用于改善重构后纯化的因子viii的稳定性的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。本发明还涉及用于改善静脉内和非静脉内注射后因子VIII的生物利用率的方法。
【专利说明】用于改善重构后纯化的因子Vl I I的稳定性的方法
[0001]本发明涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含Al结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、Cl结构域和C2结构域的第二片段。本发明还涉及用于改善静脉内和非静脉内注射后因子VIII的生物利用率的方法。
【背景技术】
[0002]经典的血友病或血友病A是一种遗传性出血障碍。它因染色体X连锁的凝血因子VIII缺陷所致，并且几乎排他地侵袭男性，发病率为每10，000人在一位和两位个体之间。X-染色体缺陷由本身不是血友病患者的女性携带者传递。血友病A的临床表现是增加的出血倾向性。在引入因子VIII浓缩物治疗之前，患有严重血友病的人的平均寿命短于20年。使用来自血浆的因子VIII的浓缩物已经明显地改善血友病患者的状况，广泛地增加平均寿命，给予大部分患者过上或多或少正常生活的可能性。然而，伴随血浆衍生的浓缩物和它们的使用，存在某些问题，其中最严重的问题是传播病毒。迄今，造成AIDS、乙型肝炎和非甲非乙肝炎的病毒已经严重袭击该群体。从那时起，已经新近开发了不同的病毒灭活方法和新的高度纯化的因子VIII浓缩物，它们还对血浆衍生的因子VIII建立了极高的安全性标准。
[0003]几种重组和血浆衍生的治疗性多肽，例如凝血因子，可商业获得用于人类中的治疗性和预防性使用。FVIII是一种在哺乳动物肝脏中产生的分子量直到约280kDa的血浆糖蛋白。它是导致凝血的凝血反应级联的关键组分。在这个级联内部存在其中因子IXa(FIXa)连同激活的因子VIII (FVIIIa) —起使因子X(FX)转化成激活形式FXa的步骤。FVIIIa在这个步骤充当辅因子，与钙离子和磷脂是最大化FIXa活性所要求的。
[0004]治疗血友病A方面的一项重要进展是分离了编码2，351个氨基酸的人FVIII完整序列的cDNA克隆(美国专利号4，757, 006)和提供人FVIII基因DNA序列及用于其生产的重组方法。
[0005]将因子VIII合成为具有分子量约280kDa的单条多肽链。当因子VIII转运入内质网时，移除氨基端信号肽，并且成熟(即切除信号肽后)天然因子VIII分子随后在其分泌过程中在第1313和1648位氨基酸残基后以蛋白酶解方式被切割。这导致释放异二聚体，所述异二聚体由按金属离子依赖性方式与约160-200kDa N端重链片段缔合的约80kDaC 端轻链组成。(综述见 Kaufman, Transfusion Med.Revs.6:235 (1992)) ?
[0006]通过凝血酶对蛋白质链的蛋白酶切割，该异二聚体的生理激活发生。凝血酶将重链切割成90kDa蛋白质并随后切割成54kDa和44kDa片段。凝血酶还将80kDa轻链切割成72kDa蛋白质。正是后一种蛋白质和由钙离子结合在一起的两个重链片段(上文54kDa和44kDa片段)才构成活性FVIII。当44kDa A2重链片段从该分子解离或当72kDa和54kDa蛋白质由凝血酶、活化的蛋白C或FXa进一步切割时，失活发生。在血浆中，FVIII通过与50倍摩尔过量的VWF蛋白(“VWF”)缔合稳定，所述VWF蛋白似乎抑制蛋白酶解性破坏如上文所述的FVIII。
[0007]FVIII的氨基酸序列组织成三个结构域:330个氨基酸的三重A结构域、980个氨基酸的单个B结构域和150个氨基酸的重复C结构域。B结构域与其他蛋白质没有同源性并且提供这种蛋白质的25个潜在天冬酰胺(N)联糖基化位点中的18个。B结构域在凝血中明显没有功能并且可以缺失，而B-结构域缺失的FVIII分子仍具有促凝血活性。
[0008]市场上的因子VIII产品目前作为因子VIII冻干制剂提供或者通过重组技术产生或从汇集的血浆纯化。冻干产品在施用之前重构。一旦重构，因子VIII的货架期相对短暂。因子VIII是相对不稳定的蛋白质，特别在水溶液中。已经描述在制造和储存期间通过与其他血浆蛋白复合、特别与血管性血友病因子(VWF)和白蛋白复合的稳定化作用见，例如，美国专利号6，228，613。美国专利号5，565，427公开了包含一个氨基酸的因子VIII或其盐或同源物之一及去垢剂或有机聚合物如聚乙二醇的稳定化制剂。美国专利号5，605，884公开了在氯化钙和高浓度氯化钠或氯化钾存在的情况下因子VIII在基于组氨酸缓冲液的高离子强度介质中的稳定化制剂。这类组合物显示显著地改善重构后含水形式的因子VIII的稳定性。通常认可了钙离子在因子VIII制剂中的重要性。根据美国专利号6，599，724，其他二价阳离子即Cu2+和Zn2+的存在，任选地在Ca2+离子或Mn2+离子存在的情况下，改善因子VIII的稳定性。W02011/027152A1还描述了包含各种添加物的稳定的含水因子VIII组合物。
[0009]考虑到冻干物重构后因子VIII的短货架期，需要增加重构的因子VIII在水溶液中稳定性的方法。出于不同原因，提供在液相具有增加的稳定性的纯化FVIII制备物是合乎需要的。首先，优点是在环境温度具有支持在环境温度制造纯化FVIII产物的足够时间跨度。具体而言，填充步骤需要储存某种液体散货以增加制造灵活性。其次，如果产品不能在重构后直接施加，液态的纯化FVIII的稳定性增加将对医师和患者而言是有优势的。并且最终，在连续输注条 件下例如在住院患者中手术时使用FVIII取决于重构后优选高的产物稳定性(Takedani H.，HaemophiIia2010，16:740-746)。具有增加的稳定性的FVIII分子还将有利于开发适于液态条件下长期储存的FVIII制备物。
[0010]本申请的发明人令人惊讶地发现冻干物重构后纯化因子VIII的稳定性在单链因子VIII构建体中实质地增强。这类构建体可以通过阻止蛋白酶剪切获得，所述蛋白酶剪切一般在因子VIII分泌之前出现在高尔基体区室中。单链构建体在纯化后在溶液中显示更好的稳定性/或当皮下施用时显示更好的生物利用率。
[0011]发明简述
[0012]在第一方面，本发明涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含Al结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、Cl结构域和C2结构域的第二片段。
