用于犬呼吸道疾病综合征的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一个包括犬流感病毒和犬呼吸道冠状病毒的组合物。其还可以进一步包括支气管炎博德特氏菌(Bordetella?bronchiseptica)，百日咳杆菌粘附素(pertactin)，犬副流感病毒(canine?parainfluenza?virus)和犬腺病毒血清型2型(canine?adenovirus?serotype2)。该组合物可以有效的治疗或者预防包括犬传染性呼吸道疾病综合征在内的犬呼吸道疾病。
【专利说明】用于犬呼吸道疾病综合征的组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域，特别是免疫原性和疫苗的组合物。其涉及用于防治包括犬传染性呼吸道疾病综合征(CIRDC)在内的犬呼吸道疾病的组合物。本发明还涉及在犬体内接种疫苗、治疗、或者预防犬呼吸道疾病的方法。
【背景技术】
[0002]犬传染性呼吸道疾病综合征(CIRDC)是一种传染性极强的疾病，常见于住在拥挤的条件下，如领养中心和登机或培训犬舍的狗。许多狗仅仅表现出轻微的咳嗽，然后在很短的时间内就恢复了。但是在某些情况下，可能会发展成严重的支气管肺炎。
[0003]CIRDC的发病机理被认为是多因素的，涉及一些病毒和细菌。已知的CIRDC病原体的传染原包括犬呼吸道冠状病毒(CRCoV) (Erles等，Virology, 310(2): 216-223，2003)、犬流感病毒(CIV) (Crawford 等，Science, 310 (5747): 482-485，2005)、犬副流感病毒(CPIV) (Binn 等，Exp.Biol.Med.，126:140-145，1967)、犬腺病毒 2 型(CAV-2) (Ditchfield等，Can.Vet.J., 3:238-247，1962)、犬支原体(Chalker 等，Microbiology, 150:3491-3497，2004)，和细菌支气管炎博德特氏菌(Bemis 等，Lab.Anim.Sc1.，29:48-52，1977)。
[0004]CRCoV可以引发高度传染性呼吸道疾病，其通过犬类和犬类的直接接触、呼吸道分泌物的悬浮微粒、以及和污染的环境和人接触而传播。患病轻微的狗的症状包括咳嗽、打喷嚏、鼻涕。一些狗有亚临床感染，并没有任何临床症状，但是他们可以传播病毒从而使其他狗感染。一些感染了 CRCoV的狗会发展成为肺炎，特别是如果还同时感染了其他的呼吸道病原体。
[0005]有关CIV，从大约1956年开始，马流感病毒被认为是马中主要的呼吸道病原体。马流感病毒可以引发严重的疾病症 状，并经常继发细菌感染。两种马流感病毒的亚型已经别确定，命名为亚型-1 (原型为A/Equine/Prague/1/56 (H7N7))和亚型_2 (原型为A/Equine/Miami/1/63 (H3N8))。目前，主要的病毒亚型是亚型_2，H3N8菌株。H3N8马流感病毒可以感染犬类，一些情况下致死率高达36%。一种解释是马流感病毒全部或部分种间转移至犬类，会产生一种新的与急性呼吸道疾病有关的犬类特殊流感病毒(Crawford等，2005)。
[0006]CPIV引起的疾病通常在上呼吸道。单独由CPIV引发的疾病是十分轻微的或者表现为亚临床，如果并发感染其他呼吸道病原体则症状将会变得越发严重。
[0007]CAV-2导致呼吸系统疾病，严重的情况下，可以包括肺炎和支气管肺炎。
[0008]据报道，支气管炎博德特氏菌(B.Bixmchis印tica)是呼吸道疾病气管支气管炎或“犬舍咳”中的主要病原。它使狗易受其他呼吸剂的影响，并且经常和它们同时存在。犬舍咳通常发生在上呼吸道，特点是流鼻涕和咳嗽。至目前为止，一些疫苗可以用于治疗由支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)引发的气管支气管炎，包括Nobivac⑧、Bronch1-Shield ⑧ Bronchicine ? CAe> Vanguard ⑩ B、Univac2> Recombitek (g) KC2、NaramuneTM-2和Kennel-JecTM2。然而，大多数现有的商业疫苗需要繁琐的鼻腔给药以及加入佐剂，这可能会导致有害的副作用，如烧灼和刺激。Viera Scheibner等，Nexus Dec2000(Vol8，Nol)。亚单位疫苗，如那些涉及使用支气管炎博德特氏菌的p68蛋白(百日咳杆菌粘附素)，已经被研究，但是至今没有被包括在任何商业犬类疫苗中，可能是因为免疫原性不足，不良反应，和/或制剂的稳定性。
[0009]CIRDC的病理学表明其涉及肺损伤，在某些情况下，导致支气管肺炎，但是其与犬舍咳(主要病原:支气管炎博德特氏菌B.bronchiseptica)不同，犬舍咳主要涉及上呼吸道变化。犬舍咳是一种相比于CIRDC更加轻微的综合病症，并且不具有在CIRDC中指出的广泛的病变。CIRDC也以增加的严重程度和死亡率为特征。
[0010]CIRDC很少致命，但是会延迟救援中心的狗被领养，打乱狗舍的训练安排，导致相当大的治疗费用和福利问题。疫苗可以用于治疗一些与CIRDC有关的传染原。但是，尽管使用这些疫苗，CIRDC仍然在世界范围内盛行，其可能是因为缺乏相对于与CIRDC有关的所有的病原体的有效疫苗。
[0011]因此，仍然需要可以安全使用于犬类的免疫原型组合物，在提供相对于引发CIRDC的病原长期有效的免疫保护的同时，并没有有害的副作用或者在和其他疫苗一起使用时并不干扰其他抗原。本发明将满足这些和其他相关的需要。
【发明内容】
[0012]本发明主要涉及可以提供用于治疗或者预防CIRDC的抗原的免疫原性组合物。在一个实施例中，免疫原性组合物包括犬流感病毒(CIV)和犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)。在另一个实施例中，该免疫原性组合物进一步包括支气管炎博德特氏菌。在另一个实施例中，该免疫原性组合物进一步包括单独的百日咳杆菌粘附素抗原。在另一实施例中，该免疫原性组合物包括P68百日咳杆菌粘附素抗原。在另一个实施例中，百日咳杆菌粘附素抗原是一种重组蛋白。在又一个实施例中，百日咳杆菌粘附素抗原在大约I μ g至大约30 μ g之间。在另一个实施例中，所述的百日咳杆菌粘附素抗原通过将百日咳杆菌粘附素抗原包涵体溶解在尿素中以及任选的通过色谱柱纯化而制备得到。所述的百日咳杆菌粘附素抗原是可溶的，并且优选地基本没有聚集体·。在另一个实施例中，支气管炎博德特氏菌是疫苗或者细菌提取物。
[0013]在一个实施例中，免疫原性组合物包括CIV、CRCoV、支气管炎博德特氏菌、以及选自犬副流感病毒(CPIV)和犬腺病毒2型(CAV-2)中的一种或两种抗原。在另一个实施例中，所述的免疫原性组合物进一步包括P68百日咳杆菌粘附素抗原。在另一个实施例中，支气管炎博德特氏菌是疫苗或者细菌提取物。
[0014]另一个实施例中提供的免疫原性组合物包括CIV、CRCoV、包含支气管炎博德特氏菌的支气管炎博德特氏菌组分，单独的百日咳杆菌粘附素抗原，以及选自犬副流感病毒(CPIV)和犬腺病毒2型(CAV-2)中的一种或两种抗原。在一个进一步的实施例中，该免疫原性组合物同时包括CPIV和CAV-2。
[0015]在另一实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物进一步包括单独的Bsp22抗原。
[0016]在另一个实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物是无佐剂的。在另一个实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物包括佐剂。
[0017]在另一个实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物不含有非呼吸道抗原。
