神经保护肽的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗神经退行性紊乱的方法。该方法包括向所述的受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V10氨基酸序列的20个氨基酸，并且包含神经保护活性。
【专利说明】神经保护肽
[0001]本发明的【技术领域】和【背景技术】
[0002]在一些实施方案中，本发明涉及神经保护肽试剂及其用途。
[0003]神经退行性紊乱(例如阿尔茨海默氏疾病(AD)、帕金森氏疾病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)和Huntington疾病(HD))是成人发作的、慢性的、进行性且不可逆转的严重丧失能力的疾病，其中存在神经元的结构和功能的进行性丧失，包含神经元的死亡。 [0004]阿尔茨海默氏疾病(AD)是最普遍的神经退行性紊乱，其可表征为认知功能的进行性丧失。AD的组织病理学定义为蛋白质的异常，即，蛋白斑和神经元纤维的缠结，这是分别由淀粉样肽-β (Αβ)和过度磷酸化Tau蛋白的沉积所导致的。这些病理学伴随有神经元和白质的丧失、嗜刚果红血管病、炎症和氧化性损伤[I]。炎症在AD中的作用可通过老年斑周围的小神经胶质细胞形态学的改变以及神经胶质过多症来证明[2]。Αβ肽是由β-淀粉样肽前体蛋白质(APP)通过初始β_分泌酶切割、然后通过Y-分泌酶(在其催化核心与早老素I形成蛋白质络合物)的膜内消化而生产的。所得的肽被分泌并沉积在AD定义的淀粉样蛋白斑中[I]。
[0005]帕金森氏疾病(PD)是在大脑的黑质密部中多巴胺能神经元的选择性退化所导致的慢性进行性的神经退行性疾病。症状包含运动神经相关的情况，包含运动的震颤、肌张力增高、迟缓、以及姿势不稳定。自主功能障碍以及感觉和睡眠困难为非运动神经的症状。认知和神经行为的问题(包含痴呆)在疾病的晚期是普通的。ro通常在大约60岁显现，但是存在年轻人发作的情况。ro的主要病理学特征为黑质(更具体而言为密部的腹侧部)中的细胞死亡，从而到患者死亡时影响了至多70%的细胞[3]。
[0006]CD44编码了 I类跨膜蛋白质家族，其由广泛的选择性剪切和翻译后修饰得到。变化位于蛋白质的最接近细胞外膜的部分，并且由变体外显子V2 (在小鼠中为VI)至VlO编码[4]。⑶44为透明质酸(HA)的主要细胞表面受体，但是其还显示出与诸如胶原蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白和骨桥蛋白之类的蛋白质结合[5]。对于使淋巴细胞循环至炎症位点处的募集而言，⑶44是必须的[6，7]。⑶44S是最普遍的形式，并且大多数类型的细胞所表达，其中所述的⑶44S不包含任何变体外显子[8]。⑶44变体蛋白质大多与癌症和自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎[10]和多发性硬化[11])相关报道[9]，其中包含10个变体外显子中的一个或多个。CD44剪接变体所提示的一种独特的功能为参与信号传导。例如，显示CD44V6对于通过酪氨酸激酶(例如c-Met[12]和VEGFR_2[13])的信号发射而言是必须的。
[0007]在大脑中，⑶44主要在白质的星形胶质细胞中发现[14-18]。与此不同的是，包含外显子V4、V5和VlO的⑶44变体局限于神经元[17]。此外，在短暂性前脑缺血后的海马体中，在活化的小神经胶质细胞中发现了⑶44的表达[19]。当Akiyama et al报道了⑶44阳性星形胶质细胞的特定子集(其数量在AD的大脑中急剧升高)时，CD44首次与AD相关提及[14]。由于发现⑶44对于视网膜神经节细胞的轴突是必须的，报道了⑶44在CNS再生中的潜在作用[20]。由于与大脑中动脉阻塞后的野生型小鼠的梗塞面积相比，CD44缺陷型小鼠的梗塞面积减小，⑶44在缺血性脑损伤中起到作用[21]。Lammich et al[22]报道，CD44通过早老素依赖的分泌物完成双重膜内分裂，其中所述的分泌物释放出细胞外结构域和用于推定的核信号发射的CD44细胞内结构域[22]。
[0008]W02009007934教导与非AD个体相比，在AD患者的海马体中，剪接变体CD44V3、CD44V6和CD44V10的表达显著升高。
[0009]发明概述
[0010]根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于治疗有需要的受试对象的神经退行性紊乱的方法，包括:向受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V10氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性，由此治疗神经退行性紊乱。[0011]根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于治疗有需要的受试对象的神经退行性紊乱的方法，包括:向受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V6氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性，由此治疗神经退行性紊乱。
