可由机体的脐带或脂肪组织分离的多能干细胞的制作方法
【专利摘要】本发明提供由机体的脐带或脂肪组织直接获得多能干细胞的方法和由该方法得到的多能干细胞，所述多能干细胞可以以SSEA-3的表达为指标由机体的脐带或脂肪组织分离、具有以下的所有性质、为SSEA-3阳性和CD105阳性：(i)端粒酶活性低或没有；(ii)具有分化为三胚层中任意胚层的细胞的能力；(iii)不显示肿瘤性增殖；以及(iv)具有自我复制能力(自我更新能力)。
【专利说明】可由机体的脐带或脂肪组织分离的多能干细胞
【技术领域】
[0001]本发明涉及机体的脐带或脂肪组织来源的多能干细胞。
【背景技术】
[0002]近年来，可贡献于组织再生的成人干细胞或组织干细胞受到关注。
[0003]作为由成体得到的具有分化能的细胞，有人报道了例如通过施加分化诱导得到的具有分化为骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等各种细胞的分化能的骨髓间充质细胞部分(MSC:骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell))(参照非专利文献I和2)。但是，骨髓间充质细胞部分是含有多个细胞种类的细胞群，施加诱导时的分化效率并不高。可以推测MSC中的一部分细胞承担分化，但上述细胞本身尚不明确，这成为人们长时间讨论的课题。另外，为了分化为特定的细胞，必须进行特定化合物的刺激或基因导入等，必须构建分化诱导系统。
[0004]作为成体来源的多能干细胞，更有人报道了由体细胞人工制作的iPS细胞(诱导多能干细胞)(参照专利文献1、专利文献2、非专利文献3等)。但是，iPS细胞的建立必须对作为间充质细胞的皮肤成纤维细胞部分进行使用特定物质的诱导操作，将特定的基因或特定的化合物导入体细胞。
[0005]还有人报道了可由机体组织分离的阶段特异性胚胎抗原-3 (SSEA-3)阳性多能干细胞，它是目前尚未了解的机体来源的干细胞(参照专利文献3和非专利文献4等)。
[0006]现有技术文献
专利文献1:日本特许第4183742号公报
专利文献2:日本特开2008-30 7007号公报
专利文献3:国际公开第W02011/007900号国际公开小册子
非专利文献 1:M.DEZAWA等人.，The Journal of Clinical Investigation, 113, 12, 1701-1710 页(2004)
非专利文献 2:M.DEZAWA等人?，SCIENCE, 2005 July 8, 309, 314-317页，(2005) 非专利文献 3:0kita K?等人?，SCIENCE, 2008 年11月7 日，322(5903)，949-953
页
非专利文献 4:Proc.Natl.Acad.Sci USA, 107(19):8639-43, 2010。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供:无需基因导入等人工操作，即可由机体的脐带或脂肪组织直接获得多能干细胞的方法，以及提供由该方法得到的多能干细胞。
[0008]本发明人由皮肤成纤维细胞和骨髓细胞分离了一种SSEA-3阳性、具有以往干细胞中未见到的抗原表达概况的干细胞，命名为Muse细胞(多谱系分化应激持久细胞)(国际公开第W02011/007900号国际公开小册子，Proc.Natl.Acad.Sci USA, 107(19):8639-43, 2010)。[0009]进一步进行研究，由脐带和脂肪组织分离Muse细胞，从而完成了本发明。
[0010]即，本发明如下所示。
[0011][I]多能干细胞，该多能干细胞可以以SSEA-3的表达为指标由机体的脐带或脂肪组织分离、具有以下的所有性质、为SSEA-3阳性和⑶105阳性:
(i)端粒酶活性低或没有；
(ii)具有分化为三胚层中任意胚层的细胞的能力；
(iii)不显示肿瘤性增殖；以及
(iv)具有自我复制能力(自我更新能力)。
[0012][2] [I]的多能干细胞，该多能干细胞可以以SSEA-3的表达为指标直接由机体的脐带或脂肪组织分离。
[0013][3] [I]或[2]的多能干细胞，该多能干细胞可由人脂肪来源的干细胞(HADSC)分离。
[0014][4] [1]-[3]中任一项的多能干细胞，该多能干细胞是通过将悬浮培养和贴壁培养组合而成的培养进行增殖。
[0015][5] [1]-[4]中任一项的多能干细胞，该多能干细胞为CD117阴性和CD146阴性。
[0016][6] [1]-[4]中任一项的多能干细胞，该多能干细胞为CD117阴性、CD146阴性、NG2 阴性、⑶34阴性、vffF阴性和⑶271阴性。
[0017][7] [1]-[4]中任一项的多能干细胞，该多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、 CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、SoxlO阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrpl阴性和Dct阴性。
[0018][8]细胞群，该细胞群含有[1]_[7]中任一项的多能干细胞。
[0019][9]以SSEA-3的表达为指标由脐带或脂肪组织分离[1]_[7]中任一项的多能干细胞并进行培养、增殖的方法。
[0020][10] [9]的方法，其中，该方法以以下的(i)-(v)的特性中至少I个特性为指标分离多能干细胞:
(i)CD105阳性；
(ii)CD117阴性和CD146阴性；
(iii)⑶117阴性、⑶146阴性、NG2阴性、⑶34阴性、vWF阴性和⑶271阴性；以及
(iv)CD34阴性、CDl17阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、SoxlO阴性、 Snail阴性、Slug阴性、Tyrpl阴性和Dct阴性。
[0021][11]分离[1]-[7]中任一项的多能干细胞的方法，该方法包含对脐带或脂肪组织来源的间充质细胞进行胰蛋白酶处理，回收存活的细胞。
[0022]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2011-076635号说明书和/或附图所记载的内容。
[0023]附图简述
图1是表示使用由人皮下脂肪组织的原代培养物建立的间充质细胞的抗SSEA-3抗体进行的FACS分析结果的图。A:无染色，B:只含第二抗体，C:SSEA-3染色的。
[0024]图2是对在RT-PCT中使用的引物的序列、以及分别在其中设定的阳性对照和阴性对照的样品进行说明的图。[0025]图3是表示由人皮下脂肪组织(A)以及由该组织建立的间充质细胞⑶的形态的图。
[0026]图4是表示市售的脂肪来源的间充质细胞(HADSC) (A)和由图3的皮下脂肪组织建立的HADSC(B)中SSEA-3的表达的图。
[0027]图5是表示采集自脂肪组织的Muse细胞来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形态的照片。图5A表示由市售的HADSC得到的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形态， 图5B表示从由皮下脂肪组织建立的HADSC得到的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形态。