[0018]在又一个实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物诱导在犬体内对于犬呼吸道病原体的免疫应答。在另一个实施例中，所述的犬呼吸道病原体是CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支气管炎博德特氏菌和犬支原体(Mycoplasma cynos)中的至少一种。
[0019]本发明的另一个实施例中提供了将上述实施例中的任一种免疫原性组合物用于治疗或者预防犬类对于犬呼吸道病原体的感染。在另一个实施例中，所述的犬呼吸道病原体是CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支气管炎博德特氏菌、和犬支原体中的至少一种。在另一个实施例中，所述的组合物在约6个月或更长的时间内预防所述的感染。在另一个实施例中，所述的组合物在约I年的时间内预防所述的感染。在另一个实施例中，本发明提供了将上述实施例中的任一种免疫原性组合物用于制造药物的用途，该药物用于治疗或者预防在犬体内感染犬呼吸道病原体。 [0020]本发明的另一个实施例中提供了上述实施例中的任一种免疫原性组合物，其中所述的组合物在犬体内治疗或者预防犬传染性呼吸道疾病综合征(CIRDC)。本发明的另外一个实施例中提供了一种在犬体内治疗或者预防CIRDC的方法，包括给所述犬类用上述实施例中的任一种免疫原性组合物。在另一个实施例中，所述组合物可以在约6个月或更长的时间内预防CIRCD。在另一个实施例中，所述组合物可以在约I年的时间内预防CIRCD。另一个实施例提供了将上述实施例中的任一种免疫原性组合物用于制造药物的用途，该药物用于在犬体内治疗或者预防CIRDC。
[0021]附图简要说明
[0022]图1.抗CRCoV的血清中和抗体反应。
[0023]当狗被用盐水、加入佐剂的氢氧化铝(AlOH)或加入佐剂的Emulsigen?组分进行疫苗接种时，测量血清中和相对于犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)的抗体反应。
[0024]图2.攻击后自鼻中流出的病毒。狗被用盐水、加入佐剂的氢氧化铝(AlOH)或加入佐剂的Emulsigen ?组分进行疫苗接种，接着用CRCoV进行攻击，测量从鼻道中流出的CRCoV。
[0025]图3.在攻击后第4日对于CRCoV组织病毒为阳性的动物百分比。用盐水、加入佐剂的氢氧化铝(AlOH)或加入佐剂的Emulsigen?组分进行疫苗接种，接着用CRCoV进行攻击，评估呼吸道组织中对于CRCoV呈阳性的狗的数量。
【具体实施方式】
[0026]下面的定义用于本公开。其取代任何包含在本发明引用的每个单独的参考文献中相矛盾的定义。没有定义的词具有本领域技术人员通用的意思。进一步，除非本文中特别提及，单数的名词包括复数的情况，复数的名词包括单数的情况。
[0027]“大约”和“将近”，当与可测量的数值变量关联使用时是指变量的指示值和所有变量值在指示值的实验误差内(如在平均值的95%置信区间内)或在指示值的10%(或大于10%)以内。如果“大约”用于指以周记的时间间隔，“大约3周”是17至25日，“大约2周至大约4周”是10-40天。
[0028]“佐剂”指的是可以作为免疫反应中非特异性刺激物的任何物质。参见下面关于佐剂的进一步描述。[0029]本发明中所用的术语“动物”，包括可以被犬呼吸道疾病综合症感染的任何动物，包括驯养的和野生的哺乳动物。
[0030]“抗体”，是指包括抗原结合位点的任何多肽，不考虑其来源、生产方法和其他特征。其指的是免疫球蛋白分子或者其中可以与抗原特异性结合从而对抗原产生免疫反应的片段。免疫球蛋白是具有“恒定”及“可变”区的“轻”及“重”多肽链组成的血清蛋白，且基于恒定区的组成而分为若干类(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。对于给定抗原“特异性”的抗体指的是抗体的可变区可以特异性地识别和结合特殊的抗原。该术语包括，但是不限于:多克隆抗体、单克隆抗体、单一特异性抗体、多特异性抗体(polyspecific antibody)、人源化抗体、四聚体抗体、多特异性抗体(multispecific antibody)、单链(single chain)抗体、特定域(domain-specific)抗体、单域抗体、域缺失(domain-deleted)抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、单链(single-chain)抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体以及⑶R移植抗体。抗体可以是来自天然来源或者重组来源的完整的免疫球蛋白，也可以是完整的免疫球蛋白的免疫反应性部分。“抗体”可以被转换成与抗原结合的蛋白，其包括但不限于抗体片段，其中包括但是不限于{&1^妯’)2、？&13’片段{￥片段、单链Fv(ScFv)、Fd片段、dAb片段、双抗体、CDR3多肽、受约束的FR3-CDR3-FR4多肽、纳米抗体、二价的纳米抗体、小型模块化免疫制药(SMIPs)、低分子抗体(minibody),以及上面所提及的片段、其化学或者遗传操作的配对、和保留抗原结合功能的其他抗体片段。通常情况下，这样的片段包括结合抗原的域。如本领域技术人员所知的，该分子可以被设计(如种系的(germlined))以减少其免疫原性，提高亲和力，改变其特异性，或者用于其他目的。
[0031]“抗原”或者“免疫原”是指包括一个或多个抗原决定基的分子，在其暴露于受检者后将诱发对于该抗原具有特异性的免疫反应。抗原决定基是抗原的特异性部位，其与T-细胞受体或者特异性抗体结合，且通常含有大约3个氨基酸残基至大约20个氨基酸残基。术语抗原是指亚单元抗原-从与抗原性质相关的整个有机体中抗原分离和离散-以及被杀死的、减毒的或者灭活 的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其他微生物。术语抗原还指抗体，如抗个体基因型抗体或其片段，可以模拟抗原或者抗原决定簇(抗原决定基)的合成肽模拟表位。术语抗原还指在体内表达抗原或者抗原决定簇的寡核苷酸或者多核苷酸，如在DNA免疫中的应用。
[0032]本文中所用的“抗原性”是指蛋白质或者多肽免疫特异性结合为了防御蛋白或者多肽而增加的抗体的能力。
[0033]术语“支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica) ”或者“支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica) ”是指,支气管炎博德特氏菌的减毒活细胞、支气管炎博德特氏菌的灭活全细胞提取物(疫苗)或者支气管炎博德特氏菌的细胞细菌提取物。
[0034]“缓冲液”是指一种化学系统，其可以防止另一种化学物质的浓度变化。质子供体和受系统起缓冲作用，防止氢离子浓度(PH)明显改变。一个缓冲液的例子是含有弱酸和它的盐(共轭碱)或者弱碱和它的盐(共轭酸)的混合物。
[0035]本文中所用的“犬类”包括通常被称作的狗，但是还包括犬科家族的其他成员。
[0036]本文中所用的术语“细胞系”或“宿主细胞”是指病毒可以复制或者被供养的原核或者真核细胞。
[0037]本文中所用的术语“培养”，是指在没有其他种类或者类型存在的情况下生长的细胞或微生物的群体。
[0038]“剂量”是指给予受检者的疫苗或者免疫原性组合物。“第一剂量”或者“初给剂量(priming dose) ”是指在第O日所给予的组合物的剂量。“第二剂量”或者“第三剂量”或者“年剂量”是指该组合物在给予第一次剂量以后所给予的量，其可能为但是不要求与第一次剂量相同的疫苗或免疫原性组合物。
