误、剂量不准如接种剂量过多或过少等，导致动物免疫失败，暴发传染性疾病。目前，畜禽养殖业中广泛应用的疫(菌)苗佐剂如铝胶盐水、油佐剂等，由于这些产品在活性、粘滞性、稳 定性等方面存在着一定缺陷，使得某些疫(菌)苗存在着保护率低、免疫预防效果不佳等问题。因此，为提高畜禽疫(菌)苗的免疫保护力，延长免疫持续期，适应纯化疫苗、亚单位疫苗及合成肽疫苗的发展，研制开发可生物代谢、无毒害、活性强的免疫调节剂或增强剂作为疫(菌)苗佐剂已成为迫切需要解决的问题和当前佐剂研究的一个重要方向。免疫增强剂能提高动物自身免疫力，解除动物免疫抑制，增强动物对细菌和病毒性传染病的抵抗力。因此免疫增强剂在动物生产中的研究与应用日益引起国内外学者的高度重视。免疫增强剂也称免疫佐剂，是通过不同的作用方式，如增强巨噬细胞活性，增强抗原物质的免疫原性和稳定性，促进抗体的合成与分泌等，从而增强动物机体非特异性和特异性免疫的物质。随着科学技术的进步及兽医学技术的提高，选择一种特征确定、高效、稳定、毒副作用小的理想免疫增强剂将是未来抗御疾病的主要途径和手段。目前，已研究的免疫增强剂种类非常多，根据其来源，可以分为产物和化学合成物两大类，进一步可细分为生理活性产物、微生物来源物质、合成化学物、中草药等。属于微生物及其组分的有结核杆菌、双歧杆菌以及酵母多糖、细菌脂多糖、分支杆菌细胞壁及其亚单位胞壁酰二肽等；属于生理活性产物的有胸腺因子、细胞因子、转移因子等；属于化学合成的有左旋咪唑、多聚核苷酸、表面活性分子及人工合成的多种酯类；属于中草药的如黄芪、刺五加等以及中草药提取物如多糖、生物碱、有机酸和多种甙类物质，如黄芪多糖、小檗碱、人参皂甙等。目前的国内外文献中，关于云芝糖肽的研究很多，对于云芝糖肽的提取和应用也有许多报道，但却缺少一种高纯度云芝糖肽的提取纯化工艺，也没有将其作为畜禽疫苗免疫增强剂的报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目在于通过对云芝糖肽的提取纯化工艺和体内外活性进行研究，提供一种高纯度云芝糖肽的制备方法及制药用途。本发明的目的是这样实现的
一种高纯度云芝糖肽的制备方法，包括如下步骤(I)取云芝糖肽粗粉，按料水比I :35-60加入5-8% (w/v) NaHCO3溶液，加热至70-720C，保温浸提I. 5-2. 5h，5000-6000rpm离心，取上清液，80°C以下加热浓缩8_10倍，再加入5-7倍体积的无水乙醇，在1-5°C的环境下静置18-36h后，4000-5000rpm离心，弃上清液，沉淀先后用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤1-3次，烘干得云芝糖肽半成品；(2)取云芝糖肽半成品，加双蒸水溶解，再加入O. 2-0. 3倍体积的有机溶剂，所述的有机溶剂为体积比=5 1的氯仿和正丁醇，剧烈振荡混勻15-30min,4000-5000rpm离心，取上清液，重复2次，合并上清液装入O. 20-0. 30 μ m透析膜内，流水透析36_60h，蒸馏水透析18-30h，60°C以下加热浓缩后，加入3-5倍体积的无水乙醇充分振荡于1-5°C的环境下静置18-36h后，弃上清，沉淀先后以无水乙醇、丙酮洗涤，烘干得云芝糖肽成品。优选地，所述高纯度云芝糖肽的制备方法，其中步骤(I)为取云芝糖肽粗粉， 按料水比I =45-50加入6% (w/v) NaHCO3溶液，加热至70-72 °C，保温浸提I. 5-2. 5h，5000-6000rpm离心，取上清液，80°C以下加热浓缩9倍，再加入6倍体积的无水乙醇，在1-3°C的环境下静置18-36h后，4000-5000rpm离心，弃上清液，沉淀先后用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤2次，烘干得云芝糖肽半成品。优选地，所述高纯度云芝糖肽的制备方法，其中步骤(2)为取云芝糖肽半成品，加双蒸水溶解，再加入O. 2-0. 3倍体积的有机溶剂，所述的有机溶剂为体积比=5 1的氯仿和正丁醇，剧烈振荡混匀15-30min，4000-5000rpm离心，取上清液，重复2次，合并上清液装入O. 22 μ m透析膜内，流水透析40-48h，蒸馏水透析18_30h，60°C以下加热浓缩后，加入4倍体积的无水乙醇充分振荡于1_3°C的环境下静置24-30h后，弃上清，沉淀先后以无水乙醇、丙酮分别洗涤2次，烘干得云芝糖肽成品。通过体外试验研究，本发明制备的云芝糖肽能够提高鸡的抗体水平，从而可提高鸡群的免疫力。因此，本发明第二个目的在于提供上述方法制备的云芝糖肽在制备具有免疫或/和生理调节活性的药品中的应用。优选地，所述的药品为兽药、人用药品。进一步优选地，所述的兽药为畜禽疫苗免疫增强剂。与现有技术相比，本发明涉及的高纯度云芝糖肽制备方法具有如下优点和显著进