[0028]图6是表示Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的分化的RT-PCR结果的照片。 图中，M-簇I表示由市售的HADSC得到的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的分化， M-簇II表示由建立的HADSC得到的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的分化。
[0029]图7是表示由市售的HADSC来源的Muse细胞I细胞形成的胚状体样细胞团 (M-簇)在明胶培养中显示分化为三胚层性的细胞的免疫染色图像的照片。NF(神经丝；外胚层)、CK7 (细胞角蛋白7 ;内胚层)、SMA (平滑肌肌动蛋白；中胚层)。
[0030]图8是表示由市售的HADSC来源的Muse细胞I细胞形成的胚状体样细胞团 (M-簇)中多能性因子的表达的照片。
[0031]图9是表示Muse细胞不具有肿瘤形成能力的照片。移植了 Muse细胞的睾丸经过 4个月后仍与正常睾丸相同大小，未见肿瘤形成的征兆，但移植了小鼠ES细胞的睾丸在8周时形成巨大的肿瘤。
[0032]图10是表示小鼠ES细胞来源的畸胎瘤的HE染色图像的照片。图中，I表示肠上皮(内胚层)、11表示表皮(外胚层)、111表示平滑肌(中胚层)。是移植8周后的照片。
[0033]图11是表示移植了 Muse细胞的小鼠睾丸的组织图像的照片。是移植4个月后的照片。正常的生精小管构成了组织，未见显示肿瘤形成的图像。
[0034]图12是显示分离的Muse细胞具有自更新能力的图。示出了脂肪来源的Muse细胞的例子。
[0035]图13是表示由脐带得到的间充质细胞的形态的图。
[0036]图14是表示由脐带得到的间充质细胞中的SSEA-3的表达的图。
[0037]图15是表示由分离自脐带的SSEA-3阳性细胞形成的Muse细胞来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形态。
[0038]图16是表示由脐带分离的多能干细胞一 Muse细胞的甲胎蛋白(a-FP;内胚层)、 GATA6 (内胚层)、MAP_2(外胚层)和Nkx2.5(中胚层)的RT-PCR分析结果的图。
[0039]实施发明的方案以下详细说明本发明。
[0040]本发明是可由机体的脐带或脂肪组织直接得到的多能(多潜能)干细胞或多能干细胞部分、以及分离该多能干细胞或多能干细胞部分的方法、以及由该方法得到的脐带或脂肪组织来源的多能干细胞或多能干细胞部分。本发明的多能干细胞称为Muse细胞(多谱系分化应激持久细`胞)。
[0041]本发明中，提及细胞部分时，是指以至少一定量含有要分离的细胞的细胞群。例如，多能干细胞部分可举出含有1%以上、10%以上、30%以上、50%以上、70%以上、90%以上或95%以上多能干细胞的细胞群，包含由培养多能干细胞得到的细胞团或将多能干细胞浓缩而成的细胞群。还可以将上述细胞部分称为实质上均匀的细胞部分。
[0042]脐带是哺乳动物的脐带。脐带由上皮、血管、血液、间充质组织构成，其中，间充质组织为脐带来源的间充质细胞的来源。
[0043]脂肪组织来源的多能干细胞可以从包含在脂肪组织中的间充质细胞一脂肪干细胞(脂肪来源的干细胞)(ADSC)中适当分离。ADSC可利用市售ADSC，例如Lonza社的人脂肪来源的干细胞，还可以按照公知的方法，由外科采集的皮下脂肪组织或皮下脂肪抽吸物获得脂肪干细胞部分。例如，可以使用根据Estes BT等人的方法(Estes BT.,等人.Nat Protoc.2010 Jul: 5 (7):1294-1311)由脂肪组织建立的间充质细胞。脂肪干细胞的细胞表面抗原为CD13阳性、CD29阳性、CD44阳性、CD73阳性、CD90阳性、CD105阳性、CD166阳性、 CD 14阴性、CD31阴性、CD45阴性。
[0044]也可以使用脐带、脂肪组织一起采集后的冷冻保存品。
[0045]哺乳动物没有限定，例如包含人、猴等灵长类，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等啮齿类，猫、 狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、雪貂等。由于可由机体的脐带或脂肪组织直接获得，本发明的多能干细胞可与胚胎干细胞(ES细胞)或胚胎生殖干细胞(EG细胞)明确区分开来。
[0046]细胞可由脐带或脂肪组织直接获得，这是指可由脐带或脂肪组织直接分离、或者可暂时培养来自这些组织的间充质细胞，再从中分离，而不经过外源基因或外源蛋白的导入或化合物的给予等的化合物处理等人工诱导操作即可获得。这里，外源基因并没有限定， 例如是指可使体细胞的核重编程的基因，例如0ct3/4基因等的Oct家族基因、Klf基因等的Klf家族基因、c-Myc基因等的Myc家族基因、Sox2基因等Sox家族基因。另外，外源蛋白可举出这些基因所编码的蛋白或细胞因子。此外，化合物例如可举出:诱导可使上述体细胞的核重编程的基因表达的低分子化合物或DMS0、发挥还原剂功能的化合物、DNA甲基化剂等。由于可由机体的脐带或脂肪组织直接获得，本发明的多能干细胞可与iPS(诱导多能干细胞)细胞和ES细胞明确地区分开来。本发明中，人工诱导操作不包含细胞培养、以细胞的表面标志为指标来分离细胞或细胞部分、将细胞暴露于细胞应激、以及对细胞给予物理性冲击。本发明的多能干细胞的特征还在于:无需诱导重编程或去分化即可获得。
[0047]多能干细胞是指具有多能性的细胞，具有以下特性。
[0048](I)表达 Nanog、0ct3/4、SSEA-3> PAR-4 和 Sox2 等多能性标志。
[0049](2)具有由I个细胞增殖、持续制作自身克隆的克隆性。
[0050](3)具有自我复制(自我更新)能力。
[0051](4)可体外和体内分化成三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)。
[0052](5)移植到小鼠的睾丸或皮下时，不形成肿瘤。
[0053](6)碱性磷酸酶染色呈阳性。[0054]本发明的多能干细胞具有多能性，由此可以与通常已知的神经干细胞或造血干细胞等成人干细胞、组织干细胞明确区分开来。另外，由于可以以具有多能性的单个或多个细胞的形式分离，本发明的多能干细胞可以与骨髓间充质(干)细胞、脂肪来源的间充质 (干)细胞等通常的间充质细胞部分明确区分开来。
[0055]本发明的多能干细胞进一步具有以下特性。
[0056](i)增殖速度比较缓慢，分裂周期为I天以上、例如1.2-1.5天。但不显示ES细胞或iPS细胞所显示的无限增殖。
[0057](ii)对于ES细胞或iPS细胞，在移植到免疫缺陷小鼠中时，在短期间内可见包含内胚层、中胚层和外胚层的要素的畸胎瘤的形成，与此相比，Muse细胞的特征是:半年以上也未形成畸胎瘤。
[0058](iii)通过悬浮培养，由I个细胞形成Muse来源的胚状体样细胞团。
[0059](iv)通过悬浮培养形成胚状体样细胞团，10-14天左右增殖停止。之后通过转移至贴壁培养进行再增殖。
[0060](V)增殖时伴随有不对称分裂。
[0061](vi)核型正常。
[0062](vii)端粒酶活性没有或低。这里，端粒酶活性没有或低是指，例如使用TRAPEZE XL端粒酶检测试剂盒(Millipore社)检测端粒酶活性时，无法检测出或低。端粒酶活性低例如是指具有与人成纤维细胞相同程度的端粒酶活性，或者与Hela细胞相比，具有1/5以下、优选1/10以下的端粒酶活性。
[0063](viii)关于甲基化的状态，对于由Muse细胞诱导的iPS细胞，Nanog和0ct3/4的启动子区域的去甲基化高。
[0064](ix)吞卩遼能力高。
[0065](x)不显示肿瘤性增殖。这里，不显示肿瘤性增殖是指进行悬浮培养时，如果达到一定大小的细胞团(簇)则增殖停止，不无限增殖。另外，即使移植到免疫缺陷小鼠的睾丸中也不形成畸胎瘤。上述(i)-(iv)等也与不显示肿瘤性增殖有关。