[0013]第一方面涵盖一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含Al结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、Cl结构域和C2结构域的第二片段。
[0014]第一方面进一步涵盖一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在纯化因子VIII分子之前防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含Al结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、Cl结构域和C2结构域的第二片段。
[0015]就本发明的这些方法而言，术语“在制造因子VIII分子期间自始至终”和“在纯化因子VIII分子之前”意指本发明的方法防止将因子VIII切割成基本上包含Al结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、Cl结构域和C2结构域的第二片段，但是本发明的方法不阻止可以在施用重构的因子VIII分子后发生的因子VIII活化切割。通过本发明方法产生的因子VIII分子仍可以由凝血酶活化，所述凝血酶在Arg372、Arg740和Argl689后切割因子VIII分子。
[0016]在第二方面，本发明涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括失活在表达因子VIII分子的宿主细胞分泌所述因子VIII分子期间被切割的蛋白酶剪切位点，例外是信号序列和成熟因子VIII之间的切割位点。一般，至少50%由宿主细胞表达并分泌的因子VIII分子是单链因子VIII分子。优选地，至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%由宿主细胞表达并分泌的因子VIII分子是单链因子VIII分子。[0017]优选地，该方法包括失活Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点并且如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。可以通过缺失蛋白酶识别序列的一个或多个残基实现蛋白酶剪切位点的失活。例如，失活步骤可以包含从因子VIII序列缺失至少Argl648。在一个实施方案中，失活步骤包括从因子VI11序列缺失至少从Argl313至Argl648的氨基酸序列。
[0018]在本发明第一方面的另一个实施方案中，通过置换形成蛋白酶识别序列的一个或多个氨基酸残基实现蛋白酶剪切位点的失活。
[0019]在又一个实施方案中(涉及保留包含Argl313的B-结构域部分的那些FVIII变体)，该方法进一步包括通过缺失或置换形成蛋白酶识别序列的一个或多个残基失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。在一个特别优选的实施方案中，该方法包括缺失来自因子VIII氨基酸序列的在残基Argl313和Argl648后包含两个蛋白酶切割位点的至少部分。
[0020]进一步优选的是，选自因子VIII序列第741至1647位置处氨基酸的第一氨基酸与选自因子VIII序列第1649至1690位置处氨基酸的第二氨基酸融合，因而Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点和如果存在于FVIII分子中，Argl313和Alal314之间的切割位点失活。
[0021]在另一个优选实施方案中，根据本发明第一或第二方面稳定化的因子VIII分子显示在水溶液中增加的稳定性。在水溶液中在25°C储存7日后，修饰的因子VIII分子的活性丧失优选地是小于15%。
[0022]在另一个优选实施方案中，根据本发明第一或第二方面稳定化的因子VIII分子显示重构后在水溶液中增加的稳定性。
[0023]在又一个优选的实施方案中，以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII的生物利用率相比或与其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子相比，根据本发明第一或第二方面稳定化的因子VIII分子显示非静脉内注射后增加的生物利用率。在又一个优选的实施方案中，以相同剂量和以相同方式施用时，与其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的生物利用率相比，根据本发明第一或第二方面稳定化的因子VIII分子显示非静脉内注射后增加的生物利用率。分别以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII的生物利用率或其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的生物利用率相比，修饰的FVIII的生物利用率优选地增加至少25%。在另一个优选实施方案中，非静脉内注射是皮下、经皮或肌内注射。
[0024]另一个优选实施方案是一种方法，其中(i)相对于人野生型因子VIII，该因子VIII显示出静脉内施用后改善的血浆半寿期；优选地其中相对于人野生型因子VIII，血浆半寿期改善至少40%，或(ii)其中相对于人野生型因子VIII，该因子VIII显示静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的更长时间段；优选地其中相对于人野生型因子VIII，这个时间段延长至少10个小时，或(iii)其中相对于已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，因子VIII在已经在37°C于人血浆中温育4日后保留如通过一步FVII1: C测定法所测定的更高活性；优选地其中相对于已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII的活性，保留的因子VIII活性是至少10%更高。
[0025]该方法还可以包括步骤
[0026]⑴提供核酸，所述核酸编码其中Argl648和Glul649之间以及Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点失活的修饰的因子VIII分子，