[0039]“抗原决定基”是指抗原上的特异性位置，其可以与T-细胞受体或特异性抗体结合，通常包括大约3个至大约20个氨基酸残基。
[0040]本发明中所用的“赋形剂”是指非抗原的疫苗或免疫原性组合物的非活性载体组分。
[0041]“片段”是指蛋白质或者基因被截断的部分。“功能性片段”和“生物活性片段”是指保留有全长蛋白质或者基因的生物性能的片段。
[0042]“同源性”或“百分比同源性”是指候选序列的核苷酸或氨基酸残基的百分比，其与在对其序列和引入空隙后比较器序列的残基相同或相似，如果必要，为了获得最大的百分比序列同源性，也可以考虑作为序列同源性的一部分进行保守的取代。
[0043]“同系物”或者“物种同系物”，包括在具有相当含量多核苷酸序列同源性，并具有相同或相近的生物功能和/或性能的2个或更多不同的物种中发现的基因。代表物种同系物的优选的多核苷酸序列在相当严格的条件下发生杂交，如在实施例中所描述的，并且具有相同或者相似的生物活性和/或性能。另一方面，代表物种同系物的多核苷酸共享大于约60%的序列同源性，大于约70%的序列同源性，大于约80%的序列同源性，大于约90%的序列同源性，大于约95%的序列同源性，大于约96%的序列同源性，大于约97%的序列同源性，大于约98%的序列同源性，大于约99%的序列同源性。
[0044]“同一性”或“百 分比同一性”是指与在序列和引入的空隙排序后的比较器序列中的残基相同的候选序列的核苷酸或氨基酸的百分比，如果必要，为了获得最大百分比的序列同一性，不考虑任何作为序列同一性部分的保守的代替。
[0045]本发明中所用的“免疫反应”,在受试者中是指对于抗原的体液免疫反应、细胞免疫反应、或体液和细胞免疫反应的发展。“体液免疫反应”是指通过抗体介导的免疫反应。“细胞免疫反应”是指由T-淋巴细胞或其他白血球或两者介导的免疫反应,且包括由活性T-细胞，白血球细胞，或者两者所产生的细胞因子、趋势因子即类似分子的产生。可使用此项技术中已知的标准免疫检定及中和检定确定免疫反应。
[0046]本发明中所用的“免疫原性”是指蛋白或者多肽由抗原特异性引发的产生免疫反应的能力。
[0047]“免疫原性组合物”是指制备含有免疫原，包括例如蛋白质，多肽，全细胞，灭活、亚基或者减毒的病毒、或者多糖、或他们的组合物，给药刺激受体相对于免疫原性组合物中一种或多种发生体液和细胞免疫系统。“免疫”是指将免疫原性组合物给药，从而刺激宿主中对于抗体的免疫或免疫原性反应的过程。优选的宿主是哺乳动物，如狗。优选地，免疫原性组合物是疫苗。
[0048]本文中所用的“免疫保护量”是指有效诱发受体免疫原性反应的抗原的量，该免疫反应能够预防或者改善疾病的信号或者症状，包括不利健康影响或并发症。可以诱发体液免疫或者细胞调节免疫或者两者。动物对于组合物的免疫原性反应可通过测量抗体滴度、淋巴增殖检定来间接评估或者通过监控野生型菌株攻击之后的病症和症状来直接评估。由组合物或者疫苗赋予的保护性免疫可通过测量，例如攻击微生物脱落物的减少，受检者的死亡率、发病率、温度值、整体身体情况、及整体健康和表现的临床病症的减少。免疫反应包括，但是不限于，细胞和/或体液免疫的诱发。可以有效治疗的组合物或者疫苗的量是变化的，其与所用的特定生物，或者进行治疗或者免疫的动物的条件有关，可以由兽医决定。
[0049]本文中所用的“鼻内”给药，是指通过或经由鼻将诸如疫苗或其组合物的物质引入受检者的身体，其包括主要经鼻粘膜运输该物质。
[0050]本文中所用的“分离的”，是指从其自然存在的环境中取出，无论是单独或者在异源宿主细胞中，或者染色体，或者载体(如质粒，噬菌体等)。“分离的细菌”、“分离的厌氧菌”、“分离的细菌菌株”、“分离的病毒”、“分离的病毒株”、和类似物，是指组合物，在其中只有细菌或者病毒，没有其他微生物，如当从其自然存在的环境中分离后进行培养。“分离的”，当用于描述任何特别定义的物质，如多核苷酸或多肽，是指从最初的细胞环境中分离出来的物质，其中如多肽或者核酸等物质通常被发现。如本文中所用，仅通过示例的方式，用本发明中多核苷酸构建的重组细胞系利用了“分离的”核酸。可选地，如果特殊的蛋白质或者特异的免疫原性片段被声称或者使用作为疫苗或者其他组合物，其会被认为是分离的，因为它已经被识别，分离并且与其在自然中存在相比较在一定程度上纯化。如果蛋白质或者特异性免疫原性片段在重组细菌或者真核细胞表达载体(其可以生成抗体)中生成，其被认为作为分离的蛋白或者核酸存在。例如，用多核苷酸构建的重组细胞系利用“分离的”核酸。
[0051]“药剂”是指可以用于预防、治疗或者改善医疗条件，或者用于预防某些生理情况或者突发病症的试剂。
[0052]本文中所用的“单克隆抗体”，是指由单一系的杂交瘤细胞生产的抗体，都指向在一个特殊抗原上的抗原决定基。用于制备单克隆抗体的抗原能够作为一个分离的病原体的蛋白质或者整个病原体被提供。“杂交瘤”是一个克隆细胞系，包括由骨髓瘤细胞和特异性抗体产生细胞融和形成的杂交·细胞。一般情况下，单克隆抗体是鼠源。但是，单克隆抗体也指对于相对于特殊的抗原决定基的抗体的克隆群体，该抗原由噬菌体展示技术或者等效于噬菌体展示或者非鼠源杂交细胞的方法生成。
[0053]本文中所用的“口服(oral)”或者“口服(peroral) ”施药是指通过或经由口将诸如疫苗或者其他组合物的物质引入受检者身体，并且包括吞咽或经由口腔黏膜(例如，舌下或者颊内吸收)输运或者两者。气管内也是一种口服(oral)或者口服(peroral)施药的方式。
[0054]本文中所用的“ 口鼻”施药是指通过或经由鼻及口将诸如组合物或者疫苗的物质引入受检者身体，如通过在鼻内置放一或多滴进行。口鼻施药包括与口服及鼻内施药相关的输送过程。
[0055]本文所用的“非经肠施药”是指通过或经由不包括消化道的途径将诸如组合物或者疫苗的物质引入受检者的身体。非经肠施药包括皮下施药、肌肉内施药、动脉内施药和静脉内施药。出于该公开的目的，非经肠施药不包括主要包括口、鼻、气管及肺中的黏膜组织输送物质的施药途径。
[0056]本文中所用的术语“病原体”或者“病源微生物”是指微生物，例如，CPIV、CAV-2、CRCoV或者支气管炎博德特氏菌，其能够诱发或者引发疾病、生病、或者其宿主动物的非正常状态。
[0057]本文中所用的“百日咳杆菌粘附素”是指支气管炎博德特氏菌的外膜蛋白。百日咳杆菌粘附素优选的来自支气管炎博德特氏菌，最优选的是“P68”，由基因，pmA编码。百日咳杆菌粘附素可以从支气管炎博德特氏菌的天然形式分离出来，或者其可以重组产生。序列和百日咳杆菌粘附素的例子由美国专利N0.7736658提供，其内容被引入本发明作为参考。百日咳杆菌粘附素的抗原包括蛋白的脂化形式。
[0058]“药物可接受”是指在合理医学判断范畴内德物质，其适用于与受检体组织接触而无不适当的毒性、刺激、过敏性反应极其类似情况，其等同具有合理的利益与风险比例，且对于其所欲的用途有效。
[0059]本文中所用的“多克隆抗体”是指相对于特殊病原体或者抗原的抗体的混合群。一般来说，群体包含多种抗体组，每一组指向病原体或者抗原的特殊抗原决定基。为了制作多克隆抗体，整个病原体，或者分离的抗原，通过接种或者感染被引入宿主内，诱导宿主产生相对于病原体或者抗原的抗体。
[0060]本文中所用的术语“多核苷酸”是指包括共价结合在一条链上的核苷酸单体的有机聚合物分子。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有不同的生物功能的多核苷酸的例子。
[0061]本文中所用的术语“多肽”，是指在包括在一个链中键合的两个或更多氨基酸的有机聚合分子。
[0062]本文中所用的“预防感染”是指预防或者阻止可以引发确定的疾病的细菌或者病毒的复制，阻止细菌或者病毒的传输，预防细菌或者病毒在宿主中建立起来，或者减轻由感染引发的疾病的症状。 如果减少了细菌或者病毒的负载，则治疗被认为是有效的。