[0066]即，本发明的细胞例如是以下的多能干细胞。
[0067](A)多能干细胞，该多能干细胞是由机体的脐带或脂肪组织获得的细胞，无需向该细胞内导入化学物质、外源基因或外源蛋白即可直接获得。
[0068](B)上述(A)的多能干细胞，其中，无需诱导重编程或去分化即可获得。
[0069](C)上述(A)的多能干细胞，其中，在移植到睾丸中时，至少半年内不形成肿瘤。
[0070](D)上述(A)的多能干细胞，其不显示如ES细胞、iPS细胞那样的无限增殖。
[0071](E)多能干细胞，其为机体的脐带或脂肪组织来源的多能干细胞，是在对机体的脐带或脂肪组织的细胞用蛋白酶进行处理时存活的、对蛋白酶具有耐性的多能干细胞。
[0072]本发明的脐带或脂肪组织来源的多能干细胞一Muse细胞可以利用在Muse细胞表面大量表达的细胞表面标志进行分离，例如可以以SSEA-3的表达为指标进行分离。也将本发明的多能干细胞称为SSEA-3阳性Muse细胞。此外，Muse细胞表达间充质标志⑶105， 为SSEA-3阳性，为⑶105阳性。因此，可以以SSEA-3的表达为指标进行分离。还可以以 SSEA-3和⑶105两者的表达为指标进行分离。通过利用这些细胞表面标志，可以将本发明的多能干细胞以单细胞的形式分离，通过培养，可使分离的单细胞增殖。本发明也包含可通过与SSEA-3相当的标志由人以外的哺乳动物的机体组织分离的多能干细胞。
[0073]另一方面，Muse细胞是NG2、CD34、vFW(血管假性血友病因子)、c_kit (CD117)、 CD146、CD271 (NGFR)阴性。并且是 SoxlO、Snail、Slug、Tyrpl、Dct 阴性。
[0074]NG2、⑶34、vWF、⑶117、⑶146、⑶271等表面抗原是否为阴性、是否弱表达，是对这些抗原的抗体反应，使用显色酶、荧光化合物等标记的抗体，通过显微镜观察等测定细胞是否被染色，由此来确定。例如使用这些抗体进行细胞免疫染色，可以确定是否有表面抗原，还可以使用与抗体结合的磁珠来确定。还可以使用FACS或流式细胞仪，确定是否有表面抗原。流式细胞仪例如可以使用FACSAria (” > 于」” 'y 乂 >社制造)、FACS vantage (-外 >> 社制造)、FACS Calibur (-外 > r m > 乂
>社制造)、MACS (磁式细胞分离法)等。
[0075]关于SoxlO、Snai1、Slug、Tyrpl、Dct等的转录因子，也可以通过RT-PCR等方法研
究其表达。
[0076]这些表面抗原为阴性，是指在如上所述使用FACS进行分析时，不会以阳性细胞的形式被分选出，或者通过RT-PCR研究表达时，未见表达，即使有无法通过这些方法检测出的程度的表达，在本发明中也视为阴性。另外，虽然上述标志为阳性，但是与公知的造血干细胞等细胞同时测定，与这些阳性细胞比较，如果几乎未检出或者表达量显著低，则可视为阴性。
[0077]本发明的细胞可以根据这些细胞表面的抗原特性进行分离。
[0078]如上所述，Muse细胞可以以SSEA-3阳性为指标分离。例如，以SSEA-3阳性为指标由HADSC分离的细胞中40-70%细胞是可形成Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的Muse 细胞。此外，可以以SSEA-3和⑶105的共表达为指标进行分离，还可以以选自NG2、⑶34、 vWF(血管假性血友病因子)、c-kit (CD117)、CD146、CD271 (NGFR)、SoxlO、Snail、Slug、Tyrpl 和Dct的11个标志中的至少I个、例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或 11个标志的不表达为指标进行分离。例如可以以⑶117和⑶146的不表达为指标进行分离，还可以进一步以⑶117、⑶146、NG2、⑶34、vWF和⑶271的不表达为指标进行分离，还可以以上述11个标志的不表达为指标进行分离。
[0079]使用表面标志进行分离时，无需经过培养等，即可以直接由机体的脐带或脂肪组织分离I个或多个本发明的多能干细胞。
[0080]另外，除上述标志之外，本发明的多能干细胞或多能细胞部分还有其它特定因子闻表达的特征。
[0081]由机体的脐带或脂肪组织得到本发明的多能干细胞Muse细胞，进一步通过培养 Muse细胞得到Muse细胞来源的胚状体(EB)样细胞团。通过对在Muse细胞、作为Muse细胞的来源群的间充质细胞、Muse来源的胚状体样细胞团以及人ES细胞中表达的因子进行比较研究，可以了解在Muse细胞中高表达的因子。这里，因子包含基因转录产物、蛋白质、 脂质、糖。
[0082]在本发明的Muse细胞中，以下的18个因子高表达。
[0083](i) SSEA-3
(ii)v-fosFBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物
(iii)溶质载体家族16，成员6(—元羧酸转运蛋白7)
(iv)酪氨酸酶相关蛋白I
(V)钙通道，电压依赖的，P/Q型，a IA亚基
(vi)染色体16开放阅读框81
(vii)几丁质酶-3样I(软骨糖蛋白-39)
(viii)蛋白酶，丝氨酸，35
(ix)犬尿氨酸酶(L-犬尿氨酸水解酶)(X)溶质载体家族16，成员6 (—元羧酸转运蛋白7)
(xi)载脂蛋白E
(xii)突触结合蛋白样5
(xiii)几丁质酶-3样I(软骨糖蛋白-39)
(xiv)ATP结合盒，亚家族A(ABCl)，成员13 (XV)血管生成素样4
(xvi)前列腺素内过氧化物合酶2(前列腺素G/H合酶和环氧合酶)
(xvii)司腺I丐蛋白I
(xviii)含卷曲螺旋结构域的102B
本发明的多能干细胞或多能干细胞部分的特征是:上述因子的至少2个、3个、4个、5 个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个高表达， 可以以至少2个因子高表达作为指标进行分离。
[0084]以下的20个因子中，本发明的Muse细胞相对于人ES细胞的表达量之比高。
[0085](a)基质金属肽酶I (间质胶原酶)
(b)上皮调节蛋白
(c)几丁质酶-3样I(软骨糖蛋白-39)
(d)转录基因座(Transcribedlocus)
(e)几丁质酶-3样I(软骨糖蛋白-39)
(f)丝甘蛋白
(g)MRNA 全长插入片段 cDNA 克隆 EUR0IMAGE 1913076`(h)Ras和Rab相互作用因子2
(i)腔蛋白聚糖
(j) CLCA家族成员2,氯离子通道调节蛋白
(k)白细胞介素8
(I)类似于 L0C166075
(m)皮连蛋白(dermatopontin)
(n)EGF, Iatrophilin和含七跨膜结构域的I
(O)胰岛素样生长因子结合蛋白I
(P)溶质载体家族16,成员4 ( 一元羧酸转运蛋白5)
(q)丝甘蛋白
(r) gremlin 2,半胱氨酸结超家族，同源物(非洲爪蟾)
(s)胰岛素样生长因子结合蛋白5 (t)硫化物醌还原酶样(酵母)
本发明的多能干细胞或多能干细胞部分的特征是:上述因子的至少2个、3个、4个、5 个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或 20个高表达，可以以至少2个因子高表达作为指标进行分离。
[0086]此外，本发明的多能干细胞或多能干细胞部分可以是上述(i)-(xviii)的因子的至少2个与上述(a)-(t)的因子的至少2个同时高表达，可以以这些基因高表达作为指标进行分离。[0087]此外，本发明的多能干细胞或多能干细胞部分的特征是:表达多能性标志以外的气味受体(嗅觉受体)群以及趋化因子受体群的因子，即，为特定的气味受体或趋化因子受体阳性。