[0012]根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了分离的肽，该肽包含⑶44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V10氨基酸序列的20个氨基酸，前提条件是所述的肽并非由SEQ ID N0:49或50所列的氨基酸序列构成，所述的肽包含神经保护活性。
[0013]根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了分离的肽，该肽包含⑶44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V6氨基酸序列的20个氨基酸，所述的肽包含神经保护活性，前提条件是所述的肽并非由SEQ ID NO: 1、51或52所列的氨基酸序列构成。
[0014]根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了药物组合物，包含作为活性试剂的分离的肽和药学上有效的载体，所述的分离的肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过⑶44V10氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
[0015]根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于治疗神经退行性紊乱的分离的肽，该分离的肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V10氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
[0016]根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含式I所示的氨基酸序列:
[0017]X1-G-Y-T-S
[0018]其中Xl为谷氨酸或谷氨酰胺的任意一者。
[0019]根据本发明的一些实施方案，所述的氨基酸序列包含拟肽。
[0020]根据本发明的一些实施方案，所述的拟肽包含逆反模拟物。
[0021]根据本发明的一些实施方案，所述的肽如SEQ ID N0:26、45或46所列。
[0022]根据本发明的一些实施方案，所述的肽由⑶44V10氨基酸序列构成。
[0023]根据本发明的一些实施方案，⑶44V10氨基酸序列为人⑶44V10氨基酸序列。
[0024]根据本发明的一些实施方案，⑶44V6氨基酸序列为人⑶44V6氨基酸序列。
[0025]根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含核心序列X1-X2-S-H,其中X1和X2为酸性氨基酸。
[0026]根据本发明的一些实施方案，Xl包含谷氨酸。
[0027]根据本发明的一些实施方案，X2包含天冬氨酸。
[0028]根据本发明的一些实施方案，所述的肽由⑶44V6氨基酸序列构成。[0029]根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含在SEQ ID NO:8_15、18_45或46中所列的氨基酸序列。
[0030]根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含在SEQ ID N0:49或50中所列的氨基酸序列。
[0031]根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含在SEQ ID N0:2-7、16或17中所列的
氨基酸序列。
[0032]根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于治疗神经退行性紊乱的分离的肽，该分离的肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V6氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
[0033]根据本发明的一些实施方案，神经退行性紊乱选自:帕金森氏疾病、多发性硬化、ALS、多系统萎缩、阿尔茨海默氏疾病、中风、创伤性脑损伤、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆伴与染色体17相关的帕金森病、以及Pick疾病。