[0063]本文中所用的“保护(protection) ”，“保护(protecting) ”，“保护性免疫”及类似词语，相对于疫苗或者他组合物，是指疫苗或者组合物可以预防或者减少由生物体(从中可以得到所用的疫苗或者组合物)所引发的疾病的症状。术语“保护(protection) ”，“保护(protecting) ”，及类似词语，是指疫苗或者组合物可以被用于“治疗”疾病，或者已经存在于受检体的疾病的一种或多种症状。
[0064]本文中所用的“吸入”施药，是指通过或者经由雾化(喷雾的)的物质吸入将诸如疫苗或者其他组合物的物质引入到受检体的身体。在吸入施药中，主要的运输机理包括通过气管、支气管和肺的黏膜吸收喷雾化的物质，其不同于鼻内或者口服施药。
[0065]术语“特异性结合(specificbinding) “特异性结合(specific binds) ” 以类似词语，是指形成在生理或者测定条件下可计量的并且具有选择性的复合物的两个或者更多分子。抗体或者其他抑制剂被认为特异性结合到蛋白上，如果在适当选择的条件下，这种结合基本上不可抑制，而同时的非特异性结合可以抑制。特异性结合具有高亲合性的特点，对化合物或者蛋白质具有选择性。非特异性结合通常亲合力较低。例如，与IgG抗体结合，通常具有至少大约10_7M或更高、或至少10_8M或更高、或至少10_9M或更高、或至少KTkiM或更高、或至少IO-11M或更高、或至少KT12M或更高的亲合力。例如，当结合抗原的结构域对一个特殊的不由许多抗原所携带的抗原决定基具有特异性时，该术语也适用，在该种情况下，携带抗原结合结构域的抗体通常不结合其他抗原。[0066]本文中所用的“特异性免疫原性片段”是指由对该序列具有特异性的抗体或者T细胞识别序列的一部分。
[0067]本文中所用的“受检体”，是指具有免疫系统的任何动物，包括哺乳动物，例如狗。
[0068]本文中所用的“基本相同”，是指在一定程度上至少大约90%、至少大约95%，至少大约96%，至少大约97%，至少大约98%，或者至少大于99%序列同一性。
[0069]本文中所用的“亚单元疫苗”或者“亚单元组合物”，是指包括一种或多种抗原的疫苗或者组合物类型，但是并不必须在疫苗或者组合物中具有所有的抗原，其源自目标病原体的抗原或者与其同源，如病毒、细菌、寄生虫或者真菌。在完整的病原体细胞中，或者治病的颗粒、或者该细胞或者颗粒的溶胞产物中基本不存在该组合物或者疫苗。亚单元疫苗或者亚单元组合物可以由来自病原体或者其类似物的至少部分纯化、或者基本上纯化的免疫原性多肽制备。在亚单元疫苗或者亚单元组合物中得到单个抗原或者多个抗原的方法包括标准纯化技术、重组生产、或者化学合成。“亚单元疫苗”或者“亚单元组合物”是指包括病毒、细菌或者其他免疫原的定义的抗原成分的疫苗或者组合物。[0070]"TCID50"是指“组织培养感染剂量”，其定义为感染50%的制定接种细胞培养物时所需的病毒稀释度。可使用各种方法测定TCID5tl,包括Spearman-Karber法,其用于整个说明书中。关于 Spearman-Karber 发的描述，参见 B.ff.Mahy&H.0.Kangro, Virology MethodsManual 25-46(1996)。
[0071]本文中所用的“治疗剂”是指可以辅助治疗病毒、细菌、寄生虫或者真菌的感染、治疗或者由此造成的条件的分子、化合物、病毒或者治疗，优选减毒或死亡的病毒，或者亚单元或者化合物。
[0072]本文中所用的“治疗有效量”是指可在接受抗原或者疫苗或者组合物的受检体(如狗)中诱发免疫反应的抗原或者疫苗的量，该量足以改善或者预防包括诸如病毒、细菌、寄生虫或者真菌的病原体感染所引发的不利健康影响或其他并发症的疾病的病症或者症状。可诱发体液免疫或者细胞介导免疫或者体液与细胞介导免疫两者。动物对于抗原，疫苗或者组合物的免疫原性反应能够经由测量抗体滴定，淋巴细胞增殖检定来间接评估，或者通过监控野生型菌株攻毒之后的病症即症状来直接评估。疫苗或者组合物所赋予的保护性免疫可通过测量，攻击微生物脱落物的减少，和/或诸如受检者的死亡率、发病率、温度值、整体身体情况、健康和表现的临床病症的减少。疫苗或者组合物的治疗有效量是变化的，与所用的特殊的免疫原或者受检体的条件有关，其可以有本领域技术人员决定。
[0073]本文中所用的“治疗(treat) ”或者“治疗(treating) ”是指逆转、减轻、抑制进程、或者预防该术语所应用的紊乱、病状或者疾病，或者预防该紊乱、病状或者疾病的一种或多种症状。
[0074]本文中所用的“治疗法(treatment) ”是指以上所以所定义的“治疗”的行为。
[0075]本文中所用的“疫苗”或者“疫苗组合物”，是指从病毒、或者细菌中选择出来的免疫原性组合物，其或为该活性、衰减、或者死亡、或者亚单位的疫苗，或者其组合物。将疫苗施药给受检体导致免疫反应。疫苗可以通过已知的施药路线被直接引入受检体，包括非经肠、口入或者类似方式。该术语意味着可以预防或者减弱感染、或者预防或者减弱一个或多个感染症状的组合物。疫苗组合物相对于病原体的预防效果通常通过在受检体中引发免疫反应完成。通常来讲，取消或者减少感染的发病率，改善病症或病状，或者加速受感染的受检体的微生物的消除，都对该疫苗组合物的预防效果具有指示作用。本发明中的疫苗组合物对于由犬呼吸道疾病综合症引发的感染提供预防效果。
[0076]本文中所用的“兽医学可接受的”是指在合理的医学判断的范围内，该物质适用于与兽医的受检体组织接触，没有不适当的毒性、刺激性、过敏性反应及类似情况，其等同具有合理的利益与风险比率，对于其所欲的用途有效。
[0077]本文中所用的“兽医学可接受的载体”，是指不干扰活性成分的生物活性效力的载体介质，对于施药的兽医学受检体是无毒的。
[0078]抗原、免疫原性组合物、疫苗
[0079]本公开提供了包括一种或多种病毒和细菌的免疫原性组合物和疫苗。本公开提供了包括一种或多种病毒和细菌，或适用于施药给犬类治疗CIRDC的亚单元的免疫原性组合物和疫苗。
[0080]这里描述的犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)可以被定性为一种患有传染性呼吸道疾病的狗的呼吸道中出现的冠状病毒。CRCoV系统发育上最接近牛冠状病毒(BCoV)，人冠状病毒(HCoV)菌株0C43和血凝性脑脊髓病毒(HEV);肠犬冠状病毒(CCoV)仅是CRCoV的远亲。适用于本发明的CRCoV的代表性例子包括确定为CRCoV菌株4182 (Erles等，VirusRes.，124:78-87, 2007)的菌株。
[0081]本发明中包含的流感病毒抗原可是是任何确认的来自鸟类或者哺乳动物的流感病毒株，包括但是不限于，具有H3亚型血凝素和NS亚型神经氨酸酶，或者H3N8亚型的流感病毒，更通常被称作H3N8病毒。流感可能是哺乳动物或者鸟类起源，包括但是不限于猪，马或者犬类起源。犬流感抗体被用于一个实施例中。马流感抗原被用于一个实施例中。具有H3亚型或NS亚型糖蛋白的菌株被用于一个实施例中。具有H3亚型和NS亚型的糖蛋白被用于一个实施例中。
[0082]本发明中包含的流感抗原从野生和家养的狗、马、猪和家禽中分离得到。选择用于样品采集的动物应该展示急性和/或亚急性的临床症状，其可以包括从轻度到严重的呼吸道症状和发烧。动物也可以表现出厌食和嗜睡的症状。使用本领域公知的病毒分离方法，其包括:接种哺乳动物或者禽类细胞培养，与从临场样品中的鼻或咽部粘液样品(通过擦拭鼻道或者咽喉采集，或者通过采集如脾、肺、扁桃体、肝、肺洗涤液的组织采集)接种含胚卵。可以在细胞培养中观察到病毒的细胞病变效应。可以测试尿囊液或者细胞裂解液凝聚人、鸡、伙计或豚鼠的红细胞的能力，作为流感病毒存在的推定证据。