[0088]在本发明的多能干细胞或多能干细胞部分中表达的气味受体例如可举出以下22 个受体。
[0089]嗅觉受体,家族8，亚家族G，成员2 (0R8G2)；
嗅觉受体，家族7，亚家族G，成员3 (0R7G3)；
嗅觉受体，家族4，亚家族D，成员5 (0R4D5)；
嗅觉受体，家族5，亚家族AP，成员2 (0R5AP2)；
嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员4 (0R10H4)；
嗅觉受体，家族10，亚家族T，成员2 (0R10T2)；
嗅觉受体，家族2，亚家族M，成员2 (0R2M2)；
嗅觉受体，家族2，亚家族T，成员5 (0R2T5)；
嗅觉受体，家族7，亚家族D，成员4 (0R7D4)；
嗅觉受体，家族I，亚家族L，成员3 (0R1L3)；
嗅觉受体，家族4，亚家族N，成员4 (0R4N4)；
嗅觉受体，家族2，亚家族A， 成员7 (0R2A7)；
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，a激活活性多肽，嗅觉型(GNAL)；
嗅觉受体，家族6，亚家族A，成员2 (0R6A2)；
嗅觉受体，家族2，亚家族B，成员6 (0R2B6)；
嗅觉受体，家族2，亚家族C，成员I (0R2C1)；
嗅觉受体，家族52，亚家族A，成员I (0R52A1)；
嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员3 (0R10H3)；
嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员2 (0R10H2)；
嗅觉受体，家族51，亚家族E，成员2 (0R51E2)；
嗅觉受体，家族5，亚家族P，成员2 (0R5P2);和嗅觉受体，家族10，亚家族P，成员I (0R10P1)
作为在本发明的多能干细胞或多能干细胞部分中表达的趋化因子受体，可举出以下的 5个受体。
[0090]趋化因子(C-C基序)受体5 (CCR5)；
趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)；
趋化因子(C-C基序)受体I(CCRl)；
达菲血型，趋化因子受体(DARC);以及
趋化因子(C-X-C基序)受体7 (CXCR7)
本发明的多能干细胞或多能干细胞部分表达上述嗅觉受体的至少I个，或者表达上述趋化因子受体的至少I个。
[0091]通过这些气味受体或趋化因子受体和与受体结合的趋化因子的作用，作为本发明的多能干细胞的Muse细胞可以趋化至损伤组织并存活，根据情形分化。例如肝脏、皮肤、脊髓、肌肉损伤时，通过特定的趋化因子和在细胞表面表达的气味受体的作用，趋化至各组织中，存活，分化为肝脏(内胚层)、皮肤(外胚层)、脊髓(外胚层)、肌肉(中胚层)细胞，可以使组织再生。
[0092]并且,在富含本发明的多能干细胞Muse细胞的富Muse细胞部分中，可见Rexl、 Sox2、KLF-4、c-Myc、DPPA2、ERAS、GRB7、SPAG9、TDGFl 等的表达升高，在 Muse 细胞的细胞团中，可见 DAZL、DDX4、DPPA4、Stella、Hoxbl、PRDM1、SPRY2 等的表达升高。
[0093]另外，在本发明的多能干细胞或多能干细胞部分中，未见作为造血干细胞标志的 ⑶34和⑶117的表达或表达极低。
[0094]此外，通过对机体的脐带或脂肪组织的细胞施加细胞应激，回收存活的细胞，可以提高本发明的多能干细胞含有率。这里，细胞应激是指外部应激，是指通过蛋白酶处理、低氧条件下的培养、低磷酸条件下的培养、血清饥饿状态下的培养、糖饥饿状态下的培养、放射线暴露下的培养、热休克暴露下的培养、有害物质存在下的培养、活性氧存在下的培养、 机械刺激下的培养、压力处理下培养等来暴露于应激。其中，优选蛋白酶处理、即，蛋白酶存在下的培养。蛋白酶没有限定，可以使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶，胃蛋白酶等的天冬氨酸蛋白酶，木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等的半胱氨酸蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等的金属蛋白酶，谷氨酸蛋白酶、N-末端苏氨酸蛋白酶等。将蛋白酶添加到培养中时的添加浓度并没有限定，通常可 以以在培养皿等中培养的贴壁细胞剥离时所使用的浓度使用。本发明的多能干细胞Muse细胞可以称作对上述外部应激具有耐性的干细胞、例如对胰蛋白酶具有耐性的细胞。
[0095]经受了上述各种应激的组织的细胞大部分死亡，存活的细胞中含有本发明的多能干细胞Muse细胞。对细胞施加应激后，必须除去死细胞，但使用蛋白酶时，这些死细胞可被蛋白酶的作用分解。
[0096]还可以在对细胞施加应激后再对细胞给予物理冲击，除去容易破碎的细胞。物理冲击例如可通过剧烈的吸移液、剧烈搅拌、涡旋等给予。
[0097]对细胞施加细胞应激、根据需要给予物理冲击后，将细胞群离心，以沉淀的形式获得并回收存活的细胞，由此可提高本发明的多能干细胞Muse细胞的含有率。还可以以下述表面标志为指标，进一步由这样得到的细胞分离本发明的多能干细胞或多能干细胞部分。
[0098]作为一个例子，就对这些细胞进行胰蛋白酶处理的方法进行说明。此时的胰蛋白酶浓度没有限定，例如在贴壁细胞的常规培养中，只要是以将贴壁于培养容器的贴壁培养物剥离时所使用的浓度范围使用即可，可例举0.1-1%，优选0.1-0.5%。例如，将含有10-50 万个细胞的、机体的脐带或脂肪组织来源的细胞在5ml上述浓度的胰蛋白酶溶液中进行孵育，由此可以暴露于外部应激。胰蛋白酶处理时间是5-24小时，优选5-20小时左右。本发明中，将8小时以上胰蛋白酶处理、例如8小时或16小时的处理称为长时间胰蛋白酶处理。
[0099]胰蛋白酶处理后，优选如上所述，通过吸移液、搅拌、涡旋等施加物理冲击。这是为了破坏除去已死亡的细胞或即将死亡的细胞。
[0100]胰蛋白酶处理后的悬浮培养时，为了防止细胞之间的聚集，例如优选在甲基纤维素凝胶等凝胶中进行孵育。另外，为了防止细胞与培养容器的贴壁、保持悬浮状态，优选用聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)等涂布容器。
[0101]将暴露于外部应激的细胞通过离心收集，进行悬浮培养，则形成细胞团(细胞簇)。该细胞团的大小是直径25 ilm至150 ilm左右。本发明的多能干细胞(Muse细胞)在暴露于该外部应激并存活的细胞群中是以浓缩的状态含有。将该细胞群称为富Muse细胞部分(富Msue群)。富Muse细胞部分中Muse细胞的存在比例根据应激处理的方法而不同。
[0102]如上所述，本发明的多能干细胞或多能干细胞部分在施加应激后也存活，这显示了本发明的多能干细胞或多能干细胞部分的应激耐性。
[0103]机体的脐带或脂肪组织来源的细胞的培养中使用的培养基、培养条件可采用在常规的动物细胞的培养中使用的培养基、培养条件。还可以使用公知的干细胞培养用培养基。 培养基中可以适当添加胎牛血清等血清或青霉素、链霉素等抗生素以及各种生理活性物质。
[0104]并且，本发明也包含作为本发明的可由机体的脐带或脂肪组织直接获得的多能干细胞的衍生细胞或诱导细胞的多能干细胞。衍生细胞或诱导细胞是指培养上述多能干细胞得到的细胞或细胞群、或者对上述多能干细胞进行外源基因的导入等人工诱导操作得到的细胞，也包含后代细胞。本发明时报道的iPS细胞是通过向皮肤成纤维细胞等的机体组织的分化细胞中导入外源基因等来进行重编程的结果，被称为是被诱导成多能干细胞的细胞，而对本发明的可由组织直接获得的、已经具有多能干细胞的性质的细胞进行外源基因导入等人工诱导操作所得到的细胞可与iPS细胞区分开来。