[0027](ii)用所述核酸转化宿主细胞，
[0028](iii)在如此条件下培养转化的宿主细胞，从而表达修饰的因子VIII分子，并且
[0029](iv)从宿主细胞或从培养基回收修饰的因子VIII分子。
[0030]在另一个方面，本发明涉及一种改善因子VIII分子在非静脉内施用后的生物利用率的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，和如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。优选地，非静脉内注射是皮下注射。分别以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII的生物利用率或其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的生物利用率相比，皮下注射后的生物利用率优选地增加至少25%。
[0031]在另一个方面，本发明涉及一种相对于人野生型因子VIII，改善因子VIII分子在静脉内施用后的血浆半寿期的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点，并且如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。
[0032]在另一个方面，本发明涉及一种相对于人野生型因子VIII，延长静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的时间段的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，和如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。
[0033]在另一个方面，本发明涉及一种相对于已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，保留在已经在37°C于人血浆中温育4日后如通过一步FVII1:C测定法所测定的因子VIII分子更高活性的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点，并且如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。[0034]上文所述方法的一个优选实施方案是这些方法，其中选自因子VIII序列第741至1647位置处氨基酸的第一氨基酸与选自因子VIII序列第1649至1690位置处氨基酸的第二氨基酸融合，因而Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点和如果存在于FVIII分子中，Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点失活。
[0035]已作必要修正的情况下，不同方面的优选实施方案是适用的。
[0036]在又一个方面，本发明涉及一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于通过以下方式治疗或预防出血障碍、优选地血友病A:(i)在一方面，非静脉内施用，其中以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII相比或与其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子相比，所述单链因子VIII分子的生物利用率增加至少25%，或(ii)在另一方面，静脉内施用，其中(a)以相同剂量和以相同方式施用时，相对于人野生型因子VIII，所述单链因子VIII分子在静脉内施用后的血浆半寿期增加至少40%、或(b)以相同剂量和以相同方式施用，相对于人野生型因子VIII，单链因子VIII分子显示出静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的时间段延长至少10小时。
[0037]在又一个方面，本发明涉及一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于治疗或预防出血障碍、优选地血友病A，其中相对于已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，单链因子VIII分子在已经在37°C于人血浆中温育4日后保留如通过一步FVIIIiC测定法所测定的至少10%更高活性。
[0038]在又一个方面，本发明涉及一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于通过非静脉内施用治疗或预防出血障碍、优选地血友病A，其中以相同剂量和以相同方式施用以实现血液中相同的止血 活性时，与其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的剂量相比，所述FVIII分子的剂量可以降低至少25%。
[0039]在另一个方面，本发明涉及单链因子VIII分子用于实现重构后增加的稳定性或用于治疗出血障碍的药物制品的更长货架期的用途，其中(i)在重构并且重构后室温储存7日之后，包含单链因子VIII分子的药物制品的因子VIII活性高于包含相同量其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的药物制品至少10%，或(ii)其中相对于相同浓度的已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，单链因子VIII分子在37°C于人血浆中温育4日时保留如通过一步FVII1: C测定法所测定的至少10%更高活性。
[0040]附图简述
[0041]图1描述实施例1的结果。各种因子VIII分子已经作为水溶液提供，并且已经在
7日时间段范围内监测它们的稳定性。与异二聚(双链)全长因子viii分子(Beriate?:
和Hellxatee:)并与B-结构域缺失的异二聚(双链)构建体(ReFacto?；)相比，对于单链因子VIII分子而言，储存7日后的活性丧失小得多。
[0042]图2描述实施例2的结果。将多种冻干的因子VIII制备物重构成水溶液，并且并且已经在7日时间段范围内监测它们的稳定性。与异二聚(双链)全长因子VIII分子