[0083]适用于本发明的流感病毒株的一个代表性示例包括确认为A/Canine/lowa/9Al/B5/08/D12的菌株，其于2006年6月29日马纳萨斯大学大道(UniversityBoulevard) 10801的美国典型培养物保藏中心(ATCC)作为PAT-7694进行保藏，遵守国际承认的用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约。CIV抗原的代表性菌株为一种商业疫苗中的CIV病毒菌株，Vanguard? CIV (Pfizer，Inc)。本发明还包括包含确认为马流感菌株A/Equine/2/Miami/l/63的疫苗。该菌株保藏于ATCC，保藏号为VR317，遵守国际承认的用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约。
[0084]用于本发明的流感病毒的其他示例为A/canine/lowa/13628/2005、A/Equine/Kentucky/1998> A/Equine/Kentucky/15/2002、A/Equine/Ohio/1/2003> A/Equine/Kentucky/1/1994、A/Equine/Massachusett s/213/2003 > A/Equine/Wisconsin/2003、A/Equine/NewYork/1999 和 A/Equine/Newmarket/A2/1993。其他优选的菌株和 / 或分离的 CIV包括美国专利 Nos.7959929 (特别是已经确认为 Jacksonville/2005, Miami/2005, FL/242/03和Florida/43/04的菌株和HA序列)，7384642，7572620和7468，187中报道的，其内容包括所有的序列，特别是HA序列，以及菌株，在此引入作为参考，如同其完全包括在本发明的记载中。除此之外，适用于本发明的CIV菌株包括Colorado CIV分离菌(如在Barrell等，J.Vet.1ntern.Med.，24 (6)，1524-1527 (2010)所描述的)，保藏号为 ADW41784。
[0085]本发明中包含的犬副流感病毒(CPIV)可被表征为是已知是与犬舍咳有关的致病因素的病毒中的一种。CPIV抗原的代表性菌株是商业疫苗中的一种减毒的CPI病毒株，VanguarcL? Plus 5(Pfizer)。CPIV抗原的另外一个代表性菌株是具有“NL-CP1-5，，(National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)标记的减毒的 CPI 病毒株。
[0086]本发明中包含的犬类2型病毒(CAV-2)可被表征为已知是与犬舍咳有缘的致病因素的病毒的一种。CAV-2抗体中代表性的菌株是商业疫苗中一种减毒的CAV-2病毒株，Vanguard K Plus 5 (Pfizer) ? CAV-2抗原中代表性的菌株标记为“Manhattan”菌株(National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)的减毒 CAV-2 菌株。
[0087]本发明中包含的犬支原体(Μ.cynos)如在 Chalker 等，Microbiology, 150:3491-3497，2004中描述的，且仅为通常伴有呼吸道疾病的支原体种类。对于M.Cynos的免疫原性组合物如在US2007/0098739中所描述的，通过引用并入本文。
[0088]本发明中包含的支气管炎博德特氏菌组分可被表征为与犬舍咳有关的细菌致病因素。本发明中包含的免疫原性组合物和疫苗可能是活的减毒支气管炎博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌疫 苗或细菌提取物中的一种或多种。此外，优选的组合物还包括一个分离的支气管炎博德特氏菌亚单元抗原。
[0089]在实施例中支气管炎博德特氏菌通过将全细胞超声纯化通过色谱柱(如同专利申请号FR2571618，申请日1984年10月12日的专利中提供的)制备。支气管炎博德特氏菌的另外一个代表性示例是细菌提取物BronChiCineTMCAe (Pfizer)，其利用从支气管炎博德特氏菌细胞中提取的抗原物质制备。支气管炎博德特氏菌的另一个实施例是活的减毒支气管炎博德特氏菌菌株B-C2，存在于Nobivac⑧，和/或活的从Intra-Trac⑧、Bronch1-Shield ?、Naramune?、Recombitek Univac 和 / 或 Kennel-Jec? 的支气管炎/支气管败血症(bronchiseptica)菌株。
[0090]此外，亚单元也是优选存在的(例如，补充的)，与支气管炎博德特氏菌组分组合。亚单元的代表性示例为分离的百日咳杆菌粘附素抗原，优选地，支气管炎博德特氏菌P68抗原，特别是重组的支气管炎博德特氏菌p68抗原，其可以由p68-特异性单克隆抗体Bord2-7识别(如在US7736658中描述的，其通过引用并入本发明)，在一个优选的实施例中，具有US7736658中所述的氨基酸序列或者具有其同源性。
[0091]重组的支气管炎博德特氏菌p68抗原优选在可溶的形式中制备，从而在加工过程中使类似天然的结构被保存或者恢复。因此，本发明的一个方面是提供重组P68，其基本没有(小于大约80%，90%，95%，甚至99%)聚合体，。在另一个实施例中，重组p68用尿素溶解，优选大于0.1M、0.5M、1M、2M、3M或6M的尿素溶液。此后，p68抗原能够被纯化，如通过色谱柱。Surinder 等，J.Bioscience and Bioengineering, v.99 (4), pgs303-310 (2005)中描述了这样一个溶解过程。
[0092]本发明中所用的百日咳杆菌粘附素抗原还包括脂化形式。脂化蛋白的生产的示例由 Erdile 等，Infection and Immunity, (1993) ν.61 (I)，ρ.81-90 提供，其通过引入并入本发明。其所公开的方法可以用于制备翻译后修饰的百日咳杆菌粘附素蛋白，其包含一个附属的脂质部分。
[0093]此外，另一个实施例中，免疫原性组合物包括支气管炎博德特氏菌和分离的Bsp22抗原。在另一个实施例中，免疫原性组合物包括支气管炎博德特氏菌，一个分离的百日咳杆菌粘附素抗原，和分离的Bsp22抗原。Bsp22抗原能够如Medhekar等，MolecularMicrobiology (2009) 71(2), 492-504中描述的方法制备。优选地，分离的Bsp22抗原与支气管炎博德特氏菌提取物和分离的百日咳杆菌粘附素，特别是重组的P68，协作(例如，附加地)存在。
[0094]“Bsp22”还包括抗原的脂化形式。生产脂化蛋白的示例在Erdile等，Infectionand Immunity, (1993) v.61 (I)，p.81-90中提供,通过引入并入本发明。该公开的方法能够用于制备翻译后修饰的Bsp22蛋白，其包含一个附属的脂质部分。
[0095]本发明中包含的病毒是可以在细胞、细胞系、宿主细胞中繁殖。所述的细胞、细胞系、宿主细胞可能是例如，但是不限于，哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞，包括昆虫和植物细胞。
[0096]本发明包含的病毒可以繁殖的细胞、细胞系和宿主细胞是已知的，并且是本领域技术人员可以获得的。
[0097]在另一个实施例中，本发明中所描述的免疫原性组合物不包括非呼吸道的抗原。因此，本发明的一个实施例中提供了一种组合物，条件是其不包括非呼吸道抗原。非呼吸道抗原不能引起受检体的呼吸道疾病。非呼吸道抗原的非限制性示例包括狂犬病毒、犬细小病毒、肠犬类冠状病毒、钩端螺旋体病种(Leptospira species)和莱姆病螺旋体(Borreliaburgdorferi)。
`[0098]本发明包含的细菌能够使用本领域技术人员已知的各种培养基进行培养和繁殖，包括肉汤(液体)和琼脂(固体；半固体)培养基。一些细菌也可以在哺乳动物细胞或者非哺乳动物细胞中培养和繁殖。