[0105]通过将本发明的多能干细胞悬浮培养，可得到胚状体样细胞团，本发明也包含该胚状体样细胞团和胚状体样细胞团中所含的细胞。胚状体是将本发明的多能干细胞悬浮培养，由此形成细胞团的形式。此时，本发明中，可将通过培养本发明的多能干细胞得到的胚状体称为Muse细胞来源的胚状体样细胞团(也称为M簇)。用于形成胚状体样细胞团的悬浮培养方法可举出:使用含有甲基纤维素等的水溶性聚合物的培养基进行的培养 (Nakahata, T?等人?，Blood 60, 352-361 (1982))或悬滴培养(Keller, J.Physiol.(Lond) 168:131-139, 1998)等。本发明也包含由上述胚状体样细胞团进行自我更新得到的胚状体样细胞团、以及包含在胚状体样细胞团中的细胞和多能干细胞。这里，自我更新是指培养胚状体样细胞团中所含的细胞，再次形成胚状体样细胞团。自我更新可以反复进行 1-多个周期。本发明还包含由上述任意的胚状体样细胞团以及由包含在胚状体样细胞团中的细胞分化所得的细胞和组织。
[0106]本发明不仅包含Muse细胞，也包含将Muse细胞浓缩而成的细胞群、使Muse细胞增殖而成的细胞群、使Muse细胞分化而成的细胞群，还包含含有Muse细胞或Muse细胞来源的细胞的研究用试剂盒，细胞芯片、治疗用装置。[0107]本发明的多能干细胞具有多能性，可分化为所有的组织。该多能干细胞或多能细胞部分可以用于再生医疗等。例如可用于各种组织、各种器官等的再生。具体可举出皮肤、 脑脊髓、肝脏、肌肉等。通过将本发明的多能干细胞或多能干细胞部分直接或给予受到损伤或损害的组织、器官等的附近，该多能干细胞侵入该组织、器官内，分化成该组织特有的细胞，可贡献于组织、器官的再生、重建。还可以通过静脉给予等进行全身给予。这种情况下， 该多能干细胞例如通过归巢等定向于受损的组织或器官，到达并侵入该处，然后分化为该组织或器官的细胞，可贡献于组织、器官的再生、重建。
[0108]给予例如可通过皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射等非口服给予或口服给予，或者通过对胚胎的子宫内注射等进行。可以局部给予也可以全身给予。局部给予例如可利用导管进行。给予量可根据要再生的器官、组织的种类或尺寸适当确定。
[0109]要再生的器官并没有限定，包含骨髓、脊髓、血液、脾脏、肝脏、肺、肠道、眼、脑、免疫系统、循环系统、骨、结缔组织、肌肉、心脏、血管、胰脏、中枢神经系统、末梢神经系统、肾脏、膀胱、皮肤、上皮附属器、乳房-乳腺、脂肪组织、角膜、以及包含口腔、食道、阴道、肛门在内的粘膜等。另外作为治疗对象的疾病可举出:癌症、心血管疾病、代谢疾病、肝脏疾病、 糖尿病、肝炎、血友病、血液系统疾病、脊髓损伤等的退行性或外伤性神经疾病、自身免疫疾病、遗传缺陷、结缔组织疾病、贫血、感染症、移植排斥、贫血、炎症、皮肤或肌肉的损伤等。
[0110]细胞可以与作为药学上可接受的基料一起给予。该基料例如是由胶原等制成的生物相容性高的物质、或由生物降解性的物质制成，可以制成颗粒状、板状、筒状、容器状等形状，可以将细胞与该基料结合或收纳于该基料中进行给予。
[0111]还可以对本发明的多能干细胞进行体外分化诱导，进一步使用分化的细胞构建组织，将该分化的细胞或该组织进行移植。本发明的多能干细胞不形成肿瘤，因此，即使所移植的上述分化的细胞或该组织中含有未分化状态的本发明的多能干细胞，癌化的可能性也低，安全。在这些再生医疗中，为了避免移植的细胞或组织被受体排斥，优选从要接受再生医疗的患者采集中胚层组织或间充质组织等，从该组织分离本发明的多能干细胞或多能细胞部分并利用。此外，可将本发明的多能干细胞或多能干细胞部分用于病因为组织退化或功能缺陷的疾病的治疗。这种情况下，例如可以将本发明的多能干细胞或多能干细胞部分离体浓缩，增殖，或者使其 分化，再返回体内，例如可以将多能干细胞分化为特定的组织的细胞，再将该细胞移植给要治疗的组织。还可以通过细胞的移植进行原位细胞治疗。这种情况下，对象细胞的例子可举出:肝脏细胞、神经细胞或神经胶质细胞等神经系统细胞，皮肤细胞、骨骼肌细胞等肌细胞，还可以使本发明的多能干细胞分化为这些细胞并移植，进行原位治疗。通过该治疗,可治疗例如帕金森病、脑梗塞、脊髓损伤、肌肉退行性疾病等。本发明的多能干细胞不形成肿瘤，因此，即使用于这样的治疗，癌化的可能性也低，安全。
[0112]通过使本发明的多能干细胞分化,形成血液或血液成分,可以离体、体外形成血液或血液成分，血液成分可举出红细胞、白细胞、血小板等。可以将这样形成的血液或血液成分用于自体输血或异体输血。
[0113]如上所述，将本发明的多能干细胞或多能干细胞部分用于治疗时，可以离体、体内或体外进行分化。本发明的多能干细胞例如可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓间质、骨骼肌、平滑肌、心肌、眼、内皮、上皮、肝脏、胰脏、造血、神经胶质、神经细胞、少突胶质细胞等。本发明的多能干细胞的分化可在分化因子的存在下通过培养实现。 分化因子可举出:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、二甲基亚砜(DMSO)和异丙肾上腺素；或者成纤维细胞生长因子4 (FGF4)、肝细胞生长因子(HGF)等。 本发明也包含由本发明的多能干细胞分化的细胞。
[0114]将本发明的多能干细胞用于治疗时，可以导入编码蛋白质性抗癌物质或生理活性物质等的基因。由此，本发明的多能干细胞也具有治疗药物的递送功能。上述物质例如可举出抗血管生成药。
[0115]本发明还包含细胞移植治疗用材料或细胞移植治疗用组合物或者再生医疗用材料或再生医疗用组合物，其含有Muse细胞、由Muse细胞形成的胚状体样细胞团以及由Muse 细胞或上述胚状体样细胞团分化得到的细胞或组织、器官。该组合物除Muse细胞、由Muse细胞形成的胚状体样细胞团以及由Muse细胞或上述胚状体样细胞团分化得到的细胞或组织、器官之外，还包含药学上可接受的缓冲液或稀释液等。
[0116]并且，可从患者的脐带或脂肪组织采集本发明的Muse细胞，分离Muse细胞，使用该Muse细胞用于各种诊断。例如可从Muse细胞采集患者的基因，获得基因信息，进行反映了该信息的正确的诊断。例如，使受试者的细胞来源的Muse细胞分化，由此可以获得与受试者具有相同基因背景等性质的各组织、器官的细胞，因此，关于疾病的诊断或病态分析、 药物的效果或副作用的诊断等，可以结合各受试者的性质进行适当的诊断。即，Muse细胞、 由Muse细胞形成的胚状体样细胞团以及由Muse细胞或上述胚状体样细胞团分化得到的细胞或组织、器官可用作诊断用材料，例如本发明包含如下诊断方法:从受试者分离Muse细胞，使用该Muse细胞或从Muse细胞分化得到的、与受试者具有相同基因背景的组织或器官，诊断受:试者的疾病等。
[0117]另外，通过使Muse细胞分化，可以大量获得体细胞，因此可以进行疾病机理探明等的基础研究、治疗药物开发、药物效果或毒性相关的筛选、药物评价等。即，可以将Muse 细胞、由Muse细胞形成的胚状体样细胞团以及由Muse细胞或上述胚状体样细胞团分化得到的细胞或组织、器官用作药物评价或药物筛选的材料。例如本发明包含下述方法:使 Muse细胞分化、增殖，获得体细胞，将候选药物给予该体细胞，研究体细胞的应答，由此进行药物的筛选或药物评价。