[0034]根据本发明的一些实施方案，神经退行性疾病为帕金森氏疾病。
[0035]根据本发明的一些实施方案，神经退行性疾病为阿尔茨海默氏疾病。
[0036]根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含选自SEQ ID NO: 12, 15，17，19，24，26，31，32，34，36-38，43-46中 的氨基酸序列。
[0037]根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含在SEQ ID NO:26或45中所列的氨基酸序列。
[0038]根据本发明的一些实施方案的一个方面，本发明提供了药物组合物，包含作为活性试剂的分离的肽和药学上有效的载体，所述的分离的肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V6氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
[0039]根据本发明的一些实施方案，所述的肽附着在细胞渗透试剂上。
[0040]根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸为天然存在的氨基酸。
[0041]根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸为合成的氨基酸。
[0042]根据本发明的一些实施方案，合成的氨基酸包含D异构体。
[0043]根据本发明的一些实施方案，分离的肽共价附着在细胞渗透试剂上。
[0044]根据本发明的一些实施方案，细胞渗透试剂为肽试剂。
[0045]根据本发明的一些实施方案，所述的肽不超过20个氨基酸。
[0046]根据本发明的一些实施方案，所述的肽的长度为5-10个氨基酸。
[0047]根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了选择用于治疗神经退行性疾病的试剂的方法，该方法包括:
[0048](a)在神经毒剂存在下，使⑶44V10/6肽与神经元细胞接触；以及
[0049](b)监测神经元细胞的细胞死亡，其中与在⑶44V10/6肽缺乏下神经元细胞的细胞死亡的量或时间相比，在CD44V10/6肽存在下神经元细胞的细胞死亡的量或时间降低指示用于治疗神经退行性疾病的试剂。
[0050]根据本发明的一些实施方案，神经毒剂选自淀粉样肽、谷氨酸盐、6-0HDA、MPTP和MPP+ο
[0051 ] 根据本发明的一些实施方案，给药包含皮下给药。
[0052]根据本发明的一些实施方案，给药包含鼻内给药。[0053]除非另作说明，否则本文所用的所有技术和/或科学术语均具有本发明所属领域中任一普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或相当的方法和材料可以用于实施或测试本发明的实施方案，但是示例性的方法和/或材料如下描述。在矛盾的情况下，本专利的说明书(包含定义)将具有控制权。此外，所述的材料、方法和实例仅是示例性的，无意于一定是限定性的。
[0054]附图简述
[0055]本发明的一些实施方案在本文中仅以实例的方式参照附图进行描述。现在详细地参见附图，重点在于所示的具体特征为实例，并且其目的在于示例性地讨论本发明的实施方案。就此而言，说明以及附图使得本领域的技术人员如何可以实施本发明的实施方案而变得显而易见。
[0056]在附图中:
[0057]如图1A-B为具有多种哺乳动物有机体的蛋白质序列的特征的⑶44V6 (图1A)和⑶44V10 (图1B)的多个蛋白质序列比对。使用蛋白质Blast在线算法(NCBI)进行比对。保守残基被标记为框，其中在所述的保守残基中，在任何物种中具有至多I个保守的替代。在保守残基中的非保守替代标记为红色字母。
[0058]图2示出了 V6 (小鼠)和VlO (A)肽的列表，其中所述的肽的合成是根据图1所示的保守区域来指导的。
[0059]图3为柱状图，其示出了 V6和VlO肽在3种浓度下对使用80 μ M Αβ (1-42)处理48小时后的SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。使用XTT比色测定来确定细胞的生存能力。
[0060]图4Α-Β为柱状图，其示出了 V6和VlO肽在InM下对使用25 μ M Αβ (25-35)处理48小时后的Ν2Α小鼠神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。示出(图4Α)通过XTT测量的相对的细胞生存能力以及(图4Β)相对的Caspase3活性水平。