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少(I)多糖和蛋白含量高。实施例1-3制备出的云芝糖肽经检测，其多糖含量达到61%以上，蛋白含量达到9. 7%以上。相比云芝糖肽粗粉，多糖含量和蛋白含量显著提高(见表 1-3)。(2)云芝糖肽可提高鸡群的免疫力。由实施例4的表4可见，对于免疫鸡，不同处理对鸡的发病率则有一定改善作用，对照组鸡发病率为27. 2%，而云芝糖肽饮水处理组鸡的发病率为4. 5%，降低了 22. 7%。这说明云芝糖肽能够提高鸡的抗体水平，从而提高鸡的免疫水平，减少发病率。而且，对于发病后鸡的死亡率，云芝糖肽达到了较为显著的改善作用。
具体实施例方式以下是本发明的具体制备例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。实施例I云芝糖肽的提取纯化取云芝糖肽粗粉lkg，按料水比I :48加入6%(w/v)NaHC0jK溶液，加热至70_72°C，保温浸提2h，5500rpm离心，取上清液，加热至75°C保温浓缩9倍，再加入6倍体积的无水乙醇，在1_3°C的环境下静置24h后，4500rpm离心，弃上清液，沉淀先后用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗漆2次(4000rpm, 5min),烘干得492. 5g云芝糖肽半成品。取500g云芝糖肽半成品，加双蒸水溶解，再加入O. 25倍体积的有机溶剂，所述的有机溶剂为体积比=5 1的氯仿和正丁醇，剧烈振荡混勻20min,4500rpm离心IOmin,取上清液，重复2次，合并上清液装入O. 22 μ m透析膜内，流水透析45h，蒸馏水透析24h，加热至58°C浓缩后，加入4倍体积的无水乙醇充分振荡于1_3°C的环境下静置24h后，弃上清，沉淀先后以无水乙醇、丙酮分别洗漆2次(4000rpm, 5min),烘干得141. 3g云芝糖肽成品。
通过对样品的多糖和蛋白含量检测发现，经过纯化可以使得云芝糖肽的多糖含量提高43. 07%，蛋白含量提高6. 10% (见表I)。表I云芝糖肽提取过程中多糖和蛋白的含量变化
权利要求
1.一种高纯度云芝糖肽的制备方法，包括如下步骤 (1)取云芝糖肽粗粉，按料水比I:35-60加入5-8%(WZV)NaHCO3溶液，加热至70_72°C，保温浸提I. 5-2. 5h,5000-6000rpm离心，取上清液，80°C以下加热浓缩8-10倍，再加入5-7倍体积的无水乙醇，在1_5°C的环境下静置18-36h后，4000-5000rpm离心，弃上清液，沉淀先后用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤1-3次，烘干得云芝糖肽半成品； (2)取云芝糖肽半成品，加双蒸水溶解，再加入O.2-0. 3倍体积的有机溶剂，所述的有机溶剂为体积比=5 1的氯仿和正丁醇，剧烈振荡混勻15-30min,4000-5000rpm离心,取上清液，重复2次，合并上清液装入O. 20-0. 30 μ m透析膜内，流水透析36_60h，蒸馏水透析18-30h，60°C以下加热浓缩后，加入3-5倍体积的无水乙醇充分振荡于1_5°C的环境下静置18-36h后，弃上清，沉淀先后以无水乙醇、丙酮洗涤，烘干得云芝糖肽成品。
2.根据权利要求I所述高纯度云芝糖肽的制备方法，其特征在于步骤(I)为取云芝糖肽粗粉，按料水比I :45-50加入6%(w/v)NaHC03溶液，加热至70_72°C，保温浸提I. 5-2. 5h，5000-6000rpm离心，取上清液，80°C以下加热浓缩9倍，再加入6倍体积的无水乙醇，在1-3°C的环境下静置18-36h后，4000-5000rpm离心，弃上清液，沉淀先后用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤2次，烘干得云芝糖肽半成品。
3.根据权利要求I所述高纯度云芝糖肽的制备方法，其特征在于步骤(2)为取云芝糖肽半成品，加双蒸水溶解，再加入O. 2-0. 3倍体积的有机溶剂，所述的有机溶剂为体积比=5 1的氯仿和正丁醇，剧烈振荡混勻15-30min,4000-5000rpm离心,取上清液,重复2次，合并上清液装入O. 22 μ m透析膜内，流水透析40_48h,蒸懼水透析18_30h, 60°C以下加热浓缩后，加入4倍体积的无水乙醇充分振荡于1_3°C的环境下静置24-30h后，弃上清，沉淀先后以无水乙醇、丙酮分别洗涤2次，烘干得云芝糖肽成品。
4.根据权利要求1-3任一项的方法制备的云芝糖肽在制备具有免疫或/和生理调节活性的药品中的应用。
5.根据权利要求4的应用，其特征在于所述的药品为兽药、人用药品。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于所述的兽药为畜禽疫苗免疫增强剂。
全文摘要
本发明涉及一种高纯度云芝糖肽的制备方法及应用。该方法通过对云芝糖肽粗粉进行提取纯化，获得了多糖和蛋白含量较高的云芝糖肽。本发明制备的云芝糖肽能够提高鸡的抗体水平，从而可提高鸡群的免疫力，可用于制备具有免疫或/和生理调节活性的人药或兽药，尤其可以作为畜禽疫苗免疫增强剂。
文档编号A61K39/39GK102942614SQ20121047888
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者任丽, 孟怀旺 申请人:重庆优宝生物技术有限公司