[0099]本发明中包含的病毒和细菌能够是在用于免疫原性组合物或者疫苗之前减毒或者灭活的。减毒和灭活的方法是本领域技术人员公知的。减毒的方法包括，但是不限于，在合适的细胞系(病毒或者细菌)上在细胞培养中连续传代，在肉汤培养中连续传代(细菌)，紫外线辐射(病毒和一些细菌)，化学突变(病毒和细菌)。用于病毒或者细菌的灭活的方法包括，但是不限于，用福尔马林、β_丙内酯(BPL)或者二乙烯亚胺(BEI)治疗，或者其他本领域技术人员已知的方法。
[0100]福尔马林灭活的能够通过将含有微生物的悬浮液与37%的甲醛混合至甲醛的最终浓度为0.5%实现。微生物-甲醛混合物室温下通过不断搅拌大约24小时混合。灭活的微生物混合物通过测试在合适的细胞系或者肉汤培养基中的生长检测剩余活的微生物。
[0101]对于某些抗原，由BEI灭活通过将含有本发明中微生物的悬浮液与0.1M BEI (在
0.175Ν NaOH中2-溴-乙胺)混合至BEI的最终浓度为ImM实现。对于其他抗原，BEI的最终浓度为2mM。本领域技术人员指导使用的适当浓度。病毒-BEI的混合溶液通过在室温下连续搅拌大约48h进行混合，然后加入1.0M硫代硫酸钠至最终浓度为0.1mM。将混合液继续搅拌2h。含有灭活的微生物的混合物通过检测在适当的细胞系或肉汤培养基中的生长检测剩余的获得病毒。
[0102]本发明包含的免疫原性组合物和疫苗能够包括一种或多种兽医学上可接受的载体。如本文中所用，“兽医学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂料、佐齐?、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。稀释剂包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、和乳糖，和其他本领域技术人员已知的。稳定剂包括白蛋白、和其他本领域技术人员已知的。防腐剂包括硫柳汞，和其他本领域技术人员已知的。
[0103]佐剂是可以代谢的，涉及包含这些可以由目标物种，如植物油基佐剂，代谢的组分的佐剂。代谢的佐剂能够是可代谢的油。可代谢的油是通常发生在植物和动物中的脂肪和油脂，通常包含大量的三酰基甘油的混合物，也成为甘油三酯或中性脂肪。这些非极性的，不溶于水的物质是脂肪酸和甘油三酯。根据其三个脂肪酸残基或者侧链的识别和位置，三酰基甘油是不同的。
[0104]佐剂也能够是不可代谢的，涉及这些包含不能被将该乳液施药给的动物受检体的身体代谢的组分的佐剂。适用于本发明的组合物的不可代谢的油包括烷烃、烯烃、炔烃和其相应的酸和醇、 醚和他们的酯，以及它们的混合物。优选地，个别的油的化合物是轻质烃化合物，例如，这些具有6-30个碳原子的组分。油能够从石油产品中合成制备或者纯化。优选的用于这里描述的组合物的不可代谢的油包括例如矿物油、石蜡油、环烷烃。术语“矿物油”是指不可代谢的佐剂，其是通过蒸馏技术从凡士林中得到的液态烃的混合物。该术语与“液化石蜡”、“液体石蜡”和“白矿油”是同义的的。该术语还旨在包括“轻质矿物油”，例如，与从蒸馏凡士林得到的类似的油，但是其具有相对于白矿油稍低的比重。矿物油可以通过各种商业来源获得，例如，J.Τ.Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH)。轻质矿物油从DRAKEOL ?品牌商业可得的。
[0105]佐剂包括，但是不限于，Emulsigen ?佐剂系统(MVP实验室；Ralston, NE)，RIBI佐剂系统(Ribi Inc.;Hamilton, MT),明矾、氢氧化铝凝胶、水包油型乳剂、油包水型乳剂、例如、弗式完全和不完全佐剂、Block 共聚物(CytRx; Atlanta, GA)、AF-M (Chiron; EmeryviIIe，CA), AMPHIGEN? 佐剂、皂角苷、奎尔 A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc.; Cambridge, MA), GP1-0100 (Galeu Pharmaceuticals, Inc.; Birmingham, AL)或者其他阜角苷组分、单憐酸酯A、AVridine脂胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组或者其他)、霍乱毒素、胞壁酰二肽、角鲨烯/据丙二醇与环氧乙烷的加聚物的嵌段共聚物/表面活性剂(SP-油)，硫化β环糊精(sulpholipobeta-cyclodextrin) (SL-Q))、含有免疫调控剂的脂体(如CpG或聚1:C)、胞壁酰二肽(MDP)、ISC0MATRIX(Quil A/磷酸酰胆碱)、CpG/DEAE-葡萄糖/矿物油(TXO)、CpG、三萜类化合物(例如、奎尔A或者其他纯化的或者部分纯化的皂角苷制备)、甾酮(如胆固醇)、免疫调节剂(例如、二甲基二(十八烷基)溴化铵-DDA)、聚合物(如、聚丙烯酸、如Bay R1005 (R))和Th2兴奋剂(例如，糖脂，如Bay RlOOi (R))，以及它们的组合物，包括其他本领域技术人员已知的佐剂。
[0106]可以使用的各种组合物的非限制性实施例包括三萜类加上留酮(例如，奎尔A/胆固醇，也称作QAC)，三萜类化合物加上留酮、免疫调节剂和聚合物(例如，Quil A/cholesterol/DDA/CARBOPOL,?，也称作QCDC)，三萜类混合物加上留酮、免疫调节剂、聚合物和 Th2 兴奋剂(例如，Quil A/cholesterol/DDA/CARBOPOL K 和 Bay R1005 ?,也称作QCDCR)。
[0107]本发明上下文中用的佐剂和添加剂的用量和浓度能够很容易地由本领域技术人员决定。在一个实施例中，本发明设计了包含从大约20 μ g至大约2000 μ g佐剂的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施例中，包含了从大约100 μ g至大约2500 μ g，或从大约250 μ g至大约1000 μ g，或从大约350 μ g至大约750 μ g的佐剂。在另外一个实施例中，包含了用量为大约500μ g/2ml剂量免疫原性组合物或疫苗的佐剂。
[0108]免疫原性组合物和疫苗还包括抗生素。该抗生素包括，但是不限于，选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽、大环内酯类、青霉素类、多肽喹诺酮类、磺胺类和四环素类抗生素。在一个实施例中，本发明设计了包含从大约I μ g/ml至大约60 μ g/ml抗生素的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施例中，免疫原性组合物和疫苗包括从大约5 μ g/ml至大约55 μ g/ml、或从大约10 μ g/ml至大约50 μ g/ml、或从大约15 μ g/ml至大约45 μ g/ml、或从大约20 μ g/ml至大约40 μ g/ml、或从大约25 μ g/ml至大约35 μ g/ml的抗生素。在又一个实施例中，免疫原性组合物和疫苗中包括少于大约30 μ g/ml的抗生素。
[0109]本发明中包含的免疫原性组合物和疫苗能够包括一种或多种为病毒、或者细菌、或者病毒或细菌的蛋白质编码的多核苷酸分子。DNA或者RNA分子能够用于免疫原性组合物或者疫苗。DNA或者RNA分子可以在不存在其他药物的情况下施药，或者其可以与促进细胞摄取(例如，脂质体或者阳离子脂质体)的试剂一起被施药。免疫原性组合物或疫苗中总的多核苷酸在大约0.1 μ g/ml至大约5.0mg/ml之间。在另一个实施例中，免疫原性组合物或疫苗中总的多核苷酸能够在大约I μ g/ml至大约4.0mg/ml之间、或在大约10 μ g/ml至大约3.0mg/ml之间、或在大约100 μ g/ml至大约2.0mg/ml之间。利用核酸(DNA或者RNA)的疫苗和疫苗接种程序在现有技术中已经记载，例如，U.S.Pat.N0.5703055, U.S.Pat.N0.5580859，和U.S.Pat.N0.5589466，其全`都通过引用并入本发明。