[0061]图5A-B为柱状图，其示出了 V6和VlO肽在I μ M下对使用200 μ MMPTP处理48小时后的Ν2Α小鼠神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。示出相对的细胞生存能力(图5Α)以及Caspase3活性水平(图5B)。
[0062]图6A-C为这样的图，其示出了在表1和图2中所列的人V6和VlO肽在IpM下对使用30 μ M处理48小时后的Ν2Α小鼠神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。示出相对的生存能力(图6Α)以及Caspase3活性(图6B)。在各种浓度下，测试N-乙酰化的和C-酰胺化的V10Al_N+4肽对30 μ M6-0HDA在Ν2Α细胞中的保护作用。示出通过阿尔玛蓝荧光测量的相对生存能力。
[0063]图7Α-Β为柱状图，其示出了在表1和图2中所列的人V6和VlO肽在IpM下对使用25 μ M Αβ (25-35)处理48小时后的SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。示出通过阿尔玛蓝荧光测量的相对生存能力(图7Α)和Caspase3活性(图7B)。
[0064]图8A-B为柱状图，其示出了在表3中所列的人P26衍生的肽在IOfM和IpM下对使用30 μ M6-0HDA(图8A)或40 μ M (图8Β)处理22小时后的Ν2Α小鼠神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。在图8Β中，将细胞与所述的肽预温育2.3小时，然后加入6-0HDA ;而在图8Α中，将6-0HDA与所述的肽一起加入。示出通过阿尔玛蓝荧光测量的相对生存能力。
[0065]图9为柱状图，其示出了在新目标识别(NOR)任务中，在保持测试阶段上，重复IH/ICV 给药 P26(SEQ ID NO:26, I, 10 IOOng/大鼠)或 P34(SEQ ID NO: 34，10 和 IOOng/大鼠)对鉴别指数的影响。**Ρ〈0.ΟΙΑβ (1_42)是媒介物VS对照组(无Αβ (1_42))并且##P〈0.01是VS媒介物对照的情况。
[0066]图1OA-B为皮下(SC)给药所述的肽对微注射A β后的摩里斯水迷宫(MWM)空间记忆测试的影响的图。A为在MWM中经过4段训练时期后的平均潜伏期。在肽处理组中，Ρ26组示出与赋形剂组相比较低水平的平均潜伏期(在第2、3和4天中为#ρ〈0.001)。B示出了在测试时期上在目标象限中的时间消耗。Ρ26示出了在目标象限中与赋形剂组(UV未处理组)相比较高水平的时间消耗(#Ρ〈0.05)。
[0067]图11为柱状图，其示出了 SC给药的肽对微注射A β后的NOR测试的影响。示出在保持测试阶段上的鉴别指数。*p〈0.05VS对照组并且#p〈0.05VS只有A β组的情况。
[0068]图12 为示出 P26(SEQ ID NO:26)和 P26-RI (SEQ ID NO:45)的药代动力学的图，其中所述的药代动力学是在雄性Sprague Dawley大鼠中皮下给药剂量为lmg/kg的肽之后进行评价的。使用LC-MS/MS方法来定量血浆样品中的两种肽。最低定量限(LLOQ)为22.34ng/mL。
[0069]图13为⑶44的基因组结构的示意图。
[0070]本发明的具体实施方案的描述
[0071]在一些实施方案中，本发明涉及神经保护肽试剂及其用途。
[0072]在详细地讲解本发明的至少一个实施方案之前，应该理解的是本发明并非一定使其用途局限于在以下说明书中列出的或通过实施例举例说明的详细情况。本发明可以为其他实施方案，或者以不同的方式实施或执行。
[0073]之前发现，与非AD的个体相比，剪接变体CD44V3、CD44V6和CD44V10的表达在AD患者的海马体中显著升高。表达的⑶44变体被进一步表征，并发现为主要的神经元[23]。
[0074]本发明人表征了由⑶44V6和VlO外显子序列衍生的多个肽的功能，并发现这些肽赋予神经元细胞对神经毒素(例如β淀粉样肽(Αβ)、ΜΡΤΡ和6-0HDA)的抗性，表明这些肽或衍生物可以作为用于治疗神经退行性紊乱的药品。
[0075]本发明人进行了结构-功能分析，从而揭示赋予神经保护的最小活性结构域。结果在用于帕金森氏疾病和阿尔茨海默氏疾病的动物模型中进一步证实。这些发现使得本发明的肽成为用于药品研发的前导化合物。
[0076]因此，根据本发明的一个方面，提供了分离的肽，其包含⑶44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V10氨基酸序列的20个氨基酸，其中所述的肽包含神经保护活性。
[0077]根据本发明的其他或备选方面，提供了分离的肽，其包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V6氨基酸序列的20个氨基酸，所述的肽包含神经保护活性。