(Advate。)和B-结构域缺失的异_.聚(双链)构建体(RePacto )相比，对于单链因子VIII分子而言，储存7日后的活性丧失小得多。[0043]图3描述实施例3的结果。三种不同的因子VIII分子已经在小鼠中皮下注射并且已经如实施例2中所述测定它们的生物利用率。单链因子VIII分子的生物利用率实
质地高于双链和全长因子viii (Advatee)或B-结构域缺失的异二聚(双链)构建体(ReFacto?；)。
[0044]图4描述实施例4的结果。将本发明的因子VIII分子和二种商业可获得的FVIII制品在纯化、冻干和重构后在37°C温育。将FVII1-样品在37°C温育不同的时间段(O、0.25、
1、2、4和8日)并且通过一步凝血测定法确定FVII1:C活性。显示的值代表两份样品的均值和标准偏差(例外是0.25日，仅一份样品)。
[0045]图5描述实施例5的部分结果。在以剂量250IU/kg单次静脉内注射至食蟹猴后，确定 scFVIII 和全长rFVIII (AdVilt't1' Baxter Healthcare)的药物代谢动力学(PK)曲线。
[0046]图6描述实施例5的部分结果。在以剂量100IU/kg单次静脉内注射至血友病A小鼠后，确定全长rFVIII(AdYiUe?, Baxter Healthcare)的药物代谢动力学(PK)曲线。
[0047]图7描述实施例6的部分结果。在scFVIII或全长rFVIII ( Advated〗.)，BaxterHealthcare)以剂量250IU/kg施用至血友病A小鼠后确定从第I日-第8日的平均峰凝血酶水平。
[0048]图8描述实施例7的结果。以剂量100IU/kg单次静脉内注射至VWF缺陷小鼠后确定全长rFVIII ( Advate*? Baxter Healthcare)和B-结构域缺失的因子
VIIK RcractOi, Pfizer)的药物代谢动力学(PK)曲线。
[0049]发明详述
[0050]本发明涉及用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含Al结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、Cl结构域和C2结构域的第二片段。
[0051]本发明还涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包含失活Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点和如果存在于因子VIII分子中，任选地失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。
[0052]因子VIII
[0053]术语“凝血因子VIII) ”、“因子VIII”和“FVIII”在本文中互换地使用。成熟人因子VIII由布置在以下结构域结构中的2332个氨基酸组成:
[0054]
【权利要求】
1.一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含Al结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、Cl结构域和C2结构域的第二片段。
2.根据权利要求1所述的方法，包括失活Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点，并且，如果存在于所述FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。
3.根据权利要求2所述的方法，其中失活步骤包括从因子VIII序列缺失至少Argl6480
4.根据权利要求3所述的方法，其中失活步骤包括从因子VIII序列缺失至少从Argl313至Argl648的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中选自因子VIII序列第741至1647位置处氨基酸的第一氨基酸与选自因子VIII序列第1649至1690位置处氨基酸的第二氨基酸融合，因而Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点失活，并且，如果存在于所述FVIII分子中，Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点失活。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中将缺失的氨基酸替换为具有I至50个氨基酸长度的肽间隔序列。
7.根据权利要求2所述的方法，其中失活步骤包括将Argl648和如果存在于因子VIII分子中的Argl313置换为不同的氨基酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在水溶液中重构并在25°C储存7日后，所述因子VIII分子的活性丧失小于15%。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中在水溶液中重构后，所述因子VIII的体外稳定性因所述切割位点的失活而增加。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中以相同剂量和以相同方式施用时，相对于人野生型因子VIII或相对于其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的人因子VIII分子，所述因子VIII显示出非静脉内注射后改善的生物利用率；优选地其中以相同剂量和以相同方式施用时，相对于人野生型因子VIII或相对于其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的人因子VIII分子，非静脉内注射后的生物利用率增加至少25%。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述非静脉内注射是皮下、经皮或肌内注射。