专利名称：表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因vp243的dna疫苗及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA疫苗及其构建方法和应用，特别涉及一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)主要侵害雏鸡法氏囊等中枢免疫器官，导致以淋巴细胞衰竭为特征的免疫抑制性疾病。IBDV是双链、双节段RNA病毒，属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，其基因组由A、B两个节段组成，B节段(约2. 8kb)编码VPl蛋白，为RNA依赖的RNA聚合酶。A节段(约3. 3kb)具有两个相互部分重叠的开放阅读框(ORF)，ORFl编码分子量约为IlOkDa的前体融合蛋白(VP243)，前体融合蛋白经过加工，成熟后变为VP2、VP3和VP4。0RF2编码VP5蛋白，也称非结构蛋白。目前，预防IBD主要使用弱毒苗和灭活苗，随着IBDV变异株和超强毒株的出现，经常导致免疫失败。重组亚单位疫苗和活载体疫苗表达的VP2蛋白虽然能在不同程度上诱导中和抗体，但仍未能解决IBDV抗原变异问题。DNA疫苗的出现，开拓了 IBD疫苗研究的新纪元。DNA疫苗能同时诱导体液免疫和细胞免疫，对不同血清亚型毒株具有交叉保护，还具有嵌合免疫、多重免疫及联合免疫等优点。本研究首次将IBDV多聚蛋白基因VP243进行了密码子优化，克隆入真核表达载体pCAGGS中，构建了 IBDV DNA疫苗pCAGoptiVP243，并对其免疫原性进行了研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗及其构建方法和应用。为了达到以上目的，本发明采用的技术手段为
本发明的一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中含有SEQ ID NO. I所示的序列。在本发明中，优选的，所述的DNA疫苗是通过将SEQ ID NO. I所示的序列克隆入pCAGGS表达载体中得到的。进一步的，本发明还提供了一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤(I)根据鸡偏嗜密码子将IBDV VP243基因进行密码子优化，优化后的IBDVVP243基因的序列如SEQ ID NO. I所示，在优化后的基因两端分别设计酶切位点，合成基因；(2)将合成的基因克隆到PUC19载体中，构建得到pUC19-optiVP243重组质粒；(3)将pUC19_optiVP243重组质粒进行酶切，获得optiVP243基因；(4)将optiVP243基因克隆到用同样酶酶切后的pCAGGS表达载体中，构建得到pCAGoptiVP243重组表达质粒，即为所述的DNA疫苗。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(I)中所述的酶切位点为EcoRI、ClaI。
在本发明中，更优选的，所述的构建方法还包括对所述重组表达质粒 pCAGoptiVP243进行提取纯化。
更进一步的，本发明还提供了所述的DNA疫苗在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
与传统疫苗相比，本发明的DNA疫苗既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重组疫苗才有的同时诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。
图I为重组质粒pCAGoptiVP243 PCR和酶切鉴定；
M:DLlkb Marker; I :pCAGoptiVP243 PCR鉴定；2:pCAGoptiVP243 EcoRl/Clal 双酶切结果
图2为质粒转染DF-I细胞48h后间接免疫荧光检测；A:重组质粒pCAGoptiVP243转染孔；B:空载体pCAGGS转染孔；C:正常细胞对照
图3为质粒转染DF-I细胞48h后Western blot检测；
I:重组质粒pCAGoptiVP243转染孔；2:空载体pCAGGS转染孑L ;M:Proteinmolecular marker
图4为IBDV DNA疫苗pCAGoptiVP243免疫后鸡体内抗体滴度检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。
实施列I表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗的构建及表达
I材料和方法
I. I病毒株和细胞
IBDV-HLJ0504株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组分离鉴定并保存；PCAGGS载体和DF-I细胞由本实验室保存，可通过商业途径购买得到。
I. 2仪器与试剂
质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自omega公司；限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Fermentas公司；Endofree质粒大提试剂盒购自Qiagen公司；紫外分光光度计购自 GE公司；大肠杆菌感受态ToplOF’由本实验室保存；Lipofectamine 2000转染试剂购自 invitrogen ；IBDV VP2单克隆抗体由本实验室保存；RIPA裂解液购自碧云天公司。
I. 3重组表达质粒pCAGoptiVP243的构建
根据鸡偏嗜密码子将IBDV VP243基因进行密码子优化，优化后的IBDV VP243 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，基因两端设计有EcoRI和ClaI酶切位点，设计完成后送金斯特公司合成并克隆入PUC19载体中，得到pUC19-optiVP243重组质粒，将 pUC19-optiVP243重组质粒进行EcoRI/Clal双酶切，获得optiVP243基因并亚克隆至同样用EcoRI/Clal双酶切后的pCAGGS表达载体中。对重组表达质粒pCAGoptiVP243进行双酶切鉴定，并进行测序，确定基因序列及读码框的准确性。
I. 4重组质粒的提取纯化
使用Endofree质粒大提试剂盒对重组表达质粒pCAGoptiVP243进行提取纯化,按使用说明进行。
I. 5体外转染DF-I细胞