[0078]根据一个实施方案，CD44V10氨基酸序列并非由以下序列构成:
[0079]DSTDRIPATIRNDVTGGRR(SEQ ID NO:49);或
[0080]NSNVNRSLS⑶QDTFHPSG(SEQ ID NO:50)。
[0081]根据另一个实施方案，CD44V6氨基酸序列并非由以下序列构成:
[0082]DSTDRIPATIQATPSSTTE(SEQ ID NO:51);或[0083]DSHSTTGTAGDQDTFHPSG(SEQ ID NO:52)。
[0084]包含在SEQ ID N0:49_52中所列的氨基酸序列的肽被考虑用于治疗神经退行性疾病，其在下文中进一步详细描述。
[0085]如本文所用，“CD44”是指如在RefSeq编号No:NM_000610.3中所列的在大量的哺乳动物细胞类型中表达的细胞表面蛋白质。根据具体的实施方案，CD44为人CD44基因。包含外显子1-5和16-20的标准的同工型(命名为⑶44)在大部分的细胞类型中表达。在图13中提供了基因结构，包含剪接变体⑶44V6和⑶44V10的基因结构。
[0086]如本文所用，术语“CD44V10”相当于SEQ ID N0:53(RefSeq编号 Νο:ΝΜ_000610.3，人⑶44抗原同工型I前体，NCBI参照序列)的氨基酸配合物537-604，并且通过SEQ ID NO: 2举例说明。
[0087]如本文所用，术语“CD44V6”相当于SEQ ID NO: 53 (RefSeq 编号 Νο:ΝΡ_000601.3，人⑶44抗原同工型I前体，NCBI参照序列)的氨基酸配合物386-427，并且通过SEQ ID NO: 8举例说明。[0088]如本文所用，短于“神经保护活性”是指防止神经细胞死亡。其作用可以采用保护神经元细胞(即，神经元)凋亡或退化的形式。合格地用于神经保护活性的测试包含细胞生存能力测试(例如χττ、ΜΤΤ)、形态学测试(例如细胞染色)、或者凋亡生物化学测试(例如Caspase3 活性等)。
[0089]根据具体的实施方案，⑶44V6氨基酸序列为人⑶44V6氨基酸序列。
[0090]根据具体的实施方案，⑶44V10氨基酸序列为人⑶44V10氨基酸序列。
[0091]根据另一个具体的实施方案，所述的肽由⑶44V6氨基酸序列(SEQ IDN0:2)构成。
[0092]尽管将本发明进一步简化为实践，但是本发明人揭示赋予神经保护的肽部分(氨基酸序列)包含核心序列X1-X2-S-H,其中X1和X2为酸性氨基酸。
[0093]如本文所用，短语“酸性氨基酸”是指在生理pH下为极性且带负电荷的天然存在的或合成的氨基酸。
[0094]根据具体的实施方案，X1包含谷氨酸。
[0095]根据具体的实施方案，X2包含天冬氨酸。
[0096]根据具体的实施方案，所述的肽包含SEQ ID N0:6或7的氨基酸序列。
[0097]根据另一个实施方案，CD44V6由CD44V6氨基酸序列(SEQ ID NO:2)构成。
[0098]根据另一个实施方案，所述的肽包含在SEQ ID NO:2-7, 16或17中所列的氨基酸序列。
[0099]如所提及的那样，本发明还考虑了⑶44V10的肽。因此，根据示例性实施方案，所述的肽包含在 SEQ ID N0:8-15, 18-46、或者具体为 SEQ ID N0:8_15, 18-38，39-42 或43-46中所列的氨基酸序列。
[0100]尽管将本发明进一步简化为实践，但是本发明人能够鉴别在赋予神经保护中为活性的⑶44V10的最小部分。
[0101]因此，根据示例性实施方案，⑶44V10肽包含式I的氨基酸序列:
[0102]X1-G-Y-T-S,
[0103]其中X1为谷氨酸或谷氨酰胺的任一者。[0104]下文将进一步详细描述，所述的肽的氨基酸序列包含拟肽，例如逆反模拟物(例如SEQ ID NO:45 或 46)。
[0105]根据示例性的实施方案，所述的肽在SEQ ID N0:26中列出。
[0106]根据示例性的实施方案，所述的肽在SEQ ID NO:26, 45或46中列出。
[0107]根据另一个具体的实施方案，所述的肽由⑶44V10氨基酸序列(SEQ ID NO:8)构成。 [0108]如本文所用，术语“肽”是指天然或合成的氨基酸的聚合物，涵盖了天然的肽(或者降解产物，以合成方式合成的多肽或重组多肽)和拟肽(例如翻转、反向或逆反的，通常为以合成方式合成的肽)，以及作为多肽类似物的类肽和半类肽(其可以具有例如修饰，从而使所述的肽在肌体中时甚至更稳定，或者更能够渗透到细胞中)。
[0109]此类修饰包含但不限于N-末端修饰、C-末端修饰、多肽键修饰，包含但不限于CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH, CF=CH、主链修饰、和残基修饰。用于制备拟肽化合物的方法是本领域公知的，并且在例如Quantitative DrugDesign, C.A.Ramsden Gd., Chapter 17.2, F.Choplin Pergamon Press (1992)中详述，所述的文献以引用方式并入本文，如同在本文中全部列出一样。下文将提供这方面的其他细节。