[0118]另外，通过构建将各种(例如各种HLA型的)Muse细胞文库化得到的Muse细胞银行，可以根据需要提供上述利用Muse细胞的场合下的细胞，可实现这种体制，例如除上述所列举的目的之外，还可以提供用于紧急要求的细胞移植治疗的无(少)排斥反应的细胞等。即，本发明包含如下方法:将具有各种基因特性的Muse细胞分离，收集，由此来制作具有不同的基因特性的Muse细胞的文库即Muse细胞银行。另外，不仅Muse细胞,还可得到由Muse细胞形成的胚状体样细胞团以及由Muse细胞或上述胚状体样细胞团分化得到的细胞或组织、器官，构建文库或银行。本发明中，得到这些由Muse细胞形成的胚状体样细胞团以及由Muse细胞或上述胚状体样细胞团分化得到的细胞或组织、器官，文库或银行也称作细胞文库或细胞银行。本发明包含如此制备的细胞文库或细胞银行。该细胞文库或细胞银行例如由收纳具有具不同的遗传特性的细胞等的多个管等容器组成，该细胞可以冷冻。例如，在受试者中，移植组织或器官或者需要再生的情况下，可以根据遗传背景等从上述细胞文库或细胞银行选择适合的细胞，使用该细胞对上述受试者进行移植或再生治疗。
[0119]本发明包含治疗方法，该治疗方法包含为了疾病的治疗，将治疗有效量的本发明的多能干细胞或该细胞部分或该细胞来源的衍生细胞或诱导细胞给予需要治疗的患者。这里，有效量例如可以以所给予的细胞数来确定，可根据疾病的种类或严重程度适当确定。上述治疗方法中，本发明的多能干细胞不形成畸胎瘤，因此在患者中不会形成畸胎瘤。另外， 给予自身细胞来源的Muse细胞时，无需使患者由于放射线照射或化学疗法等的处置而骨髓机能受损，但使用非自身细胞的Muse细胞时，则可以进行上述处置。
[0120]并且，Muse细胞可成为iPS细胞(诱导多能干细胞)的来源。以Muse细胞为来源的iPS细胞的制作效率与以其它细胞(例如未以SSEA-3表达为指标分离的皮肤成纤维细胞)为来源时相比，效率高很多(至少25倍以上)。
[0121]通过向Muse细胞导入特定基因或者导入特定的化合物等，使细胞质变化，由此可以制备iPS细胞。对于细胞质的变化，包含重编程、无限增殖能力或肿瘤形成能力在内，可采用目前已知的方法或者未来会确立的所有的方法。
[0122]例如按照日本特许4182742号的记载，可将基因导入Muse细胞，或者按照图27的记载，可以由Muse细胞确立iPS细胞。另外，除图27所述方法之外，可提及可导入化学物质、外源基因或外源蛋白，建立iPS细胞。由Muse细胞建立iPS细胞，这例如可以按照后述实施例所述的方法进行。
[0123]可以将如此由Muse细胞得到的iPS细胞称为Muse来源的iPS细胞(Muse-1PSC)， 本发明也包含该Muse来源的iPS细胞。Muse来源的iPS细胞可以称为Muse细胞来源的、 具有无限增殖性的多能干细胞。
[0124]以下根据实施例具体说明本发明，但本发明并不限于下述实施例。
[0125]实施例1由脂肪组织分离多能干细胞方法和材料
1.细胞材料
使用市售的培养细胞和由人皮下脂肪组织原代培养物建立的2种间充质细胞作为人脂肪组织来源的间充质细胞。市售的细胞使用Lonza社的人脂肪来源的干细胞(HADSC) (Lot.7F4308、7F4089和7F4205三批次)，在Dulbecco改良Eagle培养基-高葡萄糖 [DMEM,液体(IX); Invitrogen Cat.11965-092]中添加 15%(vol/vol) FBS[ES 细胞级; HyClone]、0.lmg/mL 硫酸卡那霉素[液体(100X) ；Invitrogen Cat.15160-054],在 37°C 下进行培养。
[0126]由皮下脂肪组织建立脂肪组织来源的间充质细胞，是使用经过患者的同意，由日本国国立大学法人东北大学病院皮肤科提供的脂肪组织，将Estes BT等人的方法(Estes BT.，等人.Nat Protoc.2010 Jul: 5 (7): 1294-1311)部分改良而进行。首先将无菌采集的皮下脂肪组织细细切断。在磷酸缓冲盐水[PBS，不含氯化镁、氯化钙]中加入lmg/mL胶原酶 I 型[IOOmg ；fforthington Biochemical, Cat.LS004194] > 1% (wt/vol) BSA [nacalai, Cat.15111-45]，制作酶溶液。将切断的脂肪组织与等量的酶溶液在50mL离心管中混合， 在37°C下反应2小时，将细胞外基质消化。2小时后，在300g下离心5分`钟，吸取沉淀物与悬浮物之间的液相，使用IOOiim细胞滤网(cell strainer),从沉淀物和悬浮物中除去未消化的细胞外基质。然后加入DMEM[15%(vol/vol)FBS、0.lmg/mL硫酸卡那霉素]，在300g 下离心5分钟，除去上清，将沉淀悬浮于培养基中进行接种。接种24小时后更换培养基。 市售的细胞、建立的细胞均每隔2天进行培养基更换，在达到90%细胞汇合时，按照1:2继代。对于小鼠ES细胞(TT2细胞)，使用在DMEM中添加了 15%(Vol/Vol) FBS[ES细胞级； HyClone] >0.lmg/mL 硫酸卡那霉素[液体(100X) ；Invitrogen, Cat.15160-054]、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液[NEAA,液体 IOmM(IOOX) ;Invitrogen，Cat.11140-050]、ImM丙酮酸钠溶液[SP，液体 IOOmM(IOOX) ；Invitrogen Cat.11360-070]、1000U/mL 白血病抑制因子[LIF，ESGR0]U00uM 2-巯基乙醇的培养基，使用经丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为饲养细胞。MEF使用由12.5日龄C57BL/6小鼠胚胎制作的MEF。
[0127]2.FACS
对于作为1.的人脂肪组织来源的间充质细胞的市售培养细胞与由人皮下脂肪组织的原代培养物建立的间充质细胞进行FACS分析。用于FACS的细胞是在达到100%细胞汇合之时使用。首先从培养皿中除去培养基，加入3mL胰蛋白酶-EDTA，扩散至细胞全体后，在 37°C下孵育10分钟。确认细胞确实从培养皿上剥落，加入ImL FBS，用移液管抽打使细胞形成单细胞的状态，然后回收，计测细胞数，使用FACS缓冲液[0.02M PBS,0.5%(wt/vol) BSA、2mM EDTA]悬浮细胞，使得每100 u L含有100万个细胞，用10%灭活人血清孵育20分钟(冰上)，进行FcR封闭。然后使用抗SSEA-3抗体(l:50，MillipOre)作为第一抗体，使用FITC标记抗大鼠IgM抗体(1: 100, Jackson Immunoresearch)作为第二抗体,分别孵育I 小时(冰上)，进行染色。染色后，使用 Special Order Research Products FACS AriaI I )(Becton Dickinson)进行分析和分选。结果如图1所示。图1表示由人皮下脂肪组织的原代培养物建立的间充质细胞的结果。此时，调节仅第二抗体的样品(图1B)和用SSEA-3 染色的样品(图1C)的峰，使其与未染色样品(图1A)的FITC的峰位于相同位置。然后， 将与未染色样品大致相同的FITC强度的细胞群作为非Muse细胞(图1C的P6区域)，将与仅第二抗体的样品相比FITC强度高的细胞群作为Muse细胞(图1C的P3区域)回收。[0128]3.单细胞悬浮培养
按照上述2.的方法，使用FACS，从作为1.的人脂肪组织来源的间充质细胞的市售细胞和由人皮下脂肪组织的原代培养物建立的间充质细胞中进行分选，将分选的细胞用台盼蓝染色，计测活细胞数。进行有限稀释，使每孔分别只有I个细胞，使用涂布了 poly-HEMA的 96孔培养皿，在a MEM中添加15%(vol/vol)FBS，悬浮、接种。悬浮培养7_10天，计测Muse 来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形成率。