将DF-I细胞饲养于六孔板内，所用培养液是含10%PAA胎牛血清的DMEM。待细胞生长至60-80%时，吸去培养液，用无双抗的Hank’ s液将细胞洗三次，再用少量的opti-MEM(Invitrogen)将待转染孔细胞洗一次，然后每孔加入I. 5ml opti-MEM,于 37°C CO2培养箱孵育Ih ;将4 μ I重组质粒pCAGoptiVP243 (质粒浓度为I μ g/ μ I)稀释于 246 μ Iopti-MEM 中；同时，取 10 μ I Lipofectamine 2000 稀释于 240μ1 opti-MEM 中，轻微混勻，室温孵育5min ;将稀释的质粒和Lipofectamine 2000在一个EP管中轻微混勻，室温孵育20min ;将质粒和Lipofectamine 2000混合液滴加于刚才处理过的DF-I细胞单层上， 置37°C CO2培养箱孵育；IOh后，吸去培养液，用含双抗的Hank’s液将细胞洗二次，每孔细胞加入2ml DMEM(含10%PAA胎牛血清和100U/ml双抗)置37°C CO2培养箱继续培养。48h 后收获细胞，进行western blot和间接免疫突光试验。同时设立pCAGGS空载体转染孔和正常细胞孔两个阴性对照。
2 结果2. I 重组质粒 pCAGoptiVP243 的构建
PCR及双酶切鉴定均显示重组表达质粒pCAGoptiVP243构建正确(图1)，测序结果表明目的片段及读码框均正确。
2. 2重组质粒pCAGoptiVP243在DF-1细胞中的瞬时表达
重组质粒pCAGoptiVP243在转染DF-I细胞后，经间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下可见特异的的荧光，两种阴性对照均未见特异的荧光(图2)。收集转染后48h的DF-I 细胞，用VP2单抗进行western blot分析,结果pCAGoptiVP243质粒转染孔可检测出分子量约为48kDa的pVP2蛋白，阴性对照孔未检测到特异性条带(图3)。
实施例2本发明的DNA疫苗的免疫试验
I、材料和方法
I. I 试剂
IBDV抗体检测试剂盒购自IDEXX公司。
1.2SPF 鸡
SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，14日龄SPF鸡实验期间饲养于禽病感染实验室的负压隔离器中。
I. 3 方法
将14日龄SPF鸡随机分为4组，第I组和第2组各10只，分别注射pCAGoptiVP243 和pCAGGS，100 μ g/只，腿部肌肉两点注射，首次免疫后14日采用相同剂量和途径加强免疫。第3组(CC)和第4组(NC)各5只鸡，不免疫。二免后14天，第1，2，3组分别攻毒IBDV 强毒HLJ0504株，IO3ELD50/只，攻毒后观察并记录各组鸡死亡情况，第4组作为正常对照组， 不攻毒。攻毒后7天，将各组鸡剖检，采集法氏囊，称重，统计各组鸡囊重比(F/B=(法氏囊重/体重)X 1000)，并制备病理切片，观察法氏囊病理变化，分析法氏囊组织学病变分值 (HBLS)0根据法氏囊病理组织学变化的不同程度，HBLS分为5个分值1，没有任何病变；2，散在的或部分滤泡病变；3，小于或等于50%的滤泡发生病变；4，50%-75%的滤泡发生病变； 5，75%-100%的滤泡发生病变。保护标准为攻毒后7天，感染鸡正常存活，攻毒组F/B彡正常对照组F/B-2X正常对照组S. D.，HLBS ( I。
2.结果
免疫后IBDV抗体滴度检测及攻毒保护试验
IBDV DNA疫苗pCAGoptiVP243以IOOyg剂量免疫14日龄SPF鸡，首免后I周， 抗体滴度均为阴性，首免后2周IBDV抗体开始转阳，平均抗体滴度达620 ;二免后抗体滴度迅速升高，到二免后2周，平均抗体滴度可达2800 (图4)。试验期间，pCAGGS免疫组和对照组IBDV抗体均为阴性。二免后2周，对各组鸡攻毒IBDV强毒HLJ0504，攻毒后，未免疫攻毒组(CC) 5只鸡全部死亡，pCAGGS免疫组10只鸡死亡8只，pCAGoptiP243免疫组和正常对照组(NC)全部存活。根据囊重比(F/B)和法氏囊组织学病变分值(HBLS)的判定标准， pCAGoptiVP243免疫组保护率为80%，pCAGGS和未免疫组保护率均为0% (表I)。
表I 二免后2周各组鸡攻毒保护试验
权利要求
1.一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中含有SEQ ID NO. I所示的序列。
2.如权利要求I所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗是通过将SEQIDNO. I所示的序列克隆入pCAGGS表达载体中得到的。
3.—种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤 (1)根据鸡偏嗜密码子将IBDVVP243基因进行密码子优化，优化后的IBDVVP243基因的序列如SEQ ID NO. I所示，在优化后的基因两端分别设计酶切位点，合成基因； (2)将合成的基因克隆到pUC19载体中，构建得到pUC19-optiVP243重组质粒； (3)将pUC19-optiVP243重组质粒进行酶切，获得optiVP243基因； (4 )将optiVP243基因克隆到用同样酶酶切后的pCAGGS表达载体中，构建得到pCAGoptiVP243重组表达质粒，即为所述的DNA疫苗。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤(I)中所述的酶切位点为EcoRI、ClaI0
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于还包括对所述重组表达质粒pCAGoptiVP243进行提取纯化。
6.权利要求I或2所述的DNA疫苗在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明将传染性法氏囊病病毒强毒株(HLJ0504)的多聚蛋白基因(VP243)进行鸡偏嗜密码子优化，并克隆入真核表达载体pCAGGS，构建了重组表达质粒pCAGoptiVP243。将制备的pCAGoptiVP243以100μg的剂量经腿肌两点注射首免14日龄SPF鸡，28日龄以相同剂量和途径二免，二免后14天攻击IBDV强毒HLJ0504株。结果表明，该DNA疫苗可以诱导较高水平的抗体并能提供对强毒的免疫保护。
文档编号A61K48/00GK102973952SQ20121049538
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者王笑梅, 高宏雷, 高玉龙, 祁小乐, 秦立廷, 王永强 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所