[0110]所述的多肽中的多肽键(-C0-NH-)可以被例如N-甲基化的键(-N(CH3)-C0_)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-), α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R为任何的烷基，例如甲基、碳胺键(-CH2-NH-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH=CH-)、反向酰胺键(-NH-C0-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-,其中R为天然存在于碳原子上的“正常的”侧链)。
[0111]这些修饰可以在沿着多肽链的任何键上以及甚至在多处(2-3)同时形成。
[0112]天然的芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以取代合成的非天然酸，例如苯基甘氨酸、naphthylelanine (Nol)、Phe的环甲基化的衍生物、Phe的卤化衍生物或者O-甲基-Tyr。
[0113]除了上文所述，本发明的多肽还可以包含一种或多种修饰的氨基酸、或者一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸、络合的碳水化合物等)。
[0114]如在以下说明书和权利要求书部分所用，术语“一种氨基酸”或“多种氨基酸”可以理解为包含:20种天然存在的氨基酸；这些氨基酸通常在体内经过翻译后修饰，包含例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不常见的氨基酸，包含但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包含D-和L-氨基酸(立体异构体)。
[0115]下表A和B列出了可以在本发明中使用的天然存在的氨基酸(表A)和非常规的或修饰的氨基酸(表B)。
[0116]表A
[0117]
MMI三字母缩写I单字母符号
丙氨酸Al^A
精氨酸A^iR
【权利要求】
1.一种治疗有需要的受试对象的神经退行性紊乱的方法，包括:向所述的受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的⑶44V10氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性，由此治疗所述的神经退行性紊乱。
2.一种治疗有需要的受试对象的神经退行性紊乱的方法，包括:向所述的受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V6氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性，由此治疗所述的神经退行性紊乱。
3.一种分离的肽，包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V10氨基酸序列的20个氨基酸，前提条件是所述的肽并非由SEQ ID NO:49或50所列的氨基酸序列构成，所述的肽包含神经保护活性。
4.一种分离的肽，包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V6氨基酸序列的20个氨基酸，所述的肽包含神经保护活性，前提条件是所述的肽并非由SEQID NO: 1、51或52所列的氨基酸序列构成。
5.一种药物组合物，包含作为活性试剂的分离的肽和药学上有效的载体，所述的分离的肽包含⑶44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过⑶44V10氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
6.一种用于治疗神经退行性紊乱的分离的肽，包含⑶44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V10氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
7.权利要求1、3 、5或6所述的方法或分离的肽，其中所述的肽包含式I所示的氨基酸序列:
X1-G-Y-T-S 其中X1为谷氨酸或谷氨酰胺的任意一者。
8.权利要求7所述的方法或分离的肽，其中所述的氨基酸序列包含拟肽。
9.权利要求8所述的方法或分离的肽，其中所述的拟肽包含逆反模拟物。