[0129]4.Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的体外分化
用0.1%明胶涂布培养皿，在该24孔培养皿中加入300 u 1 a MEM[15%(vol/vol)FBS]， 将在3.的单细胞悬浮培养中培养了 7-10天的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)移入， 使每孔有I个细胞团(簇)。数小时后追加200 Ul培养基。培养1-2周，通过免疫细胞化学或RT-PCR进行分析。
[0130]5.免疫细胞化学
将3.所得的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)用4%(vol/vol)低聚甲醛/0.0lM PBS固定，用0.C.T化合物包埋，制作冷冻切片，用于免疫染色。对于在明胶涂布的盖玻片上分化的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)，用4%(V01/V01)低聚甲醛/0.0lM PBS将盖玻片和细胞固定，用于免疫染色。使用针对SSEA-3[1:50，Millipore], Nanog (1:100, Millipore)、0ct3/4[1:100，Santa Cruz]、Sox2(1:1000，Millipore)、PAR4(1:100，Santa Cruz)、平滑肌肌动蛋白(SMA, 1:100, Lab Vision)、神经丝 _M(1:100，Millipore)、细胞角蛋白7(CK7，1:100, Millipore)的抗体作为第一抗体，将这些第一抗体用FITC-、 Alexa-488-或 Alexa-568-标记抗兔 IgG、抗小鼠 IgG、抗小鼠 IgM 抗体(1:500，Molecular Probes)检测。
[0131]6.RT-PCR
使用Nucleo Spin RNA XS (Macherey-Nagel),由按照4.所述的方法体外分化的Muse 来源的胚状体样细胞团(M-簇)提取总RNA。使用Super Script VILO cDNA合成试剂盒(Invitrogen),将提取的总RNA反转录,得到cDNA。在PCR中使用Ex Taq DNA聚合酶 (TaKaRa Bio, Inc.)，确认甲胎蛋白(AFP，内胚层的标志)、GATA6 (内胚层的标志)、微管相关蛋白-2(MAP-2，外胚层的标志)、Nkx2.5(中胚层的标志)的表达。所使用的各种引物序列如图2所示。使用全人胚、人胎肝、成人脑、成人肝作为对照，详细如下所示。
[0132]7.移植入免疫缺陷小鼠睾丸
将按照2.的方法使用FACS分选的SSEA-3阳性细胞用台盼蓝染色，计测活细胞数。计测后，用PBS悬浮，使浓度为1.5 X IO5细胞/ ii L，将I X IO5个细胞移植到8周龄的CB17/ Icr-Prkdc scid/CrlCrlj (SCID)雄性的单侧睾丸。给予I X IO6个小鼠ES细胞作为阳性对照，给予PBS作为阴性对照。SSEA-3阳性细胞组在移植后4个月进行灌流固定，小鼠ES细胞、PBS组是在移植8周后进行灌流固定。
[0133]8.自我更新能力(自我复制能力)的研究
将按照2.的方法用FACS分选的、从人皮下脂肪组织的原代培养物建立的间充质细胞中分离的SSEA-3阳性细胞，按照4.所述的单细胞悬浮培养，结果得到第I代Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)，在涂布了 0.1%明胶的培养皿中加入300 ill a MEM (15% (vo I/vol) FBS)，进行贴壁培养，使细胞增殖。在增加的细胞中添加胰蛋白酶-EDTA，剥离，再次进行单细胞悬浮培养，形成第二代Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)。方法概要如图12所示。
[0134]结果
本实施例中，作为人脂肪组织来源的间充质细胞，使用市售细胞和本发明人由人皮下脂肪组织建立的间充质细胞两种来源。本实施例的方法中，对由体积15.4cm3的人皮下脂肪组织(图3A)得到的间充质细胞进行16天培养，作为人脂肪组织来源的间充质细胞(图 3B)，可获得1960万个建立的细胞。
[0135]FACS分析的结果确认，在各细胞群中均存在可以SSEA-3为标志进行分离的Muse 细胞。还确认:各细胞群中，在市售的细胞中存在4.3 ±0.36%、在由原代培养物建立的细胞中存在7.3±0.37%的Muse细胞(图4)。图4A表示市售的HADSC的结果，图4B表示由人皮下脂肪组织建立的HADSC中的SSEA-3的表达。
[0136]Muse细胞通过进行悬浮培养，由I个细胞形成类似人ES细胞的胚状体的、Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)。因此，回收SSEA-3阳性的Muse细胞和SSEA-3阴性的非Muse 细胞，分别进行单细胞悬浮培养。结果，只在Muse细胞中确认了:由I个细胞形成Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)。未由非Muse细胞形成。由市售的HADSC分离的SSEA-3阳性细胞中，有65-66%形成了簇，由从人皮下脂肪组织建立的HADSC分离的SSEA-3阳性细胞中，有44.2%形成了簇。图5表示Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形态。图5A表示从市售的HADSC得到的、Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形态，图5B表示由从人皮下脂肪组织建立的HADSC得到的、Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形态。
[0137]将形成的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)在涂布了明胶的培养皿上进行体外培养，通过RT-PCR确认微管相关蛋白-2(MAP-2，外胚层)、GATA6 (内胚层)、甲胎蛋白 (AFP,内胚层)、Nkxr2.5(中胚层)的表达，还确认=HADSC来源的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)自发分化为三胚层的细胞(图6)。图6中，M-簇I表示由市售的HADSC得到的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的分化,M-簇II表示由从人皮下脂肪组织建立的 HADSC获得的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的分化。
[0138]此外也证明，在使用神经丝_M(NF，外胚层神经)、细胞角蛋白7(CK7，内胚层胆道系统)、平滑肌肌动蛋白(SM，中胚层平滑肌)的抗体进行的免疫染色中，HADSC来源的 Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)分化为三胚层的细胞(图7)。图7中，椭圆形中可见的蓝色反应表示被DAPI染色的细胞的核，红色荧光表示抗NF抗体或抗SMA抗体，绿色荧光表示抗CK7抗体。