[0110]除了上述的病毒或者细菌，本发明中包含的免疫原性组合物和疫苗包括其他添加的抗原。抗原能够是以制备的微生物的全部或部分灭活的形式、或者以通过基因工程技术或者化学合成获得的抗原分子的形式。其他适用于本发明的抗原包括，但是不限于，来自于如犬瘟热病毒、犬疱疹病毒、犬流感病毒、狂犬病毒的致病性病毒，如支气管炎博德特氏菌、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、流感伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血螺旋体、波摩那钩端螺旋体、牛哈德焦钩端螺旋体、叶啉单胞菌属、拟杆菌属、疏螺旋体属、链球菌属的病原性病毒，包括马链球菌兽瘟亚种、埃里克体属、支原体属，包括宜诺斯支原体和犬小孢子菌。抗原还来自于致病性真菌，如假丝酵母，原生动物，如隐孢子虫、犬新孢子虫、刚地弓心虫、艾美球虫属、八倍虫属、贾第虫属、利什曼原虫属，或寄生虫，如绦虫、黄蝇、棘球绦虫和并殖吸虫属。
[0111]形式，剂暈和施药途径
[0112]本发明中包含的免疫原性组合物和疫苗能施药给动物，从而诱发对CIRDC有效的免疫反应。因此，本发明提供了通过施药给动物治疗有效量的这里所描述的免疫原性组合物或疫苗从而刺激有效的免疫反应的方法。
[0113]这里描述的免疫原性组合物和疫苗能够施药给动物，从而使动物受检体接种对于CIRDC的疫苗。免疫原性组合物和疫苗能够施药给动物从而预防或者治疗动物的CIRDC。因此，这里描述的是给动物接种对于CIRCD的疫苗、和预防或者治疗CIRCD的方法，包括施药给动物治疗有效量的这里描述的免疫原性组合物或者疫苗。
[0114]本发明包含的免疫原性组合物和疫苗能够根据施药途径的需要以各种形式制备。例如，免疫原性组合物好疫苗能够以适用于注射用的无菌水溶液或分散体的的形式制备，或者用冷冻干燥技术以冻干形式制备。冻干的免疫原性组合物和疫苗通常保持在大约4°C，能够在一个稳定的溶液，如盐水或HEPES中，存在或者不存在佐剂，进行重组。免疫原性组合物和疫苗还能够以悬浮液或者乳液的形式制备。
[0115]本发明包含的免疫原性组合物和疫苗包括治疗有效量的一种或多种上面描述的微生物。纯化的病毒和/或微生物能够直接用于免疫原性组合物或者疫苗，或者能够是进一步减毒或者灭活的。通常，免疫原性组合物或疫苗包含在大约I X IO2至大约I X IO12之间的病毒或者细菌微粒，或在大约I X IO3至大约I X IO11之间的微粒，或在大约I X IO4至大约I X 101°之间的微粒，或在大约I X IO5至大约I X IO9之间的微粒，或在大约IXlO6至大约IX IO8之间的微粒。在可以有效的提供保护效力的免疫原性组合物或者疫苗中微生物的准确含量可以由本领域技术人员决定。
[0116]百日咳杆菌粘附素抗原在大约I μ g至大约30 μ g之间。更具体的，所述的百日咳杆菌粘附素在大约5 μ g至大约20 μ g之间,更具体,在大约7 μ g至大约15 μ g之间，再更具体，为大约51^、101^、151^或者20 μ g。
[0117]免疫原性组合物和疫苗通常含有兽医学上可接受的载体，为在大约0.5ml至大约5ml之间的体积。在另一个实施例中，载体的体积在大约Iml至大约4ml之间的，或者在大约2ml至大约3ml之间。在另一个实施例中，载体的体积为大约1ml，或者为大约2ml，或者为大约5ml。适用于免疫原性组合物和疫苗的兽医学可接受的载体能够是上面描述的任意一种。
[0118]本领域技术人员能 够很容易的确定在施药前病毒或者细菌是否需要减毒或者灭活。在本发明的另一个实施例中，病毒或者细菌可以不经过附加的减毒直接施药给动物。治疗有效量的微生物量是变化的，取决于所用的特殊的微生物、动物的条件和/或感染的程度，可以由本领域技术人员确定。
[0119]根据本发明的方法，可以单剂量给动物施药，或者，选择地，2次或多次疫苗接种在大约2至大约10周的间隔内发生。可以要求刺激方案，给药方案能够被调整从而提供最佳的免疫。本领域技术人员能够容易地确定最佳的给药方案。
[0120]免疫原性组合物和疫苗能够直接给药进入血液、肌肉、内部器官中，或者在皮下。非经肠施药的适合方法包括静脉内、动脉内、肌肉内、和皮下给药。用于非经肠施药的合适的装置包括针(包括微针)型注射器和无针注射器。
[0121]不经肠的制剂通常是含有赋形剂，如盐、碳水化合物、蛋白质和缓冲溶液(优选pH从大约3至大约9，或从大约4至大约8，或从大约5至大约7.5，或从大约6至大约7.5，或从大约7至大约7.5)的水溶液，但是，在一些应用中，其能够更合适的表现为无菌非水溶液或者干燥的形式，其用于与合适的赋形剂，如无菌、无热源的水或盐水，配合。
[0122]不经肠的制剂的制备在无菌条件下，例如，通过冷冻干燥，能够容易的用本领域技术人员已经的标准制药技术完成。[0123]用于不经肠溶液制备的物质的溶解性能够通过使用本领域技术人员一直的合适的制剂技术提高，例如掺入溶解性增强剂，包括缓冲液、盐、表面活性剂、脂质体、环糊精等
坐寸ο
[0124]用于非经肠施药的组合物能够配制成直接或者改性释放。改性释放制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、针对性、和编程释放。因此，免疫原性组合物和疫苗能够配制成固体、半固体、或者触变性液体，用于作为注入站，提供改性释放该免疫原性组合物和疫苗。
[0125]免疫原性组合物或疫苗施药的其他方法包括通过微针或者无针(例如，Powderject?, Bioject? 等)注射释放。 [0126]在使用皮下或者肌肉内注射的情况，优选等渗制剂。一般来说，用于等渗性的添加剂能够包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在特定的情况下，等渗溶液，如磷酸盐缓冲盐水，被使用。制剂能够进一步包括稳定剂，如明胶和白蛋白。在一些实施例中，血管收缩剂被加入配方中。根据本发明的药物制剂一般在无菌和无热原的条件下提供。但是，本领域技术人员已知的用于药物可接受的载体的制剂是由美国农业部颁布的法规批准的药物载体，或者由外国等效的政府机构，如加拿大、墨西哥、或者任何一个欧洲国家，用于犬类疫苗、多肽(抗原)亚单元免疫原性组合物和疫苗、重组病毒载体疫苗、和DNA疫苗。因此，用于商业生产免疫原性组合物或疫苗的药物可接受的载体是已经由或者即将由美国或者外国相应的政府机构批准的载体。免疫原性组合物和疫苗能够进一步用药物可接受的佐剂混合。在某些免疫原性组合物和疫苗的制剂中，免疫原性组合物或疫苗和其他犬类免疫原性组合物或者疫苗结合生成多价的产物，其可以保护犬类免受由其他犬类病原体引发的多种疾病。
[0127]这里描述的免疫原性组合物能够预防犬呼吸道病原体感染或者能够在大约3个月或更长的时期内预防犬类感染CIRCD。组合物能够预防所述的犬呼吸道病原体的感染，或者预防在大约6个月或更长的时期内预防犬类感染CIRCD。组合物能够预防所述的犬呼吸道病原体的感染，或者预防在大约I年或更长的时期内预防犬类感染CIRCD。
[0128]检测和诊断的方法
[0129]诱发动物免疫反应的程度和性质，能够使用各种技术评估。例如，通过从被接种的动物中采集血清，然后检测针对免疫原的抗体存在或者不存在。检测淋巴组织中响应T-淋巴细胞(CTLs)，其表示诱发了细胞免疫反应，能够通过检测如T细胞增殖完成。相关的技术在本领域中已经报道。
[0130]试剂盒
[0131]因为需要将免疫原性组合物或者疫苗与附加的组合物或者化合物结合施药-如，出于治疗特殊疾病或者病症的目的-以下包括在在本发明的范围内，免疫原性组合物或者疫苗能够便利的包含在或者合并在，适用于将组合物给药或者同时给药的试剂盒的形式。