10.权利要求7-9所述的方法或分离的肽，其中所述的肽如同在SEQID NO:26、45或46中所列。
11.权利要求1、3、5或6所述的方法或分离的肽，其由⑶44V10氨基酸序列构成。
12.权利要求1、3、5或6所述的方法或分离的肽，其中所述的CD44V10氨基酸序列为人⑶44V10氨基酸序列。
13.权利要求2或4所述的方法或分离的肽，其中所述的CD44V6氨基酸序列为人CD44V6氨基酸序列。
14.权利要求2或4所述的方法或分离的肽，包含核心序列X1-X2-S-H,其中X1和X2为酸性氨基酸。
15.权利要求14所述的方法或分离的肽，其中X1包含谷氨酸。
16.权利要求14所述的方法或分离的肽，其中X2包含天冬氨酸。
17.权利要求2或4所述的方法或分离的肽，其中所述的肽由CD44V6氨基酸序列构成。
18.权利要求1、3、5或6所述的方法或分离的肽，其中所述的肽包含在SEQIDNO:8-15、18-45或46中所列的氨基酸序列。
19.权利要求1所述的方法或权利要求6所述的分离的肽，其中所述的肽包含在SEQIDNO:49或50中所列的氨基酸序列。
20.权利要求2或4所述的方法或分离的肽，其中所述的肽包含在SEQID NO:2-7,16或17中所列的氨基酸序列。
21.一种用于治疗神经退行性紊乱的分离的肽，包含⑶44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V6氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
22.权利要求1、2、3、4、6或21的任意一项所述的方法或分离的肽，其中所述的神经退行性紊乱选自:帕金森氏疾病、多发性硬化、ALS、多系统萎缩、阿尔茨海默氏疾病、中风、创伤性脑损伤、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆伴与染色体17相关的帕金森病、以及Pick疾病。
23.权利要求1、2、3、4、6或21的任意一项所述的方法或分离的肽，其中所述的神经退行性疾病为帕金森氏疾病。
24.权利要求1、2、3、4、6或21的任意一项所述的方法或分离的肽，其中所述的神经退行性疾病为阿尔茨海默氏疾病。
25.权利要求23-24所述的方法或分离的肽，其中所述的肽包含选自SEQID NO: 12, 15，17，19，24，26，31，32，34，36-38，43-46 中的氨基酸序列。
26.权利要求23所述的方法或分离的肽，其中所述的肽包含在SEQID NO:26或45中所列的氨基酸序列。
27.一种药物组合物，包 含作为活性试剂的分离的肽和药学上有效的载体，所述的分离的肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V6氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
28.权利要求1-27的任意一项所述的方法、分离的肽或药物组合物，其中所述的肽附着在细胞渗透试剂上。
29.权利要求1-27的任意一项所述的方法、分离的肽或药物组合物，其中至少一种所述的氨基酸为天然存在的氨基酸。
30.权利要求1-27的任意一项所述的方法、分离的肽或药物组合物，其中至少一种所述的氨基酸为合成氨基酸。
31.权利要求30所述的方法、分离的肽或药物组合物，其中所述的合成的氨基酸包含D-异构体。
32.权利要求28所述的方法、分离的肽或药物组合物，其中所述的分离的肽共价附着在所述的细胞渗透试剂上。
33.权利要求28所述的方法、分离的肽或药物组合物，其中所述的细胞渗透试剂为肽试剂。
34.权利要求1-27的任意一项所述的方法、分离的肽或药物组合物，其中所述的肽不超过20个氨基酸。
35.权利要求1-27的任意一项所述的方法、分离的肽或药物组合物，其中所述的肽的长度为5-10个氨基酸。
36.一种选择用于治疗神经退行性疾病的试剂的方法，所述的方法包括: (a)在神经毒剂存在下，使CD44V10/6肽与神经元细胞接触；以及(b)监测所述的神经元细胞的细胞死亡，其中与在所述的CD44V10/6肽缺乏下所述的神经元细胞的细胞死亡的量或时间相比，在所述的CD44V10/6肽存在下所述的神经元细胞的细胞死亡的量或时间降低指示用于治疗神经退行性疾病的试剂。
37.权利要求36所述的方法，其中所述的神经毒剂选自:淀粉样肽、谷氨酸盐、6-0HDA、MPTP 以及 MPP+。
38.权利要求1或2所述的方法，其中所述的给药包含皮下给药。
39.权利要求1或2所述的方法，其中所述的给药包含鼻内给药。
【文档编号】A61P25/28GK103648517SQ201280014793
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年3月22日 优先权日:2011年3月24日
【发明者】E·皮纳, N·齐萨佩尔 申请人:纽瑞姆制药（1991）有限公司