专利名称：用于治骨质疏松症和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。
背景技术：
老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织(WHO)的标准，美国国家健康和营养调查(NHANES III，1988 1994年)结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的7. 1%。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050年将增加到2. 21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者 对1995 1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。肥胖与骨量关系临床观察表明，肥胖与骨密度(BMD)提高有夫。肥胖是骨量的保护因素，超重和肥胖的妇女绝经后较同龄非超重妇女骨量高且骨丢失较慢。体重下降是绝经早期骨丢失的危险因素，提高体重指数可减缓绝经后骨丢失。但肥胖也常常引发高血糖、高血压、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎，是很多疾病的诱因之一。
发明内容
本发明既要降低肥胖者的体重，使之远离高血糖、高血压、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎等风险；同时又增加其骨量，避免骨质疏松的发生，而提供的一种用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。本发明用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。本发明上述用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列如SEQID NO 1 所示。本发明OGP-rhL印tin融合蛋白采用人为改造的L印tin和成骨生长肽基因编码翻译而成。具有降低使用者体重，并防治骨质疏松的效果。本发明用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhL印tin融合蛋白微生物制剂，不产生拮抗反应，使用安全。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列如SEQID NO 1所示，该核酸序列由生物工程公司合成，制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC(0GP/0bese，)。将pUC (0GP/0bese’)载体用BamH I和EcoR I双酶切出来(酶切反应体系如表I所示，酶切反应在37°C条件下反应10h，然后1. 5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNAGEL EXTRACTION KIT纯化回收)，并用BamHI和EcoR I双酶切pGEX_6P_l (酶切反应体系如表2所示，酶切反应在37°C条件下反应10h，然后0. 6%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNAGEL EXTRACTION KIT纯化回收)；再将本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhL印tin融合蛋白的DAN片段(0GP/0bese’)与经过双酶切的载体pGEX_6P_l的连接(连接反应体系 如表3所示)。表I
pUC (OGP/Obese，)20 ^il
IOXM buffer6[il
「 nBamHX3u,l___
EcoR I3(j,l
不含 DNA 酶的 ddH2028(^1表2
载体 pGEX-6P-l20(.1l
10XM buffer6 pi
BamUl3}il_；_
KcoR I3‘ul
不含DNA酶的ddH2028^1表3
双酶切的载体pGEX-6P-l3 ^il
融合蛋白的DNA片段\3^\~10 X T4 DNA 连接酶 buffer20 T4 DNA连接酶20
融合蛋白的DAN片段与载体pGEX-6P-l 16°C放置连接过夜，得到载体pGEX_0GP/Obese’ ；然后将载体pGEX-OGP/Obese’转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，选择阳性重组子命名为大肠杆菌 BL21 (DE3-0GP/0bese，)。载体pGEX-6P-l上不含有Kpn I酶切位点，本实施方式合成的pGEX-OGP/Obese’均能为Kpn I单酶切开,说明本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白基因成功导入质粒PGEX-6P-1中。随机挑取大肠杆菌BL21 (DE3-0GP/0bese> )菌落37°C过夜培养，提取质DNA，用Kpn I进行单酶切，并用相应的空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司进行，大肠杆菌BL21 (DE3-0GP/0beSe’)内含有SEQ ID NO 1 所示 DNA。将大肠杆菌BL21 (DE3-0GP/0bese，)置于LB培养基30°C环境条件下培养18h，然后采用GST标签融合蛋白法进行蛋白的分离纯化，本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白的表达量为38. 7%。本实施方式融合蛋白(OGP-rhLeptin融合蛋白)治疗骨质疏松实验取雌性SD大鼠在无菌条件下摘除双侧卵巢，12周后取存活健康大鼠40只，随机分为5组(阳性对照组1、阳性对照组2、融合蛋白实验组和阴性对照组)，每组8只。另取雌性SD大鼠切除双侧一小块脂肪，12周后随机取存活健康大鼠8只作为假手术对照组。共计6组，分别口服以下药物假手术对照组质量浓度为0. 5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；阴性对照组质量浓度为0. 5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；融合蛋白实验组质量浓度为0. 5%的OGP-rhLeptin融合蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；(获得的用于治疗骨质疏松和血栓的OGP-rhLeptin融合蛋白用无菌水溶解)阳性对照组1:阿仑膦酸钠(Alen) 5mg/kg ；阳性对照组2 :质量浓度为0. 5%的OGP蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg。阳性对照组3 :质量浓度为0. 5%的rhL印tin溶液，灌胃剂量为5ml/kg。连续给药三个月，处死后取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压20kV。观察骨质疏松治疗对比实验结果，实验结果见表4，结果表明融合蛋白实验组、阳性对照组I和阳性对照组2都具有治疗骨质疏松的作用，且融合蛋白实验组的效果最好。表4骨小梁宽度的比较和骨面积(X土SD)
权利要求
1.用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白，其特征在于用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.编码权利要求1用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸，其特征在于该核酸的序列如SEQ ID N0:1所示。
全文摘要
用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸，它涉及一种融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和肥胖药品的缺陷。用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。该融合蛋白核酸的序列如SEQ ID NO1所示。本发明可用于医药领域。
文档编号A61P19/10GK103012598SQ201210585618
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者余琼 申请人:黑龙江大学