[0139]也确认:形成的Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)表达Nanog、0ct3/4、PAR4、 Sox2、SSEA-3、碱性磷酸酶(ALP)等多能干细胞标志(图8)，由此证明，由HADSC分离的 Muse细胞表达多能性标志，并且可分化为三胚层的细胞，因此具有多能性。图8中，左侧图的DAPI染色图像表示核，染为蓝色，中间图自上而下是使用针对Nanog、0ct3/4、PAR4、Sox2 和SSEA-3的抗体的免疫染色图像，这些标志的存在位置被染为绿色。右侧图是DAPI染色图像与各抗体的染色图像重叠而成的图像。最下部图的ALP表示碱性磷酸酶染色图像中的红色阳性的反应。
[0140]在对小鼠睾丸的细胞移植中，小鼠ES细胞中是在移植8周时形成畸胎瘤，与此相 t匕，Muse细胞在移植后即使经过4个月也未形成畸胎瘤，由此证明，HADSC来源的Muse细胞没有肿瘤性(图9)。图9中，A表示对照(完整，未进行移植或其它)的结果以及移植了 Muse细胞(4个月)的结果，B表示移植了小鼠ES细胞(8周)和给予PBS (8周)的结果。
[0141]还通过HE染色图像确认了小鼠ES细胞形成了含有三胚层的组织的畸胎瘤(图10)。图10中，I表示消化道(内胚层)，11表示神经系统(外胚层)，III表示平滑肌(中胚层)。而移植了 Muse的睾丸中，经HE染色也确认未形成肿瘤，是正常的生精小管(图11)。
[0142]按照方法的8.所示的方法进行自我更新能力研究时，第I代Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形成率为35.5%,第2代Muse来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形成率为29.7% (图12)。该结果显示，所得Muse细胞具有自我更新能力。
[0143]实施例2由人脐带分离多能干细胞
按照与实施例1的1.-3.所述方法同样的方法，以SSEA-3表达为指标从人脐带分离 Muse细胞。
[0144]以下更具体说明。脐带使用经患者同意取得的脐带。将脐带消毒后，除去血管或表面的上皮，只取出其中的间充质组织，将它们切成5_左右方形。将切细的脐带间充质组织贴壁培养，由此得到间充质细胞。将这些细胞与脂肪来源的间充质细胞时同样地，通过 FACS采集SSEA-3阳性的Muse细胞，通过单悬浮细胞(单细胞悬浮培养)制作胚状体样细胞团，通过RT-PCR或免疫染色进行分析。图13表示由脐带获得的间充质细胞的形态。图 14表示由脐带获得的间充质细胞中SSEA-3的表达。这些结果是按照与实施例1之2.所述方法同样的方法进行FACS分析的结果。另外，图15表示由从脐带分离的SSEA-3阳性细胞(Muse细胞)形成的Muse细胞来源的胚状体样细胞团(M-簇)的形态。此外，图16表示按照实施例1之6.所述方法同样的方法，通过RT-PCR测定的甲胎蛋白(AFP，内胚层的标志)、GATA6 (内胚层的标志)、微管相关蛋白(MAP-2，外胚层的标志)、Nkx2.5 (中胚层的标志)的表达。
[0145]已确认:在人脂肪组织来源的间充质细胞中也存在多能干细胞Muse细胞。Muse细胞表达多能干细胞标志，具有可由I个细胞分化为三胚层细胞的能力，因此可以说，作为自体细胞移植治疗中的细胞来源，人脂肪组织非常有用。在考虑到实际医疗的情况下，从受体采集脂肪组织，与采集骨髓或皮肤比较，可更容易地进行，另外，本研究中采用的建立方法中，是从体积15.4cm3的人脂肪组织采集细胞，进行16天培养，作为间充质细胞，得到1960万个细胞，假定SSEA-3阳性率为5%，则可以推算，由脂肪组织得到的1960万个细胞中，有 98万个细胞是Muse细胞。即使是由较少量的组织也可在短的培养期间内确保细胞数，这在自身细胞移植治疗中非常合乎需要。由人脂肪组织来源的间充质细胞分离的Muse细胞也与人ES细胞或人iPS细胞不同，是机体来源的细胞。因此，无需为了获得多能性而进行基因导入等特别的操作。现在，非常有望解决其它的多能干细胞研究中面临的、基因导入带来的影响或肿瘤化的危险性课题。脂肪组织来源的Muse细胞也不具有肿瘤形成能力，这是从以下事实也可以理解的结果:原本它们就存在于由成体脂肪组织得到的间充质细胞中，人脂肪组织来源的间充质细胞是主要用于进行脂肪组织及其血管系统的周转的细胞供给源 10)。既然已经认识到人脂肪组织很有实用性、前景，那么可以认为，其中存在天然的人多能干细胞Muse细胞这个本研究的成果在再生医疗中非常有意义。
[0146]另外，对于由脐带来源的间充质细胞分离的Muse细胞，可以说亦是如此。
[0147]产业实用性
根据本发明，无需利用生殖细胞或早期胚胎，并且无需经过外源基因的导入或特定化合物的导入等人工诱导操作，就可以由脐带或脂肪组织获得多能干细胞。不经过外源基因的导入等的人工操作，因此可以高效率制备本发明的多能干细胞，在用于治疗时也可以安全使用。本发明的多能干细胞还可用于再生医疗或功能缺陷组织的治疗等，并且也可以用于细胞分化或组织再生的研究等。[0148]本说明书中引用的所有出版物、专利或专利申请可直接作为参考结合到本说明书中。
[0149]序列表自由文本 1-10 引物。
【权利要求】
1.多能干细胞，该多能干细胞可以以SSEA-3的表达为指标由机体的脐带或脂肪组织分离、具有以下的所有性质、为SSEA-3阳性和CD105阳性:(i)端粒酶活性低或没有；(ii)具有分化为三胚层中任意胚层的细胞的能力；(iii)不显示肿瘤性增殖；以及(iv)具有自我复制能力(自我更新能力)。
2.权利要求1的多能干细胞，该多能干细胞可以以SSEA-3的表达为指标由机体的脐带或脂肪组织直接分离。
3.权利要求1或2的多能干细胞，该多能干细胞可由人脂肪来源的干细胞(HADSC)分离。
4.权利要求1-3中任一项的多能干细胞，该多能干细胞是通过将悬浮培养和贴壁培养组合而成的培养进行增殖。
5.权利要求1-4中任一项的多能干细胞，该多能干细胞为⑶117阴性和⑶146阴性。
6.权利要求1-4中任一项的多能干细胞，该多能干细胞为⑶117阴性、⑶146阴性、NG2 阴性、⑶34阴性、vffF阴性和⑶271阴性。
7.权利要求1-4中任一项的多能干细胞，该多能干细胞为⑶34阴性、⑶117阴性、 CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、SoxlO阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrpl阴性和Dct阴性。
8.细胞群，该细胞群含有 权利要求1-7中任一项的多能干细胞。
9.以SSEA-3的表达为指标、由脐带或脂肪组织分离权利要求1-7中任一项的多能干细胞并进行培养、增殖的方法。
10.权利要求9的方法，其中，该方法以以下的(i)-(v)的特性中至少I个特性为指标分离多能干细胞:(i)CD105阳性；(ii)CD117阴性和CD146阴性；(iii)⑶117阴性、⑶146阴性、NG2阴性、⑶34阴性、vWF阴性和⑶271阴性；(iv)CD34阴性、CDl17阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、SoxlO阴性、 Snail阴性、Slug阴性、Tyrpl阴性和Dct阴性；以及(vi)端粒酶活性低或没有。
11.提高权利要求1-7中任一项的多能干细胞的含有率的方法，该方法包含对脐带或脂肪组织来源的间充质细胞进行胰蛋白酶处理，回收存活的细胞。
【文档编号】A61P25/16GK103459590SQ201280017087
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2011年3月30日
【发明者】出泽真理, 吉田正顺 申请人:株式会社克里奥