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中 (i)相对于人野生型因子VIII，所述因子VIII显示出静脉内施用后改善的血浆半寿期；优选地其中相对于人野生型因子VIII，血浆半寿期改善至少40%， 或 (ii)其中相对于人野生型因子VIII，所述因子VIII显示静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的更长时间段；优选地其中相对于人野生型因子VIII，这个时间段延长至少10个小时， 或 (iii)其中相对于已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，所述因子VIII在已经在370C于人血浆中温育4日后保留如通过一步FVII1: C测定法所测定的更高活性；优选地其中相对于已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII的活性，所述因子VIII所保留的活性是至少10%更高。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括步骤 (i)提供核酸，所述核酸编码其中使Argl648和Glul649之间以及Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点失活的修饰的因子VIII分子， (ii)用所述核酸转化宿主细胞， (iii)在如此条件下培养转化的宿主细胞，从而表达修饰的因子VIII分子，并且 (iv)从宿主细胞或从细胞培养基回收修饰的因子VIII分子。
14.一种相对于人野生型因子VIII或相对于其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子,改善因子VIII分子在非静脉内施用后的生物利用率的方法,包括失活Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点，和如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述非静脉内施用是皮下、经皮或肌内注射。
16.一种相对于人野生型因子VIII，改善因子VIII分子在静脉内施用后的血浆半寿期的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点，并且，如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。
17.一种相对于人野生型因子VIII，延长静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的时间段的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点，并且，如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。
18.一种相对于已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，保留在已经在37°C于人血浆中温育4日后如通过一步FVIII = C测定法所测定的因子VIII分子更高活性的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点，并且，如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点。
19.根据权利要求14至18所述的方法，其中选自因子VIII序列第741至1647位置处氨基酸的第一氨基酸与选自因子VIII序列第1649至1690位置处氨基酸的第二氨基酸融合，因而Argl648和Glul649之间的蛋白酶剪切位点失活，并且，如果存在于FVIII分子中，Argl313和Alal314之间的蛋白酶剪切位点失活。
20.一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于通过以下方式治疗或预防出血障碍、优选地血友病A， (i)非静脉内施用，其中 以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII相比或与其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的人因子VIII分子相比，所述单链因子VIII分子的生物利用率增加至少25%， 或 (ii)静脉内施用，其中 (a)以相同剂量和以相同方式施用时，相对于人野生型因子VIII，所述单链因子VIII分子在静脉内施用后的血浆半寿期增加至少40%， 或 (b)以相同剂量和以相同方式施用，相对于人野生型因子VIII，单链因子VIII分子显示出静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的时间段延长至少10小时。
21.一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于治疗或预防出血障碍、优选地血友病A，其中相对于已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，单链因子VIII分子在已经在37°C于人血浆中温育4日后保留如通过一步FVII1:C测定法所测定的至少10%更高活性。
22.一种包含单链因子VIII分子的药物溶液，用于通过非静脉内施用治疗或预防出血障碍、优选地血友病A，其中以相同剂量和以相同方式施用以实现血液中相同的止血活性时，与其中Asn745与Pro 1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的剂量相比，所述FVIII分子的剂量可以降低至少25%。
23.单链因子VIII分子用于实现重构后增加的稳定性或用于治疗出血障碍的药物制品的更长货架期的用途，其中 (i)在重构并且重构后室温储存7日之后，包含单链因子VIII分子的药物制品的因子VIII活性高于包含相同量其中Asn745与Prol640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的药物制品至少10%，或 (ii)其中相对于相同浓度的已经在37°C于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，单链因子VIII分子在37°C于人血浆中温育4日时保留如通过一步FVIII = C测定法所测定的至少10%更高活性。
【文档编号】A61K38/37GK103917554SQ201280051574
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年10月18日 优先权日:2011年10月18日
【发明者】C·霍恩, S·措尔纳, H·梅茨纳, S·舒尔特 申请人:Csl有限公司