[0132]因此，本发明包含的试剂盒能够包括一种或多种独立的药物组合物，其中至少一种是根据本发明的免疫原性组合物或者疫苗，和用于分别保持所述组合物的工具，如容器、分瓶，或者分割的铝箔包。该试剂盒的一个实例为注射器和针头，及类似物。本发明的试剂盒特别适用于给予不同剂型，例如，口服或者非经肠，适用于按照不同剂量间隔给予单独的组合物，或者用于滴定彼此独立的成分。为了协助使用本发明中包含的组合物，试剂盒通常包括服药说明。[0133]本发明包含的另外一个试剂盒能够包括一种或多种用于检测受感染动物的试剂。试剂盒能够包括用于分析样品中全部微生物、多肽、抗原决定基或者多核苷酸序列存在的试剂。病毒、细菌、多肽、或者多核苷酸序列的出现能使用抗体、PCR、杂交、和其他本领域中已知的检测方法确定。
[0134]本发明包含的另外一个试剂盒能够提供用于检测对于特殊抗原决定基的抗体的试剂。该试剂用于分析样品中抗体的存在，其为本领域技术人员熟知并可利用的。抗体的存在能够用本领域技术人员已知的标准检测方法确定。
[0135]在某些实施例中，试剂盒能够包括一组打印的说明书、或者标示该试剂盒用于检测受感染动物的标签。
[0136]技述
[0137]抗体能够是单克隆抗体、多克隆抗体、或者重组体。能够制备对于免疫原或其一部分的抗体。例如，基于免疫原氨基酸序列合成的多肽，或者通过克隆技术制备的重组体，或者天然基因产物和/或其部分，能够被分离并且用作免疫原。免疫原能够被用于通过本领域技术人员熟知的标准抗体生产技术生产抗体。抗体片段也能通过本领域技术人员熟知的方法从抗体中制备出来，包括F(ab' )2和Fv片段。
[0138]在抗体的生产中，筛选所需的抗体能够能过通过本领域中已知的免疫学的标准方法完成。一般情况下，ELISAs和Western印记是免疫检测的优选类型。两种检测方法都是本领域技术人员熟知的。多克隆抗体和单克隆抗体都能过用于检测。抗体能够与固体支撑物结合、与可检测的部分共轭、或者按照本领域熟知的同时结合和共轭。将抗体与固体支撑物结合也是本领域中熟知的。设计用于本发明中的可检测部分能够包括，但是不限于，荧光的，金属的，酶的和放射性的标记物，如生物素，金，铁蛋白，碱性磷酸酶，β -半乳糖苷酶，过氧化物酶，脲酶，荧光素，若丹明，氚，14C,和碘化。
[0139]本发明通过以下实施例进一步说明，但是不仅限于该实施例。
[0140]实施例
[0141]实施例1.评估含有CRCoV的疫苗
[0142]本公开中使用了 60只8-9周龄的健康状况大致良好的小猎犬。所有动物抵达后接受体检，并且在第2研究日或者第I日再次体检。动物每日被观察一次其大体的健康情况，从到达第8研究日至第39研究日。从第I研究日开始至接种前采集鼓膜温度。在每次疫苗接种前的第O研究日和第21日用SST管采集用于血清学的血样(大约5mL)。
[0143]CRCoV疫苗菌株来自菌株CRCoV.669，其根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约保存在ATCC，保存号为PTA-11444。CIV疫苗菌株来自用于在Vanguard ?疫苗系(Pfizer)制备疫苗的病毒种子。抗原在病毒的最高通道(Master See Virus+5)制备。疫苗组合物含有包括Quil A(20 μ g)、胆固醇(20 μ g)、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA ;10 μ g)和Carbopol.⑩(聚丙烯酸，0.05%体积/体积)的佐剂。CRCoV抗原按目标每剂量1.3相对抗原单元(RAU)配制。实验疫苗进行灭菌。
[0144]异源CRCoV分离体(“Max”菌株；通道I)用于作为攻击材料。病毒储存材料在HRT18G细胞上被繁殖和滴定，被确定具有107_ 1TCID5cZmL的滴度。攻击材料经测试并确认是令人满意的无菌，没有支原体或者犬类/猫的体外试剂。
[0145]在第21日一只动物被进行接种；其余动物在第22研究日进行接种。动物根据如表1所示的实验设计皮下接种适当的疫苗或者安慰剂。第一次接种被施药在右肩区域(第O研究日)，第二次接种施药在左肩区域(第22研究日)。
[0146]表1.实验设计
[0147]
【权利要求】
1.一种免疫原性组合物，其包括犬流感病毒(CIV)和犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物,其还包括支气管炎博德特氏菌。
3.如权利要求2所述的免疫原性组合物，其还包括p68百日咳杆菌粘附素抗原。
4.如权利要求2所述的免疫原性组合物，所述的支气管炎博德特氏菌是一种细菌或细菌提取物。
5.如权利要求2所述的免疫原性组合物，还包括选自犬副流感病毒(CPIV)和犬腺病毒2型(CAV-2)中的一种或两种抗原。
6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，所述的一种或两种抗原是CPIV和CAV-2。
7.如权利要求2至6所述的免疫原性组合物，还包括分离的Bsp22抗原。
8.如上述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述的组合物是没有佐剂的。
9.如权利要求1至7中任一项所述的免疫原性组合物，还包括佐剂。
10.如上述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述组合物不含有非呼吸道抗原。
11.如上述权利要求中任一所述的免疫原性组合物，所述组合物诱发犬类对于犬呼吸道病原体的免疫反应。
12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，所述犬呼吸道病原体为CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支气管炎博德特氏菌和·犬支原体(Mcynos)中的至少一种。
13.权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物的用途，其用于治疗或者预防犬类感染犬呼吸道病原体。
14.如权利要求13所述的用途，所述的犬呼吸道病原体为CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支气管炎博德特氏菌和犬支原体(M.cynos)中的至少一种。
15.如权利要求13或14所述的用途，所述组合物在大约6个月或更长的时间内预防所述感染。
16.如权利要求13或14所述的用途，所述组合物在大约I年的时间内预防所述感染。
17.权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物在制造用于治疗或者预防犬类感染犬呼吸道病原体的药物中的用途。
18.如权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物，所述组合物在犬类中治疗或者预防犬传染性呼吸道疾病综合征(CIRDC)。
19.在犬类中治疗或者预防CIRDC的方法，包括将权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物施药给所述犬类。
20.如权利要求19所述的方法，所述组合物在大约6个月或更长的时间内预防CIRDC。
21.如权利要求19所述的方法，所述组合物在大约I年的时间内预防CIRDC。
22.权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物在制造用于在犬类中治疗或者预防CIRDC的药物中的用途。
【文档编号】A61K39/10GK103596588SQ201280014795
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年2月3日 优先权日:2011年2月4日
【发明者】O.Y.阿布德尔马吉德, J.M.布里克, S.L.希尔兹 申请人:佐蒂斯有